塔里木胡楊林可培養(yǎng)胡楊內(nèi)生細(xì)菌多樣性與群落結(jié)構(gòu)的時(shí)空演變格局

吾爾麥提汗·麥麥提明，卡依爾·玉素甫，熱孜亞·艾肯，布阿依夏姆·阿木提，努麗曼姑·司馬義，買(mǎi)孜拉木·肉扎洪，麥合甫再木·阿布都熱合曼，馬相汝，艾爾肯·熱合曼

(新疆大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，烏魯木齊 830046)

塔里木胡楊林可培養(yǎng)胡楊內(nèi)生細(xì)菌多樣性與群落結(jié)構(gòu)的時(shí)空演變格局

吾爾麥提汗·麥麥提明，卡依爾·玉素甫，熱孜亞·艾肯，布阿依夏姆·阿木提，努麗曼姑·司馬義，買(mǎi)孜拉木·肉扎洪，麥合甫再木·阿布都熱合曼，馬相汝，艾爾肯·熱合曼*

(新疆大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，烏魯木齊 830046)

闡明塔河，Kiyik河，Ugan河這3條河胡楊內(nèi)生細(xì)菌多樣性及群落結(jié)構(gòu)時(shí)空演變格局。2011年5月上旬與9月下旬從Kiyik，Ugan古河道和塔河主河道的6個(gè)采樣位點(diǎn)采集24棵樹(shù)的胡楊莖稈內(nèi)存液樣，用4種培養(yǎng)基分離純化了588株胡楊內(nèi)生細(xì)菌。16S rDNA序列分析表明，588株細(xì)菌分別屬于6大類(lèi)群：γ-變形菌綱(50.17%)，厚壁菌門(mén)(34.58%)，放線菌門(mén)(10.17%),α-變形菌綱(4.24%)，擬桿菌門(mén)(0.50%)，β-變形菌綱(0.34%)，47個(gè)屬，114種。其中有211株菌的16S rDNA相似率<98.0%，它們分別屬于19個(gè)屬的41個(gè)物種，是胡楊林本源的潛在新菌種。假單胞菌屬(29.76%)和芽孢桿菌屬(19.05%)為優(yōu)勢(shì)屬。與Pseudomonasxinjiangensis相聚類(lèi)的潛在新種(74株，12.585%)是本源優(yōu)勢(shì)菌種。辛普森多樣性指數(shù)顯示，Kiyik河多樣性指數(shù)為0.931，塔河為0.935；Ugan河最高，為0.969。香農(nóng)-威納均勻度指數(shù)表明， Ugan河的分布最均勻，均勻度指數(shù)為0.8570；塔河次之，為0.8314；Kiyik河最低，為0.7937。時(shí)空變化對(duì)比分析表明：整體上塔里木胡楊林內(nèi)生菌群落結(jié)構(gòu)的原生態(tài)狀態(tài)保持較好，較少地遭受到外來(lái)優(yōu)勢(shì)菌群的侵染。其中，Kiyik古河道的內(nèi)生菌群落結(jié)構(gòu)保持原生態(tài)最好，很少受外來(lái)菌群的清洗與取代；Ugan河次之，內(nèi)生菌群落結(jié)構(gòu)發(fā)生了一定程度的變遷；塔河主河道細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)發(fā)生了較大程度的改變，被人類(lèi)活動(dòng)帶來(lái)的外來(lái)常見(jiàn)優(yōu)勢(shì)菌群生態(tài)沖刷的趨勢(shì)明顯。

塔河；Kiyik河；Ugan河；胡楊；可培養(yǎng)內(nèi)生細(xì)菌；16S rDNA；細(xì)菌多樣性；時(shí)空演變分析

植物內(nèi)生菌是棲居在陸地和水生植物相關(guān)組織內(nèi)，生活史的一部分或其整個(gè)生活史在健康植物組織內(nèi)部腐生、寄生和共生，而對(duì)植物不造成實(shí)質(zhì)性危害的一組微生物[1- 3]。研究發(fā)現(xiàn)植物內(nèi)生菌廣泛存在，地球上300 000 種植物中都有內(nèi)生菌的存在[4]。在目前研究過(guò)的所有植物中均發(fā)現(xiàn)有內(nèi)生菌，它們可存在于植物的根、莖、葉、花、果實(shí)等各個(gè)部位[5- 7]。

胡楊(PopuluseuphraticaOliv) 分類(lèi)學(xué)上屬于楊柳科楊屬，落葉喬木，生長(zhǎng)在中緯度的干旱荒漠地區(qū)，具有抗寒、抗熱、抗干旱、抗風(fēng)沙、耐鹽堿等優(yōu)良性狀，是新疆荒漠中分布最廣的落葉樹(shù)種，也是特有的荒漠森林樹(shù)種[8]。塔里木河流域分布著全世界最大的一片天然胡楊林，其面積近30萬(wàn)hm2[9]，它約占全國(guó)胡楊林總面積的90%和全世界胡楊林總面積的55% 以上[10- 11]，是極其珍貴的自然資源。

對(duì)于胡楊有關(guān)的微生物多樣性的研究，國(guó)內(nèi)文獻(xiàn)中袁秀英等[12]人對(duì)內(nèi)蒙古的胡楊根際真菌和內(nèi)生真菌；孜來(lái)古麗，王寧，瑪麗艷木，祖母拉提，瑪麗怕等人對(duì)塔河，沙雅縣，Kiyik河和Ugan河等地區(qū)的胡楊林土壤微生物多樣性和內(nèi)生真菌多樣性狀況進(jìn)行過(guò)報(bào)道[13- 21]。但是在國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)中，除了本實(shí)驗(yàn)室的卡依爾·玉素甫等人[22]2011年對(duì)Ugan河胡楊可培養(yǎng)內(nèi)生細(xì)菌進(jìn)行初步多樣性分析(從胡楊內(nèi)存液中共分離了62株可培養(yǎng)胡楊內(nèi)生細(xì)菌，分別屬于細(xì)菌四大類(lèi)群，18個(gè)屬，32 個(gè)種)以外，針對(duì)塔里木胡楊林的胡楊內(nèi)生細(xì)菌資源尚未見(jiàn)系統(tǒng)地進(jìn)行分離和用現(xiàn)代細(xì)菌分類(lèi)學(xué)方法進(jìn)行研究的報(bào)道。因此，對(duì)塔里木河中下游的胡楊內(nèi)生細(xì)菌進(jìn)行分離鑒定，系統(tǒng)發(fā)育分析，不僅可以搞清塔里木胡楊林的胡楊內(nèi)生細(xì)菌的群落結(jié)構(gòu)，分離拯救一批不可多得的珍稀菌種和本源土著菌種，還可以為將來(lái)的科學(xué)研究和在工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)應(yīng)用提供菌種資源和數(shù)據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 研究區(qū)自然概況

塔里木盆地特有暖溫帶極端干旱的大陸性氣候，光熱資源豐富，降水稀少，年均降水量為17.4—42mm，而年蒸發(fā)量卻高達(dá)1890.1—3229.3mm，該地的胡楊林主要分布海拔高度約為700—1500m塔里木河及其廢棄古河道兩岸泛洪區(qū)的狹長(zhǎng)帶區(qū)。在現(xiàn)在的塔河中游(沙雅縣至尉犁縣)主河道的南面，塔克拉瑪干沙漠的北部邊緣荒漠區(qū)，遺留著歷史上由于塔河改道而干枯的6條較大的廢棄古河道遺跡，其中分布在最南部廢棄年代最久遠(yuǎn)的2條河道上只剩下胡楊的殘樁斷枝，已沒(méi)有活體胡楊的分布以外，其余的4條廢棄河道沿岸，不同程度的分布著依靠地下水維系生命的衰敗狀態(tài)的胡楊林。其中Kiyik(斷流廢棄344a)河道和Ugan廢棄古河道(斷流廢棄126a)沿岸胡楊分布密度較高，利用地下水無(wú)性繁殖的萌生林木的生長(zhǎng)狀況略好于其它廢棄古河道。這兩條河與當(dāng)今塔河河道距離較遠(yuǎn)，斷流年代比較久遠(yuǎn)，脫離了塔河水系。因此，分布在塔河、Kiyik河和Ugan河流域的胡楊林之間早已失去利用洪水散播種子的自然條件，喪失通過(guò)互換種子來(lái)維系相互之間的基因流暢通及借此傳播內(nèi)生菌的機(jī)制，形成了在時(shí)間和空間上相對(duì)隔離封閉的3個(gè)生態(tài)體系。

