京郊番茄主要病毒病毒原鑒定

田兆豐， 劉偉成， 張濤濤， 董 丹， 羅 晨

(北京市農(nóng)林科學(xué)院植物保護環(huán)境保護研究所，北京 100097)

京郊番茄主要病毒病毒原鑒定

田兆豐， 劉偉成， 張濤濤， 董 丹， 羅 晨*

(北京市農(nóng)林科學(xué)院植物保護環(huán)境保護研究所，北京 100097)

近年來，番茄病毒病，特別是番茄黃化曲葉病毒(TYLCV)病在北京地區(qū)空前暴發(fā)，給番茄生產(chǎn)造成嚴(yán)重威脅，使番茄的產(chǎn)量和品質(zhì)顯著降低。2012-2013年在北京周邊7個區(qū)縣，采集疑似感染病毒的番茄植株樣品325份，分別針對TYLCV、煙草花葉病毒(TMV)、黃瓜花葉病毒(CMV)3種病毒進行了PCR或ELISA 檢測。檢測結(jié)果表明，目前在北京地區(qū)大棚或溫室內(nèi)發(fā)生的番茄病毒病以TYLCV為主；露地番茄病毒復(fù)合侵染現(xiàn)象比較普遍，病毒檢出率100%， 其中TYLCV檢出率達到75%以上。在TYLCV侵染的樣品中，TYLCV和CMV復(fù)合侵染占20%左右，TYLCV和TMV復(fù)合侵染占15%左右。部分樣品檢測到TYLCV、 CMV 和TMV 3種病毒復(fù)合侵染的現(xiàn)象。

番茄; 病毒病; 鑒定

番茄是重要的蔬菜作物，病毒病對番茄的危害一直都是番茄生產(chǎn)的重要制約因素。引起番茄病毒病的毒原有20多種，主要有煙草花葉病毒(Tobaccomosaicvirus，TMV)、黃瓜花葉病毒(Cucumbermosaicvirus，CMV)、馬鈴薯X病毒(PotatovirusX，PVX)和馬鈴薯Y病毒(PotatovirusY，PVY)[1-2]。20世紀(jì)90年代以來，由于氣候變暖和種植結(jié)構(gòu)的變化，導(dǎo)致煙粉虱傳播的雙生病毒在全球范圍內(nèi)大面積擴展和蔓延。在我國，影響番茄生產(chǎn)的主要病毒也由煙草花葉病毒、黃瓜花葉病毒演變?yōu)橛蔁煼凼瓊鞑サ姆腰S化曲葉病毒(Tomatoyellowleafcurlvirus, TYLCV)，并在近幾年來形成暴發(fā)性危害[3-6]。

番茄黃化曲葉病毒病在番茄生產(chǎn)中是一種毀滅性病害，由番茄黃化曲葉病毒引起。該病毒屬于雙生病毒科(Geminiviridae)，菜豆金色花葉病毒屬(Begomovirus)病毒，在自然條件下只能由煙粉虱(Bemisiatabaci)以持久方式傳播，又被稱為粉虱傳雙生病毒，是一類具有孿生顆粒形態(tài)的植物DNA病毒[7]。該病毒在番茄、木薯和煙草等重要經(jīng)濟作物上危害嚴(yán)重，在世界許多國家造成了巨大的經(jīng)濟損失[8]。

番茄黃化曲葉病毒1991年在我國廣西南寧市郊已有零星發(fā)生[5]，之后由南至北逐步擴展蔓延，危害日益嚴(yán)重，2005-2010年在全國多個省市發(fā)展蔓延并有逐年加重的趨勢[6，9-11]，其發(fā)生危害程度與煙粉虱的發(fā)生程度相關(guān)。番茄黃化曲葉病毒2009年在北京首次報道[12]，之后在北京周邊地區(qū)迅速蔓延開來，并在2009-2010年造成嚴(yán)重危害[13-14]，給菜農(nóng)帶來巨大經(jīng)濟損失。本課題組在工作實踐中發(fā)現(xiàn)，相對于保護地番茄，露地番茄病毒病的發(fā)生更為復(fù)雜，往往不只一種毒原，因此，于2012-2013年對北京周邊區(qū)縣的保護地和露地番茄栽培品種主要病毒病的發(fā)生情況進行了較為系統(tǒng)的調(diào)查，以期為病毒病的癥狀識別、毒原種類的鑒定、病毒病的防治和育種工作提供指導(dǎo)。

