鐮刀菌對大蒜根系分泌物的敏感性與其致病力相關(guān)分析

張瀟丹, 廖靜靜, 鄧維萍, 宋冬冬, 梅 瓊, 朱書生, 楊 敏

(云南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)生物多樣性與病蟲害控制教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，昆明 650201)

鐮刀菌對大蒜根系分泌物的敏感性與其致病力相關(guān)分析

張瀟丹, 廖靜靜, 鄧維萍, 宋冬冬, 梅 瓊, 朱書生, 楊 敏*

(云南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)生物多樣性與病蟲害控制教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，昆明 650201)

試驗(yàn)采用菌絲生長速率法測定了大蒜根系分泌物對3種供試植物病原鐮刀菌的抑菌活性，并進(jìn)一步分析了18株從腐爛蒜瓣上分離的尖孢鐮刀菌和12株從小麥赤霉病樣分離的禾谷鐮刀菌對大蒜根系分泌物的敏感性及致病力之間的關(guān)系。研究結(jié)果表明，大蒜根系分泌物對供試鐮刀菌均具有抑制活性，但從腐爛蒜瓣上分離的尖孢鐮刀菌對根系分泌物的敏感性低于其他菌株。致病力分析結(jié)果表明，供試的18株尖孢鐮刀菌均能使蒜瓣發(fā)病，但致病力與其對根系分泌物的敏感性無明顯相關(guān)性；供試的禾谷鐮刀菌中對根系分泌物不敏感的4株菌株能侵染蒜瓣，但敏感性高的菌株不能侵染蒜瓣，且根系分泌物對禾谷鐮刀菌的抑制率與禾谷鐮刀菌致病力之間呈顯著的負(fù)相關(guān)。這表明大蒜根系分泌抑菌物質(zhì)是根系抵御鐮刀菌侵染的重要機(jī)制，但一些菌株能對根系分泌物產(chǎn)生抗性，從而侵染大蒜。綜上所述，大蒜根系分泌物對鐮刀菌具有抑制活性，可以利用大蒜和其他作物間作或輪作控制鐮刀菌枯萎病的發(fā)生和蔓延，但長期利用大蒜輪作或間作控制土傳病害可能面臨鐮刀菌對大蒜根系分泌物產(chǎn)生抗性，導(dǎo)致防效降低的風(fēng)險(xiǎn)。

大蒜； 根系分泌物； 尖孢鐮刀菌； 禾谷鐮刀菌； 敏感性； 致病力

鐮刀菌(Fusarium)寄主范圍廣，可引起植物根腐、莖腐、莖基腐、花腐和穗腐等多種病害，是生產(chǎn)上最難防治的病害之一[1]。目前用于防治鐮刀菌引起的土傳病害的方法主要有選育抗病品種[2-4]、化學(xué)防治[5-6]和生物防治[7]等，但對該病的防治效果均不理想。生產(chǎn)實(shí)踐表明，輪作和間作是減輕土傳病害的有效方法之一[8-9]。生產(chǎn)上尤其以蔥屬作物與其他作物間作或輪作對土傳病害的防治效果好[10-13]。已有研究表明，一些植物釋放的根系分泌物可以抑制病原菌的生長，減少土壤中土傳病原菌的數(shù)量，增加土壤中有益微生物的活性，從而達(dá)到控制土傳病害的效果[14-16]。大蒜具有廣譜的抑菌活性[17]，生產(chǎn)上利用大蒜輪作或間作能有效降低多種鐮刀菌引起的根腐病的危害，但生產(chǎn)中也發(fā)現(xiàn)大蒜輪作效果不穩(wěn)定、且大蒜自身也能被病原菌侵染致病等現(xiàn)象，這可能與病原菌對大蒜根系分泌物的敏感性差異有關(guān)。本試驗(yàn)以大蒜和非大蒜上分離的鐮刀菌為研究對象，分析鐮刀菌對大蒜根系分泌物的敏感性差異及其致病力之間的關(guān)系，以期為合理地利用大蒜間作和輪作控制土傳病害的發(fā)生和蔓延提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 供試大蒜