1.1.2 樣品的采集

本研究分別于2011年5月上旬和2011年9月下旬從尉犁縣現(xiàn)行塔河主河道南面的Ugan河兩岸生長(zhǎng)多年的胡楊林(N 41° 00′397″ E 85° 04′241″，N 41° 00′032″ E 85° 02′501″)，尉犁縣現(xiàn)行塔河主河道南面的Kiyik古河道胡楊林(N40°42′8″ E 85°23′22″,N40°43′22″ E 85°19′18″)和現(xiàn)行塔河主河道(N40°58′21″ E85°29′26″，N41°10′04″ E84°13′52″)各選取兩個(gè)位點(diǎn)(2樣點(diǎn)之間的直線空間距離保持在10 km以上)，每個(gè)樣點(diǎn)選取4棵胡楊(每一個(gè)樣點(diǎn)內(nèi)2棵取樣樹(shù)之間的直線空間距離保持在500 m以上)，共24顆胡楊樹(shù)作為采樣目標(biāo)(圖1)，按卡依爾·玉素甫等人[22]的方法用無(wú)菌的年輪鉆在胡楊樹(shù)干離地高度1.60 m處鉆孔，以滅菌的離心管收集樹(shù)干內(nèi)存液，置于4 ℃即刻返回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行涂布與分離菌株。

圖1 塔里木胡楊林采樣點(diǎn)示意圖Fig.1 Six sampling sites at the three rivers in southern Xinjiang, China

1.1.3 主要試劑和儀器

Taq DNA聚合酶購(gòu)自天根生物技術(shù)有限責(zé)任公司;引物由北京鼎國(guó)生物技術(shù)有限責(zé)任公司合成; PCR儀為ALD.244型，購(gòu)自BIORAD公司;凝膠成像分析儀ALPHAIMAGERTM2200及成像軟件AlphaEase 4.1.0，購(gòu)自AlphaInnotech公司;恒溫振蕩搖床和恒溫培養(yǎng)箱購(gòu)自江蘇省金壇市醫(yī)療儀器廠。

1.1.4 培養(yǎng)基

本實(shí)驗(yàn)中采用溶菌肉湯培養(yǎng)基 LB(胰蛋白胨 10 g，酵母侵粉 5 g，氯化鈉 10 g)，胰蛋白胨大豆瓊脂培養(yǎng)基 TSA(胰蛋白胨 15 g，大豆蛋白胨7.5 g，氯化鈉 30 g)，牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基 NA(牛肉膏 30 g，蛋白胨 5 g，氯化鈉 5 g)，KingA(蛋白胨20 g，氯化鎂1.4 g,硫酸鉀10 g，氯化鈉3 g，丙三醇10 g)等4種培養(yǎng)基。

1.2 菌株的分離培養(yǎng)

把每一個(gè)采樣位點(diǎn)采來(lái)的4棵胡楊樹(shù)莖稈液等量混合，稀 釋 至 10-1—10-6倍，取 100 μL 涂布到上述的不同的固體培養(yǎng)基上，在 37 ℃ 培養(yǎng) 3—7 d。根據(jù)細(xì)胞與菌落形態(tài)、顏色、大小分別挑取表型差異的細(xì)菌，并在上述的培養(yǎng)基上劃線純化，純化后的內(nèi)生細(xì)菌用含 30% 甘油的 LB 培養(yǎng)基于-70 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 DNA 提取及 16S rDNA 的擴(kuò)增

DNA提取參照劉剛[23]等的方法進(jìn)行。16S rDNA擴(kuò)增采用細(xì)菌通用引物[24]27F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG- 3′)和1492R(5′-GGTTACCTTGTTACGACTT- 3′)進(jìn)行。PCR反應(yīng)體系(50 μL):DNA模板約0.8 μL，10×PCR緩沖液5.0 μL，10 mmol/L的P1和P2各0.8 μL，dNTP(10 mmol/L) 4 μL，TaqDNA聚合酶(2.5 U/laL) 0.6 μL，加滅菌雙蒸水至50.0 μL。PCR反應(yīng)條件: 94 ℃ 5 min; 94 ℃ 30s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min 30 s，30個(gè)循環(huán); 72 ℃10 min。反應(yīng)結(jié)束后，取2—3 μL PCR產(chǎn)物在1.0%瓊脂糖凝膠上電泳檢測(cè)。PCR產(chǎn)物送到上海生物工程有限公司進(jìn)行16SrDNA完整長(zhǎng)度測(cè)序。

1.4 系統(tǒng)發(fā)育分析

測(cè)序結(jié)果Ezbiocloud(EzTaxon-e server)和BLAST(http://www.ncbi.nlm.nib.gov/blast/blast.cgi) 上進(jìn)行分析。用CLUSTALX進(jìn)行多序列比對(duì)[25]，系統(tǒng)進(jìn)化矩陣根據(jù)Kimura模型[26]估算，用MEGA5.0(Molecular Evolutionary Genetics Analysis)軟件采用鄰接法[27](Neighbor.Joining)聚類(lèi)分析，并構(gòu)建出系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。

1.5 細(xì)菌多樣性指數(shù)的分析

采用 Simpson 多樣性指數(shù)(D) 、Shannon-Wiener指數(shù)(H) 和 Shannon-Wiener 均勻度指數(shù)(E) 計(jì)算多樣性[28]。

Simpson 多樣性指數(shù):

Shannon-Wiener 指數(shù):

Shannon-Wiener 均勻度指數(shù)

E=H/log2S

式中,S為菌種數(shù);Pi為第i種的多度比例，可以用Pi=Ni/N求出;Ni是第i種的菌株數(shù)，N是所有菌株數(shù)總和。

1.6 胡楊內(nèi)生細(xì)菌分布狀況分析

采用維恩圖(http://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html)的在線作圖工具對(duì)胡楊內(nèi)生細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)在3條河中的分布狀況分進(jìn)行了分析。

2 結(jié)果和分析

2.1 菌株的分離純化與測(cè)序分析

分別用NA，TSA，LB與King A等4種培養(yǎng)基進(jìn)行稀釋涂布法分離，選擇表型不同的菌株進(jìn)行劃線法培養(yǎng)純化。從樣品中分離并成功對(duì)其16S rDNA全序列測(cè)序的胡楊內(nèi)生細(xì)菌共588株，其中Ugan古河道270株，Kiyik古河道151株，塔河主河道167株。它們分別屬于6大類(lèi)群，47個(gè)屬，114個(gè)物種(表1)。其中γ-變形菌綱的細(xì)菌占總分離菌的50.17%, 厚壁菌門(mén)占34.58%，放線菌門(mén)占10.17%、α-變形菌綱占4.24%，擬桿菌門(mén)占0.50%，β -變形菌綱占0.34%；γ-變形菌綱和厚壁菌門(mén)的細(xì)菌是胡楊莖稈液中的優(yōu)勢(shì)類(lèi)群，假單胞菌屬(29.76%)和芽孢桿菌屬(19.05%)為優(yōu)勢(shì)屬。

2.2 胡楊內(nèi)生菌的系統(tǒng)發(fā)育分析

2.2.1 Ugan河胡楊內(nèi)生細(xì)菌多樣性及系統(tǒng)發(fā)育分析

從Ugan河胡楊林的兩個(gè)采樣位點(diǎn)共獲得270株細(xì)菌(表1)，通過(guò)16SrRNA基因序列測(cè)序，Ezbiocloud(EzTaxon-e server)和BLAST比對(duì)序列相似性，確定菌株的系統(tǒng)發(fā)育地位，并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)分析進(jìn)化關(guān)系(圖2)。結(jié)果表明，它們主要分布于厚壁菌門(mén)(Firmicutes, 45.93%)，γ-變形菌綱(GammaProteobacteria, 37.40%)，放線菌門(mén)(Acinetobacter, 13.70%)，α-變形菌綱(AlphaProteobacteria, 2.22%)，β變形菌綱(Beata-proteobacteria, 0.37%)和擬桿菌門(mén)(Bacteroidetes, 0.37%)等6個(gè)大領(lǐng)域，由34個(gè)屬81個(gè)種組成。芽孢桿菌屬(Bacillus)和假單胞菌屬(Pseudomonas)作為優(yōu)勢(shì)屬分別占29.26%和19.25%。分離頻率最高的是芽孢桿菌屬(Bacillus)，分離到79株該屬的細(xì)菌，分別屬于18個(gè)種。分離頻率次之的是假單胞菌(Pseudomonas)，分離到52株該屬的細(xì)菌，分別屬于12個(gè)種。除了出現(xiàn)頻率較高的上述的細(xì)菌以外，還分離到了32個(gè)屬的細(xì)菌：Brenneria(1個(gè)種)，Kocuria(4個(gè)種)，Planococcus(3個(gè)種)，Planomicrobium(5個(gè)種)，Virgibacillus(1個(gè)種)，Lysinibacillus(1個(gè)種)，Rhizobium(1個(gè)種)，Halomonas(4個(gè)種)，Nesterenkonia(3個(gè)種)，Enterobacter(1個(gè)種)，Microbacterium(1個(gè)種)，Psychrobacter(2個(gè)種)，Ralstonia(1個(gè)種)，Pantoea(1個(gè)種)，Acinetobacter(2個(gè)種)，Brevibacterium(1個(gè)種)，Microvirga(1個(gè)種)，Gracilibacillus(1個(gè)種)，Kineococcus(1個(gè)種)，Staphylococcus(5個(gè)種)，Cellulosimicrobium(1個(gè)種)，Janibacter(1個(gè)種)，Roseomonas(2個(gè)種)，Luteimonas(1個(gè)種)，Pontibacter(1個(gè)種)，Exiguobacterium(1個(gè)種)，Oceanobacillus(1個(gè)種)，Macrococcus(1個(gè)種)，Photobacterium(1個(gè)種)，Providencia(1個(gè)種)，Micrococcus(2個(gè)種)。

