HPLC—RID法測(cè)定長(zhǎng)柄側(cè)耳發(fā)酵產(chǎn)物中甘露醇的含量

鄧西貝等

摘 要：目的：建立長(zhǎng)柄側(cè)耳發(fā)酵物中甘露醇含量的測(cè)定方法。方法：采用HPLC-RID法，SUGAR SC1011柱（300mm×8mm），超純水洗脫，流速0.5mL/min，柱溫70℃，示差折光檢測(cè)器檢測(cè)。結(jié)果：甘露醇進(jìn)樣量在6.26～18.78μg之間與峰面積呈良好的線性關(guān)系，回歸方程Y=16708X-2601（r=0.9999）；平均加樣回收率為97.83%，RSD為0.62%。結(jié)論：本方法樣品前處理簡(jiǎn)單，具有較高的專屬性、準(zhǔn)確性、重現(xiàn)性和可行性，可作為長(zhǎng)柄側(cè)耳發(fā)酵產(chǎn)物中甘露醇含量質(zhì)量控制的定量方法。

關(guān)鍵詞：長(zhǎng)柄側(cè)耳菌絲；甘露醇；HPLC

現(xiàn)代研究表明側(cè)耳屬真菌營(yíng)養(yǎng)豐富，富含多糖、蛋白質(zhì)、氨基酸、以及各種微量元素[1]。但對(duì)側(cè)耳屬真菌中甘露醇含量的研究并不多見。采用高效液相色譜法，利用示差折光檢測(cè)器，測(cè)定長(zhǎng)柄側(cè)耳發(fā)酵產(chǎn)物中甘露醇的含量，為深入研究長(zhǎng)柄側(cè)耳發(fā)酵產(chǎn)物奠定基礎(chǔ)，也為長(zhǎng)柄側(cè)耳質(zhì)量評(píng)價(jià)提供依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料與儀器

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

甘露醇標(biāo)準(zhǔn)品（批號(hào)；100533-200301 中國(guó)藥品生物制品檢定所）；水（超純水）；其他試劑均為分析純；長(zhǎng)柄側(cè)耳發(fā)干燥酵液和菌絲（實(shí)驗(yàn)室自制）。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

高效液相色譜儀（島津LC-20AT）；示差折光檢測(cè)器（RID-10A）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 樣品的制備

（1）對(duì)照品溶液的制備。準(zhǔn)確量取甘露醇標(biāo)準(zhǔn)品3mg，置于2ml容量瓶中，加入超純水使其溶解完全，定容至刻度，即得（1.565mg/mL）。（2）供試品溶液的制備。準(zhǔn)確量取干燥長(zhǎng)柄側(cè)耳發(fā)酵液、菌絲各1g，分別加入50mL超純水，準(zhǔn)確稱重，超聲提取30min，冷卻至室溫后再次稱重，加超純水補(bǔ)足減失重量，混勻，以2000r/min離心10min，上清液通過0.45μm濾膜過濾，即得供試品溶液。

2.2 色譜條件

色譜柱為SUGAR SC1011柱（300mm×8mm，6μm），流動(dòng)相為超純水，流速為0.5ml/min，柱溫70℃，進(jìn)樣量10μL。色譜詳見圖1，圖2。

3 方法學(xué)考察

3.1 線性關(guān)系考察

分別精密吸取甘露醇標(biāo)準(zhǔn)品溶液 4、6、8、10、12μL，注入液相色譜儀，測(cè)定吸收峰面積，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果見表1。

以甘露醇質(zhì)量為橫坐標(biāo)，色譜峰面積為縱坐標(biāo)，計(jì)算回歸方程為：Y=16708X-2601，r=0.9999，甘露醇在6.26～18.78μg范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系。結(jié)果見圖3。

3.2 精密度試驗(yàn)

精密吸取甘露醇標(biāo)準(zhǔn)品溶液10μL，注入高效液相色譜儀，重復(fù)進(jìn)樣6次，依法測(cè)定，結(jié)果見下表2。

以峰面積計(jì)算其精密度，X=256325.7，RSD為0.22%，表明儀器精密度良好。

3.3 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取長(zhǎng)柄側(cè)耳菌絲供試品溶液，分別于0、4、8、16、20、24 h注入液相色譜儀，進(jìn)樣量為10μL，記錄峰面積積分值，結(jié)果見表3。