白皮蒜(AlliumsativumLinn.)蒜瓣，市售。

1.1.2 供試病原菌

本試驗(yàn)供試鐮刀菌分別為從黃瓜、小麥、水稻、甘藍(lán)、大蒜上分離的鐮刀菌(表 1)。

表1 供試鐮刀菌Table 1 Fusarium isolates for testing

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 大蒜根系分泌物的收集

1.2.1.1根系分泌物自動(dòng)連續(xù)收集

參照Tang的方法[18-19]，利用自制的根系分泌物連續(xù)收集裝置收集大蒜根系分泌物。首先，將顆粒飽滿，大小均一的新鮮蒜瓣置于4 ℃冰箱中低溫催芽處理96 h；選擇出芽長度一致的蒜瓣進(jìn)行表面消毒后播入無底玻璃瓶中的石英砂內(nèi)培養(yǎng)。玻璃瓶中的石英砂需要用2 mol/L的HCl浸泡24 h后用自來水沖洗后置于干熱滅菌器中160 ℃滅菌4 h；玻璃瓶底部用玻璃棉隔離，避免石英砂隨液體流出。玻璃棉需先在2 mol/L的HCl中浸泡24 h，用自來水沖洗干凈。播種大蒜后將玻璃管的閥門關(guān)閉，用Hoagland營養(yǎng)液灌入無底玻璃瓶至石英砂飽和。從第2周開始每周澆1次1倍Hoagland營養(yǎng)液至石英砂飽和。培養(yǎng)20 d后，放出營養(yǎng)液殘汁，先用去離子水沖洗4次，再用無菌水沖洗2次，然后組裝根系分泌物收集裝置，進(jìn)行分泌物的連續(xù)收集。將XAD-4中性交換樹脂(Sigma)經(jīng)甲醇淋洗后用甲醇浸泡直至裝柱。循環(huán)收集大蒜的根系分泌物3 d；取下樹脂填充柱，以甲醇洗脫4次，收集洗脫液，使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀進(jìn)行減壓蒸干，再加入5 mL CH2Cl2溶解，用0.45 μm的有機(jī)相濾膜過濾后，作為根系分泌物母液于4 ℃冰箱避光保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.1.2砂培法收集

參照Shen的方法[20]，利用砂培法收集大蒜根系分泌物。首先，砂培大蒜，處理方法同上。待大蒜生長20 d后，將玻璃管的閥門打開，放出營養(yǎng)液殘汁，同樣先用去離子水沖洗4次，再用無菌水沖洗2次。在無底玻璃瓶中加入蒸餾水培養(yǎng)大蒜，保持水面與石英砂表面平齊，待大蒜生長3 d后，打開玻璃管閥門，收集培養(yǎng)液。用CH2Cl2萃取培養(yǎng)液，并在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上濃縮，方法同上。得到根系分泌物母液，于4 ℃冰箱避光保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.1.3有機(jī)溶劑蘸根法收集

參照賈黎明等的方法[21]，利用有機(jī)溶劑蘸根法收集大蒜根系分泌物。首先，砂培大蒜，處理方法同上。待大蒜生長20 d后，取出大蒜，清除大蒜根部的石英砂，盡量不傷及根部，把根部放入含有0.5%乙酸的CH2Cl2提取液中浸泡3 s。然后過濾提取液，在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上濃縮，處理方法同上。得到根系分泌物母液，于4 ℃冰箱避光保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 不同方法收集的大蒜根系分泌物對供試鐮刀菌的抑菌活性測定

采用菌落直徑法測定大蒜根系分泌物對供試鐮刀菌的抑菌活性。將不同方法收集的大蒜根系分泌物按照0.01 mL/mL的比例混入PDA培養(yǎng)基中，制成含有大蒜根系分泌物的PDA平板。然后，沿生長4 d的菌落邊緣打取直徑為0.5 cm的菌餅，將菌餅接種于培養(yǎng)基中央，以加同樣比例CH2Cl2的PDA平板作為對照，每一濃度設(shè)置3次重復(fù)。置于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)黑暗培養(yǎng)，培養(yǎng)3～5 d后，待空白對照菌落長至培養(yǎng)皿的2/3左右，采用“十字交叉法”測量菌落直徑。

1.2.3 大蒜根系分泌物對禾谷鐮刀菌及尖孢鐮刀菌的抑制活性測定

根系分泌物連續(xù)收集法收集的母液分別以0.002、0.01、0.05 mL/mL的比例加入40 ℃的PDA培養(yǎng)基中搖勻制成平板。然后，沿生長4 d的鐮刀菌菌落邊緣打取直徑為0.5 cm的菌餅，將菌餅接種于培養(yǎng)基中央，以加同樣比例CH2Cl2的PDA平板作為對照，每一濃度設(shè)置3次重復(fù)。培養(yǎng)3～5 d后，待空白對照菌落長至培養(yǎng)皿的2/3左右，采用十字交叉法測量菌落直徑。

1.2.4 供試禾谷鐮刀菌及尖孢鐮刀菌對大蒜鱗莖的致病力測定

試驗(yàn)采用菌餅接種法，通過傷口和非傷口兩種方式測定供試鐮刀菌對大蒜鱗莖的致病力。首先選取健康大蒜鱗莖，在超凈工作臺(tái)中去皮，用3%次氯酸鈉表面消毒，再用無菌水沖洗3次后置于滅菌的濾紙上。傷口接種方法為用滅菌的解剖刀在大蒜鱗莖基部斜面削一平面?zhèn)?，沿生長4 d的供試菌株菌落邊緣打取直徑為0.5 cm的菌餅，將菌餅接種于傷口位置。非傷口接種方法為將菌餅直接接種于健康大蒜鱗莖表面。接種后的大蒜鱗莖置于培養(yǎng)皿內(nèi)用無菌水潤濕的吸水紙上，于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)黑暗培養(yǎng)，培養(yǎng)4 d后測量病斑面積。