表1 3個(gè)生態(tài)區(qū)胡楊林中分離的代表菌株列表

表中分離來(lái)源一列K代表Kiyik河，U代表Ugan河，T代表塔河主河道

圖2 Ugan河胡楊內(nèi)生細(xì)菌16rDNA系統(tǒng)發(fā)育分析Fig.2 Phylogenetic tree of 16S rDNA sequences of endophytic bacteria isolated from populus euphratica in Ugan RiverThe tree was constructed by the neighbor-joining method.the bootstrap values were obtained after a bootstrap test with 1000 replications;The numbers in parentheses are accession numbers of sequences;Scale bar indicates 2% sequence divergence

從Ugan河采集的樣品中分離的細(xì)菌最多，為270株，屬于細(xì)菌六大類(lèi)群。其中厚壁菌門(mén)所占的比例最高，占45.93%。γ-變形菌綱所占的比例為第2，占37.40%。而在胡楊總內(nèi)存液中，γ-變形菌綱作為優(yōu)勢(shì)類(lèi)群占總分離菌株的50.17%；厚壁菌門(mén)為第2，占34.58%。Ugan河樣品和胡楊總內(nèi)生細(xì)菌的細(xì)菌類(lèi)群相比，所占的優(yōu)勢(shì)類(lèi)群比例上有所差異。例如Ugan河樣品中，γ-變形菌綱所占的比例從胡楊總內(nèi)存液中的50.17%減少到37.4%，列為第2；而厚壁菌門(mén)所占的比例從胡楊總內(nèi)存液中的34.58%增加到45.93%，列為第1。其他4個(gè)類(lèi)群所占的比例基本上跟胡楊總內(nèi)存液中的比例保持一致，依次為放線菌門(mén)，α-變形菌綱，擬桿菌門(mén)和β-變形菌綱。

2.2.2 Kiyik河胡楊內(nèi)生細(xì)菌多樣性及系統(tǒng)發(fā)育分析

用可培養(yǎng)方法從Kiyik河胡楊林的兩個(gè)采樣位點(diǎn)共獲得151株細(xì)菌(表1)，通過(guò)16S rRNA基因序列測(cè)序，Ezbiocloud(EzTaxon-e server)和BLAST上比對(duì)序列相似性，確定菌株的系統(tǒng)發(fā)育地位，并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)分析進(jìn)化關(guān)系(圖3)。結(jié)果表明，151株細(xì)菌分別屬于γ-變形菌綱(Gamma-Proteobacteria, 57.61%)，厚壁菌門(mén)(Firmicutes, 27.15%)，放線菌門(mén)(Actinobacteria, 7.94%)， α-變形菌綱 (Alpha-Proteobacteria, 6.62%),β-變形菌綱 (Beta-proteobacteria, 1.32%)和擬桿菌門(mén)(Bacteroidetes, 0.66%)等細(xì)菌域6大系統(tǒng)發(fā)育類(lèi)群，25個(gè)屬，49個(gè)物種。其中假單胞菌屬(Pseudomonas)作為優(yōu)勢(shì)屬，占總分離菌株的38.40%，次之是芽孢桿菌屬(Bacillus)占15.23%。假單胞菌屬(Pseudomonas)的分離頻率最高，分離到58株該屬的細(xì)菌，分別屬于8個(gè)不同種。次之是芽孢桿菌屬(Bacillus)，分離到23株該屬的細(xì)菌，分別屬于8個(gè)種。除了以上的出現(xiàn)頻率較高的細(xì)菌以外，還分離到了23個(gè)屬的細(xì)菌：Halomonas(5種)，Planococcus(5種)，Acinetobacter(2種)，Streptomyces(3種)，Nesterenkonia(2種)，Microbacterium(2種)，Ignatzschineria(1種)，Azomonas(1種)，Stenotrophomonas(1種)，Ralstonia(1種)，Macrococcus(1種)，Saccharibacillus(1種)，Planomicrobium(1種)，Corynebacterium(1種)，Kocuria(1種)，Nocardioides(1種)，Rosomonas(1種)，Rhizobium(1種)，Pontibacter(1種)，F(xiàn)ictibacillus(1種)，Exiguobacterium(1種)，Brenneria(1種)，Pantoea(1種)。

從Kiyik河采集的樣品中分離的細(xì)菌較少，為151株，屬于細(xì)菌六大類(lèi)群。六大類(lèi)群在Kiyik河樣品中所占的比例基本上跟胡楊總內(nèi)存液保持一致，依次為γ-變形菌綱，厚壁菌門(mén)，放線菌門(mén)，α-變形菌綱，擬桿菌門(mén)和β-變形菌綱。而Kiyik河和Ugan河樣品的細(xì)菌類(lèi)群相比，在Kiyik河樣品中γ-變形菌綱所占的比例有所增加，占57.61%。厚壁菌門(mén)所占的比例有所減少，僅占27.15%。除此之外，放線菌所占的比例有減少，α-變形菌綱所占的比例有增加的趨勢(shì)。

2.2.3 塔河胡楊內(nèi)生細(xì)菌多樣性及系統(tǒng)發(fā)育分析

用可培養(yǎng)方法從塔河胡楊林的兩個(gè)采樣位點(diǎn)共獲得167株細(xì)菌(表1)，通過(guò)16S rRNA基因序列測(cè)序，Ezbiocloud(EzTaxon-e server)和BLAST上比對(duì)序列相似性，確定菌株的系統(tǒng)發(fā)育地位，并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)分析進(jìn)化關(guān)系(圖4)。結(jié)果表明，167株菌分別屬于γ-變形菌綱(Gamma-Proteobacteria, 64.70%)，厚壁菌門(mén)(Firmicutes, 23.30%)，放線菌門(mén)(Actinobacteria, 6.60%)，α-變形菌綱 (Alpha-Proteobacteria, 5.30%) 等細(xì)菌域4大系統(tǒng)發(fā)育類(lèi)群，19個(gè)屬39個(gè)物種。其中假單胞菌屬作為優(yōu)勢(shì)屬，占細(xì)菌總數(shù)的38.90%，共分離到65株屬于該屬的細(xì)菌，分別屬于8個(gè)種。除此之外還分離了Aeromonas(3種)，Acinetobacter(1種)，Brenneria(1種)，Escherichia(1種)，Halomonas(1種)，Rahnella(1種)和Vibrio(1種)等屬于γ-變形菌綱的8個(gè)不同屬的細(xì)菌。厚壁菌門(mén)(Firmicutes)細(xì)菌類(lèi)群中含有39株細(xì)菌，分別屬于Bacillus(5種)，Aerococcus(1種)，Exiguobacterium(1種)，Marinilactibacillus(1種)，Planococcus(3種)和Planomicrobium(4種)等6個(gè)屬。放線菌門(mén)細(xì)菌類(lèi)群中含有11株細(xì)菌，分別屬于Kocuria(2種)，Nesterenkonia(1種)和Sanguibacter(1種)等3個(gè)屬。α-變形菌綱 (Alpha-Proteobacteria) 細(xì)菌類(lèi)群中含有9株細(xì)菌，分別屬于Roseomonas(1種)，Rhizobium屬(1種)。

圖3 Kiyik河胡楊內(nèi)生細(xì)菌16rDNA系統(tǒng)發(fā)育分析Fig.3 Phylogenetic tree of 16S rDNA sequences of endophytic bacteria isolated from populus euphratica in Kiyik River The tree was constructed by the neighbor-joining method.the bootstrap values were obtained after a bootstrap test with 1000 replications;The numbers in parentheses are accession numbers of sequences;Scale bar indicates 2% sequence divergence