1 材料和方法

1.1 番茄樣品的采集

在2012年4月-2013年5月，分別于朝陽、大興、順義、懷柔、延慶、房山、密云等7個郊區(qū)縣的長子營、魏善莊、榆垡、青云店、大孫各莊、長哨營、韓村河、蟹島、小豐營、長陽、不老屯等地采集番茄樣品共計325份，樣品采集后當(dāng)日或次日進行檢測，或放于袋內(nèi)在4 ℃保存，并在1周內(nèi)進行檢測。

檢測TYLCV所用的陽性對照和健康對照番茄品種均為‘佳粉18號’。 陽性對照采自北京市房山區(qū)韓村河，健康對照番茄在試驗溫室的養(yǎng)蟲籠內(nèi)培養(yǎng)；經(jīng)PCR檢測，確定陽性樣品感染了TYLCV，健康樣品未感染TYLCV。

1.2 番茄黃化曲葉病毒的PCR檢測

1.2.1 番茄病葉總DNA的提取

采用天根公司生產(chǎn)的植物基因組DNA提取試劑盒，每個樣品取植物新鮮組織約100 mg或干重組織約30 mg，加入液氮充分研磨后提取，具體操作方法按天根生化科技有限公司試劑盒提供的操作步驟進行。最后將DNA洗脫在150 μL洗脫緩沖液(TE)中，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 PCR檢測

按TYLCV基因組特異性保守序列設(shè)計PCR引物序列TYLCV-R：5′-CCA ATA AGG CGT AAG CGT GTA GAC-3′和TYLCV-F：5′-ACG CAT GCC TCT AAT CCA GTG TA-3′,并由北京三博遠志生物技術(shù)有限公司合成，以提取的植物基因組總DNA為模板進行PCR擴增； PCR擴增體系為:模板<1 μL, TYLCV-R和TYLCV-F(10 μmol/L)各1 μL,2×Master Mix 12.5 μL,加ddH2O至終體積為20 μL。PCR反應(yīng)程序：預(yù)變性94 ℃ 2 min;變性94 ℃ 30 s、退火55 ℃ 45 s、 延伸72 ℃ 30 s，32個循環(huán);最后72 ℃ 延伸10 min，4 ℃保存。從PCR產(chǎn)物中取5 μL，以1.0%瓊脂糖凝膠(含Gold View)電泳分離，在凝膠成像系統(tǒng)上觀察結(jié)果，擴增序列大小約為 543 bp。

1.3 煙草花葉病毒、黃瓜花葉病毒的血清學(xué)鑒定

TMV、CMV的ELISA檢測采用雙抗體夾心(DAS-ELISA)檢測法。具體步驟參照安德珍生物技術(shù)(北京)有限公司ELISA試劑盒提供的步驟并稍作修改,使用酶聯(lián)檢測儀在405 nm波長下讀取吸光值A(chǔ)405。陰陽性指標(biāo)： 樣品A405≥2倍健康樣品A405為陽性，樣品A405<2倍健康樣品A405為陰性。

2 結(jié)果與分析

2.1 番茄樣品TYLCV病毒PCR檢測結(jié)果

圖1是部分番茄樣品的PCR檢測結(jié)果，其中生產(chǎn)上常見的感病品種‘仙客6號’的電泳條帶十分明顯，而生產(chǎn)上常用的抗病品種‘浙粉701’的條帶非常微弱。

圖1 部分番茄樣品的PCR檢測凝膠電泳結(jié)果Fig.1 PCR results for some tomato samples

不同地點番茄樣品的詳細(xì)檢測結(jié)果見表1。在這次調(diào)查中，北京周邊的7個區(qū)縣均有TYLCV的發(fā)生，無論是抗病還是感病品種均檢測到TYLCV的侵染，但不同品種間癥狀有所區(qū)別，病毒檢出率也有差異。TYLCV在感病品種上的癥狀比較典型，如‘仙客6號’發(fā)病初期新生葉由葉緣開始黃化，頂部葉片褪綠發(fā)黃、變小，隨后黃化區(qū)域向中脈擴展，最后整個葉片枯黃，邊緣上卷，同時還伴隨植株矮化，開花結(jié)果受阻；而多數(shù)抗病品種癥狀比較輕微，如‘浙粉701’，只是新葉呈現(xiàn)脈間失綠或花葉，與感病品種的癥狀差異較大，而與煙草花葉病毒引起的癥狀相似。