以峰面積計(jì)算其穩(wěn)定性，X=為207550.3，RSD為1.20%，表明樣品在24h內(nèi)穩(wěn)定。

3.4 重復(fù)性試驗(yàn)

準(zhǔn)確稱取同一批長(zhǎng)柄側(cè)耳菌絲6份，按“1.2.1.2”供試品制備方法制備，按上述色譜條件分別進(jìn)樣10μL，測(cè)定樣品中甘露醇含量，結(jié)果見表4。

3.5 加樣回收率實(shí)驗(yàn)

準(zhǔn)確稱取已知甘露醇含量的長(zhǎng)柄側(cè)耳菌絲供試品6份，分別精密加入甘露醇標(biāo)準(zhǔn)品，按供試品方法制備樣品，按照含量測(cè)定項(xiàng)下操作，分別計(jì)算回收率。結(jié)果見表5。

本方法甘露醇平均加樣回收率為97.83%，RSD值為0.62%，說明此方法穩(wěn)定可靠，準(zhǔn)確性高。

4 樣品含量測(cè)定

取供試品溶液，按“2.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算樣品中甘露醇的含量，結(jié)果顯示，長(zhǎng)柄側(cè)耳菌絲中甘露醇含量為4.97%，發(fā)酵液中不含有甘露醇。此方法穩(wěn)定可靠，準(zhǔn)確性高，操作簡(jiǎn)單，可考慮作為長(zhǎng)柄側(cè)耳質(zhì)量評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)中的一項(xiàng)，為長(zhǎng)柄側(cè)耳在甘露醇方向的研究奠定基礎(chǔ)。

5 結(jié)束語

甘露醇是一種常見的利尿劑，經(jīng)常被用于治療顱內(nèi)壓升高、眼壓升高，還能夠預(yù)防急性腎衰，并加速體內(nèi)毒物或藥物從腎臟排出，在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用空間[2]。隨著科學(xué)技術(shù)的進(jìn)步，對(duì)甘露醇作用機(jī)理的研究不斷深入，傳統(tǒng)測(cè)定甘露醇的方法有容量法和比色法，這兩種方法操作復(fù)雜，且容易受到干擾[3]。選擇高效液相色譜法測(cè)定甘露醇含量，由方法學(xué)考察結(jié)果可知，此方法操作簡(jiǎn)便，穩(wěn)定性高，重現(xiàn)性好，結(jié)果準(zhǔn)確?？煽紤]將甘露醇含量作為長(zhǎng)柄側(cè)耳質(zhì)量評(píng)價(jià)的一項(xiàng)。

參考文獻(xiàn)

[1]高明燕，羅霞，等.側(cè)耳屬真菌的營(yíng)養(yǎng)成分及藥理作用研究進(jìn)展[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010，38（29）：16206-16207.

[2]蔡友華，范文霞，等.超聲-微波協(xié)同萃取巴西蟲草菌絲體中甘露醇的研究[J].江西農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2008，30（4）：348-353.

[3]田貞樂，徐春花.HPLC-RID法測(cè)定蟲草菌絲體中甘露醇[J].食用菌學(xué)報(bào)，2010，增刊：113-115.

摘 要：目的：建立長(zhǎng)柄側(cè)耳發(fā)酵物中甘露醇含量的測(cè)定方法。方法：采用HPLC-RID法，SUGAR SC1011柱（300mm×8mm），超純水洗脫，流速0.5mL/min，柱溫70℃，示差折光檢測(cè)器檢測(cè)。結(jié)果：甘露醇進(jìn)樣量在6.26～18.78μg之間與峰面積呈良好的線性關(guān)系，回歸方程Y=16708X-2601（r=0.9999）；平均加樣回收率為97.83%，RSD為0.62%。結(jié)論：本方法樣品前處理簡(jiǎn)單，具有較高的專屬性、準(zhǔn)確性、重現(xiàn)性和可行性，可作為長(zhǎng)柄側(cè)耳發(fā)酵產(chǎn)物中甘露醇含量質(zhì)量控制的定量方法。

關(guān)鍵詞：長(zhǎng)柄側(cè)耳菌絲；甘露醇；HPLC

現(xiàn)代研究表明側(cè)耳屬真菌營(yíng)養(yǎng)豐富，富含多糖、蛋白質(zhì)、氨基酸、以及各種微量元素[1]。但對(duì)側(cè)耳屬真菌中甘露醇含量的研究并不多見。采用高效液相色譜法，利用示差折光檢測(cè)器，測(cè)定長(zhǎng)柄側(cè)耳發(fā)酵產(chǎn)物中甘露醇的含量，為深入研究長(zhǎng)柄側(cè)耳發(fā)酵產(chǎn)物奠定基礎(chǔ)，也為長(zhǎng)柄側(cè)耳質(zhì)量評(píng)價(jià)提供依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料與儀器