圖4 塔里木河胡楊內(nèi)生細(xì)菌16rDNA系統(tǒng)發(fā)育分析Fig.4 Phylogenetic tree of 16S rDNA sequences of endophytic bacteria isolated from populus euphratica in Tarim RiverThe tree was constructed by the neighbor-joining method.the bootstrap values were obtained after a bootstrap test with 1，000 replications;The numbers in parentheses are accession numbers of sequences;Scale bar indicates 2% sequence divergence

從塔河采集的樣品中分離的細(xì)菌較多，為167株，屬于細(xì)菌四大類(lèi)群。塔河和Ugan河，Kiyik河樣品的胡楊內(nèi)生細(xì)菌相比，在細(xì)菌類(lèi)群上有一定的差異，例如Ugan河，Kiyik河樣品中分離的擬桿菌門(mén)和β-變形菌綱的細(xì)菌在塔河樣品中沒(méi)有被分離到。并且γ-變形菌綱所占的比例有繼續(xù)增加的趨勢(shì)，例如γ-變形菌綱在Ugan河占37.40%，在Kiyik河占57.61%，在塔河樣品中占64.70%。而厚壁菌門(mén)所占的比例有減少的趨勢(shì)，例如厚壁菌門(mén)在Ugan河占45.93%，在Kiyik河占27.15%，在塔河樣品中占23.30%。除此之外，放線菌門(mén)所占的比例也有相應(yīng)的減少趨勢(shì)，放線菌門(mén)在Ugan河樣品中占13.70%，在Kiyik河占7.94%，在塔河樣品中占6.60%。α-變形菌綱所占的比例跟Ugan河樣品相比有增加，跟Kiyik河樣品相比有減少趨勢(shì)。

2.3 胡楊本源內(nèi)生新菌種分布狀況分析

Ugan河、Kiyik河和塔河主河道胡楊林胡楊內(nèi)存液中總共分離的588株細(xì)菌中，有211株菌(16S rRNA基因序列長(zhǎng)度1300—11500 bp)與其已知的最近親緣關(guān)系菌株的16S rRNA基因序列相似性小于98.0%(表2)，占總分離菌株的35.884%。這211株菌隸屬于19個(gè)屬，41個(gè)種(表2)，是41個(gè)潛在的新菌種，也是胡楊林中的特有本源土著菌種。這一數(shù)據(jù)充分展示了胡楊內(nèi)生菌群落結(jié)構(gòu)的獨(dú)特性，它們整體上較少的遭受外來(lái)常見(jiàn)優(yōu)勢(shì)菌種的入侵、清洗與取代，保持了較高程度的地域隔離性、純潔性與原始性。這41種潛在新菌中，只有與Halomonasmeridiana，Nesterenkoniaaethiopica，Pseudomonasazotifigens，Pseudomonassabulinigri，Pseudomonasxinjiangensis，Rhizobiumrosettiformans這6個(gè)菌種相聚類(lèi)的6個(gè)潛在新菌種從所有3條河道的樣品中檢出，他們是胡楊林中普遍存在的本源物種。其中與Pseudomonasxinjiangensis這個(gè)菌種相聚類(lèi)的潛在新菌種中共有74個(gè)分離株，占總分離菌株的12.585%(74/588)，是胡楊內(nèi)生菌中的本源優(yōu)勢(shì)菌種。還有與Acinetobacterlwoffii，Halomonassulfidaeris，Macrococcusbrunensis，Nesterenkoniasuensis，Pseudomonaspelagia，Pseudomonasstutzeri相聚類(lèi)的6個(gè)潛在新菌種只出現(xiàn)在Kiyik河與Ugan河這2條河道的樣品中，而沒(méi)有出現(xiàn)在塔河樣品。這一結(jié)果揭示塔河胡楊內(nèi)生菌群落結(jié)構(gòu)發(fā)生了較大的變化，而Ugan河與Kiyik河胡楊內(nèi)生菌群落結(jié)構(gòu)較多的保持了原始狀態(tài)。而其余的29個(gè)潛在新菌種分別分布于3個(gè)河道中一條河道中，它們是胡楊內(nèi)生菌中稀有的本源弱勢(shì)菌種，比較容易受環(huán)境因素的干擾，被外來(lái)優(yōu)勢(shì)菌群清洗取代。各河道胡楊林區(qū)內(nèi)生菌新菌種的檢出率表現(xiàn)出了較大的差異，Ugan河為21種，Kiyik河為20種，而塔河最少只有8種。這表明塔河主河道流域受人類(lèi)生活和生產(chǎn)活動(dòng)的影響，大量的外來(lái)常見(jiàn)優(yōu)勢(shì)菌群入侵?jǐn)U散，使原有本土弱勢(shì)菌群大量消失，胡楊林原有的本源內(nèi)生菌種群落結(jié)構(gòu)產(chǎn)生了較大的改變。

表2 潛在新種與模式菌株的16 rDNA序列相似性

表中分離來(lái)源一列K代表Kiyik河，U代表Ugan河，T代表塔河主河道

2.4 胡楊內(nèi)生細(xì)菌多樣性指數(shù)與3條河細(xì)菌群落的分布狀況分析

2.4.1 從3條河胡楊林中分離的胡楊內(nèi)生細(xì)菌多樣性指數(shù)結(jié)果見(jiàn)表3。從表中可知：Ugan河胡楊內(nèi)生細(xì)菌辛普森(Simpson)多樣性指數(shù)，香農(nóng)-威納(Shannon-Wiener)多樣性指數(shù)高于Kiyik河和塔河胡楊內(nèi)生細(xì)菌的多樣性指數(shù)。Kiyik河和塔河比較，塔河胡楊內(nèi)生細(xì)菌辛普森(Simpson)多樣性指數(shù)高于Kiyik河胡楊內(nèi)生細(xì)菌，而Kiyik河胡楊內(nèi)生細(xì)菌香農(nóng)-威納(Shannon-Wiener)多樣性指數(shù)高于塔河胡楊內(nèi)生細(xì)菌。比較香農(nóng)-威納(Shannon-Wiener)均勻指數(shù)，Ugan河胡楊內(nèi)生細(xì)菌均勻度最高，塔河胡楊內(nèi)生細(xì)菌的均勻度為次之，Kiyik河楊內(nèi)生細(xì)菌的均勻度最低。

表3 3個(gè)生態(tài)區(qū)胡楊內(nèi)生細(xì)菌多樣性指數(shù)與均勻度指數(shù)

Table 3 Diversity index and uniformity index of the endophytic bacteria from three ecosystems

多樣性指數(shù)IndexofdiversityUgan河UganRiverKiyik河KiyikRiver塔河主河道TarimRiver辛普森多樣性指數(shù)Simpson0.9690.9310.935香農(nóng)-威納指數(shù)Shannon-Wiener5.4364.54.3944香農(nóng)威納均勻度指數(shù)Shannon-Wiener0.8570.79370.8314

2.4.2 胡楊林內(nèi)生細(xì)菌群落的菌種分布狀況見(jiàn)圖5。 由圖5可知塔里木胡楊林內(nèi)生細(xì)菌群落共形成114個(gè)物種水品的分類(lèi)學(xué)單元。其中Ugan河分布81種，Kiyik河49種，塔河主河道39種。由于各河道的地理位置、空間距離和采樣點(diǎn)的環(huán)境條件的不同，3個(gè)內(nèi)生菌亞群落結(jié)構(gòu)上出現(xiàn)了較大的差異。屬于Acinetobacterjohnsonii，Bacillusflexus，Bacilluspumilus，Bacillussafensis，Brenneriasalicis，Halomonasmeridiana，Kocuriarosea，Nesterenkoniaaethiopica，Planococcusrifietoensis，Planococcussalinarum，Planomicrobiumkoreense，Pseudomonasazotifigens，Pseudomonassabulinigri，Pseudomonasxinjiangensis，Pseudomonasstutzeri，Rosemonasaestuarii，Rhizobiumrosettiformans等以上17種的細(xì)菌在3條河胡楊林采集的樣品中都得到了分離培養(yǎng)，僅占菌種數(shù)總數(shù)的14.91%。而其余97個(gè)物種則分別分布于其中一條河道或2條河道。Ugan河分布的81種中除了3者共有的17種外，與Kiyik河共有的有12種，與塔河共有的有7種，Ugan河獨(dú)有的有45種之多。Kiyik河分布的49個(gè)菌種中除了3者共有的17種外，與Ugan河共有的有12種，與塔河共有的有2種，Kiyik河獨(dú)有的有18種。塔河分布的有39種除了3者共有的17種外，與Ugan河共有的僅有7種，與Kiyik河共有的僅有2種，塔河獨(dú)有的有13種。3個(gè)亞群落獨(dú)有的菌種數(shù)有76株之多，占總菌種數(shù)的66.67%，總體上呈現(xiàn)離散狀態(tài)。上述數(shù)據(jù)表明胡楊內(nèi)生菌的地域分布性較強(qiáng)，不同的胡楊林生態(tài)區(qū)有不同的菌種分布。3個(gè)亞群落中共有的17個(gè)菌種是胡楊內(nèi)生菌種中適應(yīng)性最強(qiáng)的菌種，可能在胡楊體內(nèi)新陳代謝過(guò)程中具有重要的功能，與胡楊樹(shù)共生共榮，不棄不離。