在不同地點采集的番茄感病品種‘仙客6號’、‘金棚1號’顯癥樣品的病毒檢出率均為100%，而抗病品種如‘浙粉701’、‘浙粉702’的癥狀不典型，有部分樣品未檢測到病毒?？傮w來看，在北京的大棚或溫室內(nèi)，番茄黃化曲葉病毒病的發(fā)生還是比較嚴(yán)重和普遍的。

表1 京郊地區(qū)保護地番茄TYLCV侵染的PCR檢測結(jié)果Table 1 PCR results of TYLCV on tomato plants in the greenhouse in Beijing suburbs

2.2 番茄樣品TYLCV、TMV、CMV復(fù)合侵染的檢測鑒定

露地番茄病毒病發(fā)病癥狀比較復(fù)雜，部分是由幾種病毒復(fù)合侵染造成。表2是對TYLCV、TMV、CMV 3種病毒復(fù)合侵染情況的檢測鑒定結(jié)果。

待測樣品采自露地番茄，其番茄病毒病的癥狀復(fù)雜、多樣，有些番茄的不同部位分別表現(xiàn)有蕨葉、花葉、黃化或壞死等癥狀。總體來看，感染TYLCV的癥狀主要表現(xiàn)為葉緣黃化合并卷曲;感染CMV主要表現(xiàn)為葉片蕨葉，而感染TMV主要表現(xiàn)為花葉、銹斑或壞死。由表2可見，TYLCV、CMV、TMV有2種甚至3種病毒復(fù)合侵染同一植株的現(xiàn)象，不同病毒特有的癥狀在同一植株上可以同時有所表現(xiàn)。如2、9號樣品組的植株同時表現(xiàn)了葉緣黃化和蕨葉，就是典型的TYLCV和CMV復(fù)合侵染后的癥狀，其樣品也同時檢測到了2種病毒的存在；檢測結(jié)果還發(fā)現(xiàn)， 2、9號樣品組雖然都測出了TYLCV和CMV，但這2組樣品中TYLCV的PCR條帶十分微弱，證明其病毒含量較低，這應(yīng)當(dāng)是復(fù)合侵染中2種病毒在營養(yǎng)和空間上相互競爭的結(jié)果；15號樣品組也表現(xiàn)了TYLCV和CMV 2種病毒復(fù)合侵染的癥狀，但15號樣品組的個別樣品只檢測出了TYLCV，還有個別樣品只檢測出了CMV。

表2 京郊露地番茄TYLCV、TMV、CMV復(fù)合侵染的檢測鑒定結(jié)果1)Table 2 Testing results for TYLCV, TMV and CMV mixed infection on tomato plants in Beijing suburbs

1) “+”，表示樣品A405≥2倍健康樣品A405，為陽性；“-”，表示樣品A405<2倍健康樣品A405，為陰性。
“+”indicated the positive results(whenA405for detected sample≥2×A405for healthy sample); “-”indicated the negative results(whenA405for detected sample <2×A405for healthy sample).

由檢測結(jié)果可見，露地番茄樣品病毒病檢出率100%， 其中TYLCV檢出率達到75%以上。在TYLCV侵染的樣品中，TYLCV和CMV復(fù)合侵染占20%左右，TYLCV和TMV復(fù)合侵染占15%左右。部分樣品檢測到TYLCV、 CMV 和TMV 3種病毒復(fù)合侵染的現(xiàn)象。

3 討論

過去幾十年中，我國發(fā)生的番茄病毒病以TMV、CMV、PVY、PVX為主[1-2]，自1991年番茄黃化曲葉病毒在廣西南寧發(fā)生以來[5]，逐步擴展蔓延，至今已經(jīng)上升為番茄上最嚴(yán)重的病毒病害。在這次調(diào)查的7個區(qū)縣的溫室大棚中TYLCV的發(fā)生率在90%以上,發(fā)病率60%～100%，CMV、TMV發(fā)生率為20%～30%，發(fā)病率10%左右。