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

甘露醇標(biāo)準(zhǔn)品（批號(hào)；100533-200301 中國(guó)藥品生物制品檢定所）；水（超純水）；其他試劑均為分析純；長(zhǎng)柄側(cè)耳發(fā)干燥酵液和菌絲（實(shí)驗(yàn)室自制）。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

高效液相色譜儀（島津LC-20AT）；示差折光檢測(cè)器（RID-10A）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 樣品的制備

（1）對(duì)照品溶液的制備。準(zhǔn)確量取甘露醇標(biāo)準(zhǔn)品3mg，置于2ml容量瓶中，加入超純水使其溶解完全，定容至刻度，即得（1.565mg/mL）。（2）供試品溶液的制備。準(zhǔn)確量取干燥長(zhǎng)柄側(cè)耳發(fā)酵液、菌絲各1g，分別加入50mL超純水，準(zhǔn)確稱重，超聲提取30min，冷卻至室溫后再次稱重，加超純水補(bǔ)足減失重量，混勻，以2000r/min離心10min，上清液通過0.45μm濾膜過濾，即得供試品溶液。

2.2 色譜條件

色譜柱為SUGAR SC1011柱（300mm×8mm，6μm），流動(dòng)相為超純水，流速為0.5ml/min，柱溫70℃，進(jìn)樣量10μL。色譜詳見圖1，圖2。

3 方法學(xué)考察

3.1 線性關(guān)系考察

分別精密吸取甘露醇標(biāo)準(zhǔn)品溶液 4、6、8、10、12μL，注入液相色譜儀，測(cè)定吸收峰面積，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果見表1。

以甘露醇質(zhì)量為橫坐標(biāo)，色譜峰面積為縱坐標(biāo)，計(jì)算回歸方程為：Y=16708X-2601，r=0.9999，甘露醇在6.26～18.78μg范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系。結(jié)果見圖3。

3.2 精密度試驗(yàn)

精密吸取甘露醇標(biāo)準(zhǔn)品溶液10μL，注入高效液相色譜儀，重復(fù)進(jìn)樣6次，依法測(cè)定，結(jié)果見下表2。

以峰面積計(jì)算其精密度，X=256325.7，RSD為0.22%，表明儀器精密度良好。

3.3 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取長(zhǎng)柄側(cè)耳菌絲供試品溶液，分別于0、4、8、16、20、24 h注入液相色譜儀，進(jìn)樣量為10μL，記錄峰面積積分值，結(jié)果見表3。

以峰面積計(jì)算其穩(wěn)定性，X=為207550.3，RSD為1.20%，表明樣品在24h內(nèi)穩(wěn)定。

3.4 重復(fù)性試驗(yàn)

準(zhǔn)確稱取同一批長(zhǎng)柄側(cè)耳菌絲6份，按“1.2.1.2”供試品制備方法制備，按上述色譜條件分別進(jìn)樣10μL，測(cè)定樣品中甘露醇含量，結(jié)果見表4。

3.5 加樣回收率實(shí)驗(yàn)

準(zhǔn)確稱取已知甘露醇含量的長(zhǎng)柄側(cè)耳菌絲供試品6份，分別精密加入甘露醇標(biāo)準(zhǔn)品，按供試品方法制備樣品，按照含量測(cè)定項(xiàng)下操作，分別計(jì)算回收率。結(jié)果見表5。

本方法甘露醇平均加樣回收率為97.83%，RSD值為0.62%，說明此方法穩(wěn)定可靠，準(zhǔn)確性高。

4 樣品含量測(cè)定

取供試品溶液，按“2.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算樣品中甘露醇的含量，結(jié)果顯示，長(zhǎng)柄側(cè)耳菌絲中甘露醇含量為4.97%，發(fā)酵液中不含有甘露醇。此方法穩(wěn)定可靠，準(zhǔn)確性高，操作簡(jiǎn)單，可考慮作為長(zhǎng)柄側(cè)耳質(zhì)量評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)中的一項(xiàng)，為長(zhǎng)柄側(cè)耳在甘露醇方向的研究奠定基礎(chǔ)。