圖5 胡楊內(nèi)生菌群落分布狀況示意Fig.5 Venn diagram of representing the number of species isolated from each sample and the overlap of species among the samples圖中Ugan代表Ugan河，Kiyik代表Kiyik河， Tarim代表塔河主河道

2.5 菌種與潛在新菌種檢出率分析

本源潛在新菌種是一個(gè)細(xì)菌群落中特有的物種，因?yàn)樗淮嬖谟谄渌魏尾煌募?xì)菌群落中。因而，本源潛在新菌種數(shù)量的多少可以直觀的反映一個(gè)微生物群落是否處于原生態(tài)狀態(tài)。潛在新菌種數(shù)量多表明外來(lái)優(yōu)勢(shì)常見(jiàn)菌種尚未對(duì)它們進(jìn)行取代和替換，反之則表明潛在新菌種被外來(lái)優(yōu)勢(shì)常見(jiàn)菌種清除、數(shù)量減少，細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)發(fā)生了改變。同理，隨著外來(lái)優(yōu)勢(shì)常見(jiàn)菌種的持續(xù)入侵，群落中原有弱勢(shì)菌種不斷被取代清除，導(dǎo)致菌種數(shù)減少。所以一個(gè)細(xì)菌群落是否被外源菌群入侵，也可以通過(guò)該群落的菌種數(shù)量作為指標(biāo)進(jìn)行衡量和判定。

本研究從Ugan河采樣點(diǎn)分離到了最多(270株)的表型各異的胡楊內(nèi)生菌株，它們錄屬于6大系統(tǒng)發(fā)育類(lèi)群，34個(gè)屬81個(gè)物種。平均每3.333(270/81)個(gè)分離菌株產(chǎn)生1個(gè)物種水平的分類(lèi)學(xué)單元(表4)。 Ugan河樣品中分離到21種(表2)潛在新菌種，平均每12.857(270/21)個(gè)分離株能夠檢出1個(gè)潛在的新物種分類(lèi)單元(表4)。在種的水平上表現(xiàn)出了較大的相容性。

從Kiyik河采樣點(diǎn)分離到了較少(151株)的表型各異的胡楊內(nèi)生菌株，它們錄屬于6大系統(tǒng)發(fā)育類(lèi)群，25個(gè)屬49個(gè)物種。平均每3.082(151/49)個(gè)分離菌株產(chǎn)生1個(gè)物種水平的分類(lèi)學(xué)單元(表4)；在潛在新菌種的檢出率上也表現(xiàn)出同一趨勢(shì)，樣品中分離到20種(表2)潛在新菌種，平均每7.55(151/20，表4)個(gè)分離株就能夠檢出1個(gè)潛在的新物種分類(lèi)單元(表4)；在種的水平上表現(xiàn)出了最大的相容性。

從塔里木河采樣點(diǎn)分離到了較多(167株)的表型各異的胡楊內(nèi)生菌株，但是僅錄屬于4大系統(tǒng)發(fā)育類(lèi)群，19個(gè)屬，39個(gè)物種。平均每4.282(167/39)個(gè)分離菌株才能產(chǎn)生1個(gè)物種水平的分類(lèi)學(xué)單元(表4)。樣品中僅分離到8種(表2)潛在新菌種，平均每20.875(167/8)個(gè)分離株才能夠檢出1個(gè)潛在的新物種分類(lèi)單元(表4)；在種的水平上表現(xiàn)出了較大的局限性。

表4 3個(gè)生態(tài)區(qū)胡楊內(nèi)生細(xì)菌菌種與潛在新菌種檢出率

Table 4 The detection rates of bacteria species number and the indigenous potential new species number in three ecosystems

檢出率DetectionratesUgan河UganRiverKiyik河KiyikRiver塔河主河道TarimRiver菌種檢出率detectionratesofbacteriaspecies1/3.3331/3.0821/4.282潛在新菌種檢出率detectionratesofpotentialnewspecies1/12.8751/7.5501/20.875

表4數(shù)據(jù)揭示，Kiyik河胡楊內(nèi)生菌群落中，菌種檢出率與潛在新菌種檢出率均最高，細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)相對(duì)保持了最高程度的原始狀態(tài)。由同類(lèi)物種的外來(lái)突變體品系在胡楊體內(nèi)定植類(lèi)型較少，形成改變?cè)衅胶鉅顟B(tài)的外來(lái)優(yōu)勢(shì)種群比較有限。在塔河主河道胡楊內(nèi)生菌群落中，菌種檢出率與潛在新菌種檢出率均最低，菌種數(shù)量上趨于減少，細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)相對(duì)發(fā)生了較大的改變。外來(lái)優(yōu)勢(shì)種群的入侵、定植和擴(kuò)散對(duì)原有的本源稀有弱勢(shì)菌種形成較大的選擇壓力，稀有弱勢(shì)群體已經(jīng)被邊緣化、取代和清洗出局。Ugan河胡楊內(nèi)生菌群落的菌種檢出率與潛在新菌種檢出率均據(jù)第二位，細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)雖然發(fā)生了一定程度的改變，但也在相當(dāng)?shù)某潭壬媳３至嗽紶顟B(tài)。

3 討論

(1)塔里木胡楊林是全世界最大的一片天然胡楊林，其分布面積約為30萬(wàn)hm2[9]。塔河中游主林區(qū)內(nèi)人煙稀少，受人類(lèi)生產(chǎn)與生活活動(dòng)影響較小，基本上保持著原生態(tài)狀態(tài)。本研究所獲數(shù)據(jù)表明，胡楊內(nèi)生細(xì)菌多樣性高，整體上在門(mén)和綱、屬和物種的水平上都展現(xiàn)了其內(nèi)在的豐富度。系統(tǒng)發(fā)育比較均勻，群落結(jié)構(gòu)保持相對(duì)穩(wěn)定。在588株分菌株中就有211株菌的16S rDNA序列與已報(bào)道的菌種序列相似性小于98.0%，它們是塔里木胡楊林內(nèi)生細(xì)菌的特有本源菌群，數(shù)量大，比例高。潛在新菌種類(lèi)型數(shù)量多，分布域廣泛(19個(gè)屬的41個(gè)種)等結(jié)果揭示：整個(gè)群落結(jié)構(gòu)保持了較高的純潔性，較少地受到了外來(lái)優(yōu)勢(shì)菌群的入侵與取代，原始狀態(tài)保持完好，與胡楊林這一大生態(tài)環(huán)境保持了較高的一致性。

(2) 塔里木河主河道是目前最繁茂的胡楊林區(qū)，也是當(dāng)今人類(lèi)生產(chǎn)與生活活動(dòng)的聚集區(qū)。已斷流廢棄126a的Ugan河[29]與斷流廢棄344a的Kiyik古河道位于塔河中游南部的荒漠區(qū)(圖1)，它們與當(dāng)今塔河河道距離較遠(yuǎn)，已脫離了塔河水系。其河岸兩側(cè)斷續(xù)地分布著相當(dāng)繁茂的胡楊林，形成了在時(shí)間和空間上相對(duì)隔離封閉的3個(gè)生態(tài)體系。3條河分離菌種亞群落結(jié)構(gòu)的分析數(shù)據(jù)(圖5)揭示：3個(gè)亞群落共有的菌種數(shù)遠(yuǎn)低于各亞群落獨(dú)有的菌種數(shù)，個(gè)性遠(yuǎn)大于共性，菌種的地域分布性較強(qiáng)，不同的胡楊林生態(tài)區(qū)有不同的菌種分布。菌種與潛在新菌檢出率(表2，表4)數(shù)據(jù)表明：Kiyik河菌種與潛在新菌檢出率最高，這與它的斷流年代、無(wú)人類(lèi)活動(dòng)遺跡、較遠(yuǎn)的地理隔離距離與小生態(tài)環(huán)境等特征相適應(yīng)，保持了最原始的群落結(jié)構(gòu)體系。Ugan河的菌種與新菌種檢出率較高，與Kiyik河保持了較多的共性，與塔河共性較低。這與其斷流廢棄年代，與人類(lèi)生活區(qū)的空間距離相一致。塔河亞群落的菌種與潛在新菌種檢出率最低，是外來(lái)常見(jiàn)優(yōu)勢(shì)微生物的入侵、取代和生態(tài)沖刷所致，在時(shí)間與空間上與當(dāng)代人類(lèi)活動(dòng)的增加密切相關(guān)。