番茄病毒病的發(fā)生與氣候、栽培條件等因素密切相關(guān)。煙草花葉病毒主要由農(nóng)事操作接觸傳播，但種子和土壤均可帶毒傳播[15]，過去春季溫室里的番茄以感染煙草花葉病毒TMV為主；黃瓜花葉病毒主要由蚜蟲以非持久方式傳播，也可機械傳播，病毒可在多年生宿根植物或雜草上越冬，然后傳播到番茄上[16]。溫度高、光照強、干旱的條件利于蚜蟲的繁殖和遷飛，因此利于CMV傳播和擴散[17]，所以，秋晚番茄以感染CMV為主。目前，煙粉虱已經(jīng)成為溫室常年發(fā)生并較難防治的主要害蟲，所以，溫室內(nèi)由煙粉虱以持久方式傳播的TYLCV為常年發(fā)生的主要病毒??；在露地，由于傳毒的昆蟲介體比較復(fù)雜，TYLCV、CMV、TMV 3種病毒的發(fā)生情況有所變化，CMV或TMV的發(fā)生率、發(fā)病率均顯著上升，而TYLCV的發(fā)生、發(fā)病率有所下降，而且有幾種病毒復(fù)合侵染的現(xiàn)象。

在調(diào)查中發(fā)現(xiàn)，北京地區(qū)近年來已經(jīng)開始栽種抗番茄黃化曲葉病毒的抗、耐病品種‘浙粉701’、‘浙粉702’、‘浙雜301’、‘中雜101’等[18-19]，但在發(fā)病嚴(yán)重的地塊仍可檢測到病毒的侵染，不過發(fā)病癥狀較輕，發(fā)病率和病情指數(shù)都較低，對番茄的產(chǎn)量和品質(zhì)影響較小；感病品種‘金棚1號’、‘仙客6號’等發(fā)病嚴(yán)重，發(fā)病率和病情指數(shù)都很高，目前栽培面積已經(jīng)減少；抗病品種‘浙粉701’、‘浙粉702’、‘中雜101’等栽培面積的擴大，對控制病情和阻止其蔓延起到了較好的效果。盡管如此，由于大棚、溫室的連作栽培使番茄種植茬口相接，導(dǎo)致徹底滅虱和清園工作存在一定困難，這也給病毒病的防治帶來一定的難度。

在露地番茄復(fù)合侵染現(xiàn)象中發(fā)現(xiàn)，當(dāng)番茄植株同時被TYLCV、CMV或TMV侵染時，同一植株上可以同時出現(xiàn)不同種病毒的癥狀，這些癥狀不是混合出現(xiàn)而是在植株的不同部位分別出現(xiàn)，說明復(fù)合侵染的這幾種不同病毒之間沒有交叉保護作用，但在同一植株內(nèi)仍然有空間競爭現(xiàn)象[20]。

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IdentificationofseveralmainvirusdiseaseoftomatoinBeijing

Tian Zhaofeng, Liu Weicheng, Zhang Taotao, Dong Dan, Luo Chen

(InstituteofPlant&EnvironmentProtection,BeijingAcademyofAgriculture&ForestrySciences,Beijing100097,China)

In recent years, tomato virus disease, especiallyTomatoyellowleafcurlvirus(TYLCV) disease in Beijing area occurred seriously, and the yield and quality of tomato reduced significantly. During 2012-2013, suspected virus infection samples of tomato collected in seven districts around Beijing were detected by PCR or ELISA for TYLCV,Tobaccomosaicvirus(TMV) andCucumbermosaicvirus(CMV), respectively. The results showed that TYLCV disease was dominant in the greenhouse. In the open field, the mixed infection of several virus was common, with the total detection rate up to 100%, in which the positive rate for TYLCV was over 75%. In the TYLCV infected samples, the mixed infection for TYLCV and CMV accounted around 20%, and about 15% for TYLCV and TMV. Some samples were found to be infected by the three viruses simultaneously.

tomato; virus disease; identification

2013-12-24

：2014-03-22

公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專項(201003065)；“十二五”國家科技支撐計劃(2012BAD19B00)；北京市自然科學(xué)基金(6122017)

S 436.412.11

：ADOI：10.3969/j.issn.0529-1542.2014.06.025

* 通信作者 E-mail:luochen1010@163.com