5 結(jié)束語

甘露醇是一種常見的利尿劑，經(jīng)常被用于治療顱內(nèi)壓升高、眼壓升高，還能夠預(yù)防急性腎衰，并加速體內(nèi)毒物或藥物從腎臟排出，在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用空間[2]。隨著科學(xué)技術(shù)的進(jìn)步，對(duì)甘露醇作用機(jī)理的研究不斷深入，傳統(tǒng)測(cè)定甘露醇的方法有容量法和比色法，這兩種方法操作復(fù)雜，且容易受到干擾[3]。選擇高效液相色譜法測(cè)定甘露醇含量，由方法學(xué)考察結(jié)果可知，此方法操作簡(jiǎn)便，穩(wěn)定性高，重現(xiàn)性好，結(jié)果準(zhǔn)確?？煽紤]將甘露醇含量作為長(zhǎng)柄側(cè)耳質(zhì)量評(píng)價(jià)的一項(xiàng)。

參考文獻(xiàn)

[1]高明燕，羅霞，等.側(cè)耳屬真菌的營(yíng)養(yǎng)成分及藥理作用研究進(jìn)展[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010，38（29）：16206-16207.

[2]蔡友華，范文霞，等.超聲-微波協(xié)同萃取巴西蟲草菌絲體中甘露醇的研究[J].江西農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2008，30（4）：348-353.

[3]田貞樂，徐春花.HPLC-RID法測(cè)定蟲草菌絲體中甘露醇[J].食用菌學(xué)報(bào)，2010，增刊：113-115.

摘 要：目的：建立長(zhǎng)柄側(cè)耳發(fā)酵物中甘露醇含量的測(cè)定方法。方法：采用HPLC-RID法，SUGAR SC1011柱（300mm×8mm），超純水洗脫，流速0.5mL/min，柱溫70℃，示差折光檢測(cè)器檢測(cè)。結(jié)果：甘露醇進(jìn)樣量在6.26～18.78μg之間與峰面積呈良好的線性關(guān)系，回歸方程Y=16708X-2601（r=0.9999）；平均加樣回收率為97.83%，RSD為0.62%。結(jié)論：本方法樣品前處理簡(jiǎn)單，具有較高的專屬性、準(zhǔn)確性、重現(xiàn)性和可行性，可作為長(zhǎng)柄側(cè)耳發(fā)酵產(chǎn)物中甘露醇含量質(zhì)量控制的定量方法。

關(guān)鍵詞：長(zhǎng)柄側(cè)耳菌絲；甘露醇；HPLC

現(xiàn)代研究表明側(cè)耳屬真菌營(yíng)養(yǎng)豐富，富含多糖、蛋白質(zhì)、氨基酸、以及各種微量元素[1]。但對(duì)側(cè)耳屬真菌中甘露醇含量的研究并不多見。采用高效液相色譜法，利用示差折光檢測(cè)器，測(cè)定長(zhǎng)柄側(cè)耳發(fā)酵產(chǎn)物中甘露醇的含量，為深入研究長(zhǎng)柄側(cè)耳發(fā)酵產(chǎn)物奠定基礎(chǔ)，也為長(zhǎng)柄側(cè)耳質(zhì)量評(píng)價(jià)提供依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料與儀器

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

甘露醇標(biāo)準(zhǔn)品（批號(hào)；100533-200301 中國(guó)藥品生物制品檢定所）；水（超純水）；其他試劑均為分析純；長(zhǎng)柄側(cè)耳發(fā)干燥酵液和菌絲（實(shí)驗(yàn)室自制）。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

高效液相色譜儀（島津LC-20AT）；示差折光檢測(cè)器（RID-10A）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 樣品的制備

（1）對(duì)照品溶液的制備。準(zhǔn)確量取甘露醇標(biāo)準(zhǔn)品3mg，置于2ml容量瓶中，加入超純水使其溶解完全，定容至刻度，即得（1.565mg/mL）。（2）供試品溶液的制備。準(zhǔn)確量取干燥長(zhǎng)柄側(cè)耳發(fā)酵液、菌絲各1g，分別加入50mL超純水，準(zhǔn)確稱重，超聲提取30min，冷卻至室溫后再次稱重，加超純水補(bǔ)足減失重量，混勻，以2000r/min離心10min，上清液通過0.45μm濾膜過濾，即得供試品溶液。