(3)本源潛在新菌種檢出率是指本源的潛在新菌種數(shù)在所屬群落的分離菌株數(shù)中所占的比率。它比較易于理解、直觀，靈敏，變化幅度比較大，易于對(duì)群落結(jié)構(gòu)是否被入侵及其改變程度進(jìn)行對(duì)比研判。但是它只適用于本源新菌種較多的群落的分析，而不能用于對(duì)本源新菌種少或缺乏的群落的分析。菌種檢出率是指一個(gè)群落中的所有菌種數(shù)在所屬群落的分離菌株數(shù)中所占的比率。它比較抽象，不直觀，靈敏度與變化幅度都較小。但是他可以用于研判任何1個(gè)群落被入侵更改的程度。尤其適應(yīng)對(duì)本源新菌種少或?yàn)榱愕娜郝涞姆治?。這兩個(gè)指數(shù)越大就證明群落結(jié)構(gòu)的原始狀態(tài)保持的越好，反之就表明群落結(jié)構(gòu)遭到了外來(lái)優(yōu)勢(shì)物種的更改。

(4) 3個(gè)群落共有的17個(gè)菌種(圖5，表1，表2)是所有胡楊內(nèi)生菌中最適應(yīng)于胡楊內(nèi)環(huán)境的菌種，它們可能在胡楊的生理生化、物質(zhì)代謝與免疫等方面起著舉足輕重的作用，它們是胡楊病蟲(chóng)害生防菌株的有力候選菌株。植物內(nèi)生細(xì)菌作為潛在的生防資源，已成為近年來(lái)生防菌劑研制開(kāi)發(fā)的熱點(diǎn)。國(guó)內(nèi)外許多學(xué)者已在該領(lǐng)域取得了較多的進(jìn)展，并已應(yīng)用于生產(chǎn)實(shí)踐。多年來(lái)胡楊一直受到褐色斑點(diǎn)病，黑色斑點(diǎn)病，葉銹病，黑星病，柵銹菌病，樹(shù)干腐爛病，春尺蠖等病原菌和害蟲(chóng)的危害，這些病害極大地加劇了胡楊林的衰敗與生態(tài)體系的破碎化的進(jìn)程[30- 36]。從胡楊中分離適應(yīng)性強(qiáng)的可培養(yǎng)內(nèi)生細(xì)菌，檢測(cè)出一批具有生物防治作用的內(nèi)生菌資源，將在提高胡楊樹(shù)的抗病，抗蟲(chóng)能力和促進(jìn)胡楊林復(fù)壯等方面具有潛在的實(shí)踐意義。

(5)假單胞菌屬由于簡(jiǎn)單的營(yíng)養(yǎng)需求，易適應(yīng)等特征在自然界中普遍存在[37]。該屬被認(rèn)為是根際微生物群體很重要的成分，他們有能力在根表面增殖，防止植物病原菌的繁殖和促進(jìn)植物生長(zhǎng)[38，39]?，F(xiàn)已證實(shí)假單胞菌能產(chǎn)生有效鐵載體、抗生素、胞外水解酶和HCN等抑菌代謝產(chǎn)物和誘導(dǎo)植物組織產(chǎn)生抗生，有效地保護(hù)植物根系免受病原微生物侵害[37,40- 42]。本研究中分離的與Pseudomonasxinjiangensis相聚類(lèi)的潛在新菌種具有酯酶(C4)，類(lèi)脂酯酶(C8)，酸性磷酸酶，堿性磷酸酶活性。并且能產(chǎn)生醋竹桃霉素，二甲胺四環(huán)素等抗生素。因此可以推測(cè)，與Pseudomonasxinjiangensis這個(gè)菌種相聚類(lèi)的潛在新菌種作為胡楊內(nèi)生菌中的本源優(yōu)勢(shì)菌種，在防治胡楊病害和加速胡楊對(duì)一些有機(jī)物的利用等方面起著一定的作用。

4 結(jié)論

(1)塔里木河胡楊林胡楊內(nèi)生細(xì)菌具有很高的細(xì)菌多樣性，在分離檢測(cè)的588株細(xì)菌的范圍內(nèi)，共發(fā)現(xiàn)6大類(lèi)群的細(xì)菌。其中γ-變形菌綱的細(xì)菌占總分離菌的50.17%, 厚壁菌門(mén)占34.58%，放線菌門(mén)占10.17%，α-變形菌綱占4.24%，擬桿菌門(mén)占0.50%，β-變形菌綱占0.34%；共47個(gè)屬，114種；γ-變形菌綱和厚壁菌門(mén)的細(xì)菌是胡楊莖稈液中的優(yōu)勢(shì)類(lèi)群，假單胞菌屬(29.76%)和芽孢桿菌屬(19.05%)為優(yōu)勢(shì)屬。

(2)總分離菌株中就有211株菌的16S rDNA與已報(bào)道的菌種序列相似性小于98.0%，它們是塔里木胡楊林內(nèi)生細(xì)菌的特有本源菌群，數(shù)量大，比例高。潛在新菌種類(lèi)型數(shù)量多，分布域廣泛，分布在19個(gè)屬的41個(gè)物種。其中與Pseudomonasxinjiangensis這個(gè)菌種相聚類(lèi)的潛在新菌種(74株，12.585%)是胡楊內(nèi)生菌的本源優(yōu)勢(shì)菌種。

(3) 辛普森多樣性指數(shù)表明Kiyik河胡楊可培養(yǎng)內(nèi)生菌的多樣性指數(shù)為0.931，塔河多樣性指數(shù)為0.935；Ugan河多樣性指數(shù)最高，為0.969。香農(nóng)—威納均勻度指數(shù)表明，Ugan河的可培養(yǎng)胡楊內(nèi)生細(xì)菌的均勻度指數(shù)為0.8570；塔河次之，為0.8314；Kiyik河最低，為0.7937。

(4) 塔河主河道的胡楊內(nèi)生菌群落結(jié)構(gòu)，在伴隨人流而入侵的外來(lái)優(yōu)勢(shì)菌種的作用下，已經(jīng)發(fā)生了較大改變。Kiyik河的內(nèi)生菌群落結(jié)構(gòu)保持最為完善，很少受到外界的影響。Ugan胡楊內(nèi)生細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)發(fā)生了較小程度的改變，原生態(tài)保持狀況優(yōu)于塔河，弱于Kiyik河。

[1] Kim T U, Cho S H, Han J H, Shin Y M, Lee H B and Kim S B.Diversity and Physiological Properties of Root EndophyticActinobacteriain Native Herbaceous Plants of Korea.The Journal of Microbiology, 2012, 50(1): 50- 57.

[2] Duan J L, Li X J, Gao J M,Wang D S, Yan Y, Xue Q H.Isolation and identification of endophytic bacteria from root tissues of Salvia miltiorrhiza Bge.and determination of their bioactivities.Annals of Microbiology, 2013, 63(4): 1501- 1512.

[3] Strobel G, Daisy B, Castillo U, Harper G.Natural products from endophytic microorganisms.Journal of Natural Products, 2004, 67(2): 257- 268.

[4] Robert P.R, Kieran G, Ashley F, David J.R, David N.D.Bacterial endophytes: recent developments and applications.FEMS Microbiology Letters, 2008, 278(1): 1- 9.

[5] Mónica R, Esperanza M R.Bacterial Endophytes and Their Interactions with Hosts.The American Phytopathological Society, 2006, 19(8): 827- 837.

[6] Compant S, Clement C, Sessitsch A.Plant growth-promoting bacteria in the rhizo-and endosphere of plants: their role, colonization, mechanisms involved and prospects for utilization.Soil Biology and Biochemistry, 2010, 42(5): 669- 678.

[7] Reinhold H B, Hurek T.Living inside plants: bacterial endophytes.Current Opinion in Plant Biology, 2011, 14(4): 435- 443.

[8] Cheng X L, Liu S Q.An elementary comment on diversifolious poplar protection in talimu diversifolious poplar protection zone.Central South Forest Inventory and Planning, 2004, 23(1): 33- 35.

[9] Wang S J.The status, conservation and recovery of global resources ofPopuluseuphradica.World Forestry Research, 1996, 9(6): 37- 44.

[10] Chen Y N, Wang Q, Ruan X, Li W H, Chen Y P.Physiological response ofPopuluseuphraticato artificial water-recharge of the lower reaches of Tarim River.Acta Botanica Sinica, 2004, 46(12): 1393- 1401.

[11] Chen Y N, Li W H, Chen Y P, Xu C C, Zhang L H.Water conveyance in dried-up riverway and ecological restoration in the lower reaches of Tarim River, China.Acta Ecologica Sinica, 2007, 27(2): 538- 545.

[12] Yuan X Y, Shi L, Hu D G L, Liu H, Lü H L.A diversity study of rhizosphere and Endophytic fungi fromPopulusEuphraticaoliver.Journal of Northwest Forestry University, 2007, 22(6): 85- 88.

[13] Han Y J, Zhang Q L.Study on soil population of different depth PopuluseuphraticaOliv.Rhizosphere soil [J].Journal of Arid Land Resources and Environment, 2008, 22(11): 185- 190.

[14] Wang N, Sheng G, Deng A H, Wang L, Ji J, Rahman E.Isolation and morphology study of pathogenic microflora in naturalPopuluseuphraticaOliverstand of Tarim River valley.Biotechnology, 2007, 17(4): 61- 63.

[15] Mijit Z, Ma X R, Abdurehim A, Rahman E.Cultivable bacteria diversity in a small area of naturalPopulusEuphraticaforest of Tarim River valley, China.Biotechnology, 2009, 19(5): 19- 22.

[16] Hamdun M, Pulat S, Yusuf K, Osman G, Turdahun M, Cheng G, Abdurehim Z, Rahman E, Abdukerim M.Culturable Bacterial Diversity in the Soil ofPopuluseuphraticaForest in Shayar County.Xinjiang Agricultural science, 2011, 48(5): 832- 840.

[17] Abdurehim Z.Phylogenetic Diversity of Endophytic Yeasts from thePopuluseuphraticaat the Ancient Rivers of Tarim Basin and Taxonomic Identification of Two Novel Species[D].Urumqi: Xinjiang University, 2012.

[18] Cheng G.Diversity of Endophytic Microbial Community of thePopuluseuphraticain Lopnur Countys[D].Urumqi: Xinjiang University, 2012.

[19] He X, Xiao T, Kuang H J, Lan X J, Tudahong M, Osman G, Fang C X, Rahman E.Sphingobacteriumshayensesp.nov., isolated from forest soil.International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 2010, 60(10): 2377- 2381.

[20] Xiao T, He X, Cheng G, Kuang H J, Ma X R, Yusup K, Hamdun M, Abaidulla G, Fang C X, Rahman E.Sphingobacteriumhotanensesp.nov., isolated from soil of aPopuluseuphraticaforest, and emended descriptions ofSphingobacteriumdaejeonenseandSphingobacteriumshayense.International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 2013, 63(3): 815- 820.

[21] Turdahon M, Osman G, Hamdun M, Yusuf K, Abdurehim Z, Abaydulla G, Abdukerim M, Fang C X, Rahman E.RhizobiumTarimensesp.nov., isolated from soil in the ancient Khiyik River.International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 2013, 63(7): 2424- 2429.

[22] Yusuf K, Pulat S, Turdahun M, Hamdun M, Osman G, Abdurehim Z, Rahman E.Phylogenetic diversity of culturable endophytic bacteria isolated from thePopuluseuphraticaat the disused ancient Ugan River.Acta Microbiologica Sinica, 2011, 51(2): 178- 188.

[23] Liu G, Zhai C Y.A current and speedy extraction method for bacterial chromosomal DNA from a trifle of broth.Medical Journal of West China, 2004, 16(2): 111- 113.

[24] Huo Y Y, Xu X W, Wang C S, Yang J Y, Wu M.Bacterial diversity of the sediment from Cangnan Large Fishing Bay.Acta Ecologica Sinica, 2008, 28(10): 5166- 5172.

[25] Thompson J D, Gibson T J, Plewni F, Jeanmougin F, Higgins D G.The Clustal X windows interface: flexible strategies for multiple sequence alignment aided by quality analysis tools.Nucleic Acids Research, 1997, 25(24): 4876- 4882.

[26] Kimura M.A simple method for estimating evolutionary rates of base substitutions through comparative studies of nucleotide sequences.Journal of Molecular Evolution, 1980, 16(2): 111- 120.

[27] Saitou N, Nei M.The neighbor-joining method: A new method for reconstructing phylogenetic trees.Molecular Biology and Evolution,1987, 4(4): 406- 425.

[28] Tom C J H, Kerry A W, James A H, Bruce F M.Using ecological diversity measures with bacterial communities.FEMS Microbiology Ecology, 2003, 43(1): 1- 11.

[29] Li M.Groundwater Exploitation and Ecological Environment Protection in Weigan River Basin, Xinjiang, RR.China[D].Beijing: China University of Geosciences, 2005.

[30] Xiao T.Isolation and Identification of Leaf Brown Spot Caused Pathogens fromPopulusEuphracticaForest of Tarim River and Identification of a Novel Species[D].Urumqi: Xinjiang University, 2010.

[31] Xiao T, Kuang H J, He X, Lan X J, Rahman E, Abaidulla G.Research on poplar leaf rust.Biotechnology, 2009, 19(5): 94- 96.

[32] Li Q, Gu S C, Wang Y L, Li Z J, Li Z L, Li J Q.Morphology of uredospores and infecting structure of Melampsora pruinosae inPopuluseuphraticaandP.pruinosa.Acta Phytopathologica Sinica, 2013, 43(3): 267- 273.

[33] Mo Y D.A Primary study on poplar scab ofPopuluseuphratica.Shanxi Forest Science and Technology, 2002, (2): 54- 55.

[34] Cao Z M, Du L, Wang Q H, Yu Z D.Genetic diversity of poplar rust fungus Melampsora larici-populina in China.Mycosystema, 2012, 31(4): 510- 522.

[35] Ayup M, Yimit H, Wang Z M, Ebeidul D.P.euphraticaecosystem fragility and protecting strategy on TarimP.euphraticanature reserve in Xinjiang.Journal of Water Resources &Water Engineering, 2007, 18(3): 30- 35.

[36] Zhang T, Sun J H.Aerial spray of Bt WP against Apocheima cinerarius in the natural forests ofpopuluseuphratica.Forest Pest and Disease, 2006, 25(3):38- 40.

[37] Mercado B J, Bakker P A H M.Interactions between plants and beneficialPseudomonasspp.: exploiting bacterial traits for crop protection.Antonie van Leeuwenhoek, 2007, 92(4): 367- 389.

[38] Fett W F.Inhibition of Salmonella enterica by plant-associatedpseudomonadsin vitro and on sprouting alfalfa seed.Journal of Food Protection, 2006, 69(4): 719- 728.

[39] Seveno N A, Morgan JAW, Wellington E M H.Growth ofPseudomonasaureofaciensPGS12 and the dynamics of HHL and phenazine production in liquid culture, on nutrient agar, and on plant roots.Microbial Ecology, 2001, 41(4): 314- 324.

[40] Haas D, Défago G.Biological control of soil-borne pathogens byfluorescentpseudomonads.Nature Reviews Microbiology, 2005, 3(4): 307- 319.

[41] Haas D, Keel C.Regulation of antibiotic production in root-colonizingPseudomonasspp. and relevance forbiological control of plant disease.Annual Review of Phytopathology, 2003, 41:117- 153.

[42] Bischoff K M, Wicklow D T, Jordan D B, De Rezende S T, Liu S Q, Hughes S R, Rich J O.Extracellular hemicellulolytic enzymes from the maize endophyte Acremonium zeae.Current Microbiology, 2009, 58(5): 499- 503.

參考文獻(xiàn):

[8] 程小玲,劉淑清.淺議塔里木胡楊保護(hù)區(qū)胡楊林的保護(hù).中南林業(yè)調(diào)查規(guī)劃, 2004, 23(1): 33- 35.

[9] 王世績(jī).全球胡楊林的現(xiàn)狀及保護(hù)和恢復(fù)對(duì)策.世界林業(yè)研究, 1996, 9(6): 37- 44.

[11] 陳亞寧, 李衛(wèi)紅, 陳亞鵬, 徐長(zhǎng)春, 張麗華.新疆塔里木河下游斷流河道輸水與生態(tài)恢復(fù).生態(tài)學(xué)報(bào), 2007, 27(2): 538- 545.

[12] 袁秀英, 石林, 胡達(dá)古拉, 劉慧, 呂洪麗.胡楊根際真菌與內(nèi)生真菌多樣性研究.西北林學(xué)院學(xué)報(bào), 2007, 22(6): 85- 88.

[13] 韓艷潔, 張秋良.胡楊根際土壤微生物區(qū)系研究.干旱區(qū)資源與環(huán)境.2008, 22(11): 185- 190.