2.2 色譜條件

色譜柱為SUGAR SC1011柱（300mm×8mm，6μm），流動(dòng)相為超純水，流速為0.5ml/min，柱溫70℃，進(jìn)樣量10μL。色譜詳見圖1，圖2。

3 方法學(xué)考察

3.1 線性關(guān)系考察

分別精密吸取甘露醇標(biāo)準(zhǔn)品溶液 4、6、8、10、12μL，注入液相色譜儀，測(cè)定吸收峰面積，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果見表1。

以甘露醇質(zhì)量為橫坐標(biāo)，色譜峰面積為縱坐標(biāo)，計(jì)算回歸方程為：Y=16708X-2601，r=0.9999，甘露醇在6.26～18.78μg范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系。結(jié)果見圖3。

3.2 精密度試驗(yàn)

精密吸取甘露醇標(biāo)準(zhǔn)品溶液10μL，注入高效液相色譜儀，重復(fù)進(jìn)樣6次，依法測(cè)定，結(jié)果見下表2。

以峰面積計(jì)算其精密度，X=256325.7，RSD為0.22%，表明儀器精密度良好。

3.3 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取長(zhǎng)柄側(cè)耳菌絲供試品溶液，分別于0、4、8、16、20、24 h注入液相色譜儀，進(jìn)樣量為10μL，記錄峰面積積分值，結(jié)果見表3。

以峰面積計(jì)算其穩(wěn)定性，X=為207550.3，RSD為1.20%，表明樣品在24h內(nèi)穩(wěn)定。

3.4 重復(fù)性試驗(yàn)

準(zhǔn)確稱取同一批長(zhǎng)柄側(cè)耳菌絲6份，按“1.2.1.2”供試品制備方法制備，按上述色譜條件分別進(jìn)樣10μL，測(cè)定樣品中甘露醇含量，結(jié)果見表4。

3.5 加樣回收率實(shí)驗(yàn)

準(zhǔn)確稱取已知甘露醇含量的長(zhǎng)柄側(cè)耳菌絲供試品6份，分別精密加入甘露醇標(biāo)準(zhǔn)品，按供試品方法制備樣品，按照含量測(cè)定項(xiàng)下操作，分別計(jì)算回收率。結(jié)果見表5。

本方法甘露醇平均加樣回收率為97.83%，RSD值為0.62%，說明此方法穩(wěn)定可靠，準(zhǔn)確性高。

4 樣品含量測(cè)定

取供試品溶液，按“2.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算樣品中甘露醇的含量，結(jié)果顯示，長(zhǎng)柄側(cè)耳菌絲中甘露醇含量為4.97%，發(fā)酵液中不含有甘露醇。此方法穩(wěn)定可靠，準(zhǔn)確性高，操作簡(jiǎn)單，可考慮作為長(zhǎng)柄側(cè)耳質(zhì)量評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)中的一項(xiàng)，為長(zhǎng)柄側(cè)耳在甘露醇方向的研究奠定基礎(chǔ)。

5 結(jié)束語

甘露醇是一種常見的利尿劑，經(jīng)常被用于治療顱內(nèi)壓升高、眼壓升高，還能夠預(yù)防急性腎衰，并加速體內(nèi)毒物或藥物從腎臟排出，在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用空間[2]。隨著科學(xué)技術(shù)的進(jìn)步，對(duì)甘露醇作用機(jī)理的研究不斷深入，傳統(tǒng)測(cè)定甘露醇的方法有容量法和比色法，這兩種方法操作復(fù)雜，且容易受到干擾[3]。選擇高效液相色譜法測(cè)定甘露醇含量，由方法學(xué)考察結(jié)果可知，此方法操作簡(jiǎn)便，穩(wěn)定性高，重現(xiàn)性好，結(jié)果準(zhǔn)確。可考慮將甘露醇含量作為長(zhǎng)柄側(cè)耳質(zhì)量評(píng)價(jià)的一項(xiàng)。

參考文獻(xiàn)

[1]高明燕，羅霞，等.側(cè)耳屬真菌的營(yíng)養(yǎng)成分及藥理作用研究進(jìn)展[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010，38（29）：16206-16207.

[2]蔡友華，范文霞，等.超聲-微波協(xié)同萃取巴西蟲草菌絲體中甘露醇的研究[J].江西農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2008，30（4）：348-353.

[3]田貞樂，徐春花.HPLC-RID法測(cè)定蟲草菌絲體中甘露醇[J].食用菌學(xué)報(bào)，2010，增刊：113-115.