[16] 馬麗艷木·阿木東,謝仁娜依·甫拉提, 卡依爾·玉素甫, 艾尼江·爾斯曼, 瑪麗帕·吐達(dá)洪, 程剛, 祖母拉提·阿布都熱依木, 艾爾肯·熱合曼, 木合塔·阿布都克里木.沙雅縣胡楊林土壤可培養(yǎng)細(xì)菌的多樣性分析.新疆農(nóng)業(yè)科學(xué).2011, 48(5): 832- 840.

[17] 祖母拉提· 阿布都熱依木.塔河廢棄古河道胡楊內(nèi)生酵母菌的多樣性分析及兩個(gè)新種的分類(lèi)學(xué)鑒定[D].烏魯木齊: 新疆大學(xué), 2012.

[18] 程剛.新疆尉犁縣胡楊內(nèi)生微生物群落多樣性的研究[D].烏魯木齊: 新疆大學(xué), 2012.

[22] 卡依爾·玉素甫, 謝仁娜依·甫拉提, 瑪麗帕·吐達(dá)洪, 馬麗艷木·阿木東, 艾尼江·爾斯曼, 祖母拉提· 阿布都熱依木, 艾爾肯·熱合曼.Ugan古河道胡楊可培養(yǎng)內(nèi)生細(xì)菌的多樣性.微生物學(xué)報(bào), 2011, 51(2): 178- 188.

[23] 劉剛, 翟朝陽(yáng).一種通用的從少量培養(yǎng)液中快速提取細(xì)菌染色體DNA的方法.西部醫(yī)學(xué), 2004, 16(2): 111- 113.

[24] 霍穎異, 許學(xué)偉, 王春生, 楊俊毅, 吳敏.浙蒼南近海沉積物細(xì)菌物種多樣性.生態(tài)學(xué)報(bào), 2008, 28(10): 5166- 5172.

[29] 黎明.新疆渭干河流域地下水開(kāi)采—生態(tài)環(huán)境保護(hù)研究[D].北京：中國(guó)地質(zhì)大學(xué), 2005.

[30] 肖婷.塔河胡楊林樹(shù)葉褐色斑點(diǎn)病原菌的分離鑒定及一株新種的分類(lèi)學(xué)鑒定[D].烏魯木齊: 新疆大學(xué), 2010

[31] 肖婷, 鄺海菊, 荷香, 藍(lán)曉君, 艾爾肯·熱合曼, 古麗斯瑪依·艾拜都拉.楊樹(shù)葉銹病研究.生物技術(shù), 2009, 19(5): 94- 96.

[32] 李倩, 谷思辰, 王玉麗, 李志軍, 李占林, 李建強(qiáng).胡楊和灰葉胡楊銹菌夏孢子形態(tài)和侵染結(jié)構(gòu)觀察.植物病理學(xué)報(bào), 2013, 43(3): 267- 273.

[33] 莫延德.胡楊幼苗黑星病初步研究.陜西林業(yè)科技, 2002, (2): 54- 55.

[34] 曹支敏, 杜林, 王秦虎, 余仲東.中國(guó)落葉松-楊柵銹菌遺傳多樣性研究.菌物學(xué)報(bào), 2012, 31(4): 510- 522.

[35] 木巴熱克·阿尤普, 海米提·依米提, 王智明, 迪麗拜爾.塔里木胡楊自然保護(hù)區(qū)胡楊生態(tài)系統(tǒng)脆弱性及其治理措施研究.水資源與水工程學(xué)報(bào), 2007, 18(3): 30- 35.

[36] 張濤, 孫建華.飛機(jī)噴灑Bt粉劑防治天然胡楊林春尺蠖技術(shù).中國(guó)森林病蟲(chóng), 2006, 25(3): 38- 40.

Temporal and spatial patterns of diversity and community structure of culturable endophytic bacteria isolated fromPopuluseuphraticawithin the rivers of the Tarim basin

Hormathan Mamtimin, Khayir Yusuf, Raziya Erkin, Buayshem Hamood, Nurimagbul Ismayil, Manziram Rozahon,Mahfuzem Abdurahman, Xangru MA, Erkin Rahman*

CollegeofLifeScienceandTechnology,XinjiangUniversity,Urumqi830046,China

The aim of this study was to clarify the temporal and spatial patterns of the bacterial diversity and community structure of endophytes isolated fromPopuluseuphraticabeside the Tarim, Kiyik (disused) and Ugan (disused) Rivers. The storage liquid in the stem ofPopuluseuphraticastands was gathered as the source for isolation of endophytic bacteria. For each river, eight stands of riparian forest were targeted and the storage liquid from 24 tree stems was sampled in early May and late September 2011. A total of 588 bacterial strains were isolated using four different types of culture media (LB, TSA, NA and King A). Phylogenetic analysis based on 16S rRNA gene sequences showed that the 588 isolates belonged toGammaproteobacteria(50.17%),Firmicutes(34.58%),Actinobacteria(10.17%),Alphaproteobacteria(4.24%),Bacteroidete(0.50%) andBetaproteobacteria(0.34%), encompassing 47 genera and 114 species. Of those isolates, the 16S rRNA gene sequences of 211 were <98% similar to 41 species within 19 genera that could be represented as potentially novel indigenous species.γ-proteobacteriaandFirmicuteswere the dominant groups inPopuluseuphraticastem liquid.PseudomonasandBacilluswere the most widely distributed and predominant genera, accounting for 29.76% and 19.05% of isolates, respectively. The most widely distributed and predominant novel indigenous species had < 98% 16S rRNA gene sequence similarity toPseudomonasxinjiangensis, representing 12.585% of all isolates. The Simpson′s diversity index of endophytic bacteria fromPopuluseuphraticawas highest for the disused Ugan River (0.969), then lower for the Tarim River (0.935) and the ancient disused Kivik River (0.931). These data showed that the cultivable endophytic bacteria ofPopuluseuphraticawere highly diverse, and similar among the three riparian forest ecosystems. The Shannon-Wiener uniformity index of endophytic bacteria fromPopuluseuphraticafrom the Ugan River was 0.8570, compared with 0.8314 and 0.7937 for the Tarim and Kiyik Rivers, respectively. The analysis of spatial and temporal variations in the endophytic bacterial community structure ofPopuluseuphraticafor the three ecosystems revealed that in general, the community structure of endophytic bacteria from each ecosystem was relatively intact, with some small impact from foreign common dominant bacteria. The bacterial community of the Kiyik River was the least impacted, with the highest abundance of bacterial species and potentially novel indigenous species (1/3.082 and 1/7.55, respectively), and a minor impact of replacement and cleaning and associated non-indigenous bacterial species. The Ugan River was next highest for abundance of bacterial species and potentially novel indigenous species (1/3.333, 1/12.857) and these values indicate that the bacterial community structure has changed to a certain extent. In contrast, the bacterial community isolated from the Tarim River had been intensively substituted, with the abundance of bacterial species and potentially novel indigenous species greatly decreased to 1/4.282 and 1/20.875, respectively. It is clear that non-indigenous microbes have had a large ecological impact on this bacterial community. Our combined results demonstrate that the endophytic bacterial community structure was influenced by human activity near these three rivers. Human activity stopped for the Kivik and Ugan Rivers after those rivers dried out. The period of time without human activity for the ancient Kiyik and Ugan Rivers has had a positive impact on the community structure of the bacterial population.

Tarim River; Kiyik River; Ugan River; Populus euphratica; endophytic bacteria; 16S rDNA; diversity; spatial and temporal variation

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31060002); 國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(U1203101); 新疆維吾爾自治區(qū)科技支疆項(xiàng)目(201091236)

2014- 01- 24;

2014- 08- 06

10.5846/stxb201401240174

*通訊作者Corresponding author.E-mail: erkin1106@163.com

吾爾麥提汗·麥麥提明，卡依爾·玉素甫，熱孜亞·艾肯，布阿依夏姆·阿木提，努麗曼姑·司馬義，買(mǎi)孜拉木·肉扎洪，麥合甫再木·阿布都熱合曼，馬相汝，艾爾肯·熱合曼.塔里木胡楊林可培養(yǎng)胡楊內(nèi)生細(xì)菌多樣性與群落結(jié)構(gòu)的時(shí)空演變格局.生態(tài)學(xué)報(bào),2014,34(22):6622- 6639.

Hormathan Mamtimin, Khayir Yusuf, Raziya Erkin, Buayshem Hamood, Nurimagbul Ismayil, Manziram Rozahon,Mahfuzem Abdurahman, Xangru MA, Erkin Rahman.Temporal and spatial patterns of diversity and community structure of culturable endophytic bacteria isolated fromPopuluseuphraticawithin the rivers of the Tarim basin.Acta Ecologica Sinica,2014,34(22):6622- 6639.