1.2.5 數(shù)據(jù)分析

利用十字交叉法測量出菌株的菌落生長直徑，求出各平均值帶入公式計(jì)算。

抑制率(%)=

利用Excel 2003軟件分析供試菌株對大蒜根系分泌物的敏感性及其對大蒜鱗莖的致病力之間的相關(guān)性。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同方法收集的根系分泌物的抑菌活性差異

試驗(yàn)利用根系分泌物自動(dòng)連續(xù)收集裝置、砂培法和有機(jī)溶劑蘸根法3種方法收集了大蒜根系分泌物，并比較了其抑菌活性。結(jié)果表明(表2)，在1%根系分泌物濃度條件下，3種方法收集到的大蒜根系分泌物對鐮刀菌菌株生長的抑制率差異極顯著(P<0.01)，利用自動(dòng)連續(xù)收集裝置收集獲得的根系分泌物抑菌活性最高，砂培法次之，有機(jī)溶劑蘸根法獲得的根系分泌物抑菌活性最低，甚至?xí)龠M(jìn)鐮刀菌的生長。鐮刀菌不同菌株間對根系分泌物的敏感性存在差異，供試菌株Fg409、FoB和FoC對根系分泌物的敏感性高于菌株FoG和Fm。

2.2 供試禾谷鐮刀菌和尖孢鐮刀菌對大蒜根系分泌物的敏感性及其致病力測定

試驗(yàn)進(jìn)一步分析了從小麥赤霉病樣上分離的12株禾谷鐮刀菌和從腐爛蒜瓣上分離的18株尖孢鐮刀菌對采用自動(dòng)連續(xù)收集裝置收集的大蒜根系分泌物的敏感性差異。結(jié)果表明(表3)，不同禾谷鐮刀菌對根系分泌物的敏感性差異較大。當(dāng)根系分泌物濃度為0.002 mL/mL時(shí)抑制率為2.2%～49.1%，平均抑制率為26.62%；濃度為0.01 mL/mL時(shí)抑制率為3.9%～54.3%，平均抑制率為31.71%；濃度為0.05 mL/mL時(shí)抑制率為5.2%～57.8%，平均抑制率為39.58%。供試尖孢鐮刀菌對根系分泌物的敏感性低于禾谷鐮刀菌，且對根系分泌物的敏感性分布較為集中(表3)。當(dāng)根系分泌物濃度為0.002 mL/mL時(shí)抑制率為4.1%～19.2%，平均抑制率為9.8%；濃度為0.01 mL/mL時(shí)抑制率為18.4%～29.2%，平均抑制率為24.5%；當(dāng)濃度為0.05 mL/mL時(shí)抑制率為20.5%～29.2%，平均抑制率為26.1%。

表2 三種方法收集到的大蒜根系分泌物對鐮刀菌的抑制活性1)Table 2 The inhibition activity of garlic root exudates collected with three methods to Fusarium isolates

1) 平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤后不同字母表示具有極顯著差異(P<0.01)。該抑制率是在根系分泌物濃度為1%的條件下測定獲得。
Data are mean ± SE.Different letters in the same column indicate significant difference by Duncan’s test(P<0.01). The strain growth inhibition of garlic root exudates was tested at the concentration of 1%.

尖孢鐮刀菌和禾谷鐮刀菌對大蒜鱗莖的致病力測定結(jié)果表明(表3)，兩種鐮刀菌只能通過傷口侵染。從腐爛蒜瓣上分離的尖孢鐮刀菌均能致病，但致病力存在差異。供試的禾谷鐮刀菌除Fg204、Fg471、Fg379和Fg353不能致病外，其他禾谷鐮刀菌也能侵染大蒜鱗莖。

表3 大蒜根系分泌物對供試鐮刀菌的抑制活性及鐮刀菌對大蒜鱗莖的致病力Table 3 The inhibition activity of garlic root exudates to Fusarium isolates and the pathogenicity of Fusarium to garlic bulb

2.3 禾谷鐮刀菌和尖孢鐮刀菌對大蒜根系分泌物的敏感性與其致病力相關(guān)性分析

供試禾谷鐮刀菌對大蒜根系分泌物的敏感性與其致病力相關(guān)性分析結(jié)果表明(圖1)，根系分泌物濃度為0.002、0.01、0.05 mL/mL時(shí)，大蒜根系分泌物對禾谷鐮刀菌的抑制率與禾谷鐮刀菌侵染大蒜的病斑面積之間的相關(guān)系數(shù)分別為-0.700 4、-0.657 6、-0.684 3，表現(xiàn)顯著負(fù)相關(guān)(P≤0.05)。因此，不同濃度的根系分泌物對禾谷鐮刀菌的抑制率與禾谷鐮刀菌的致病力之間均呈負(fù)相關(guān)，即隨著根系分泌物對禾谷鐮刀菌抑制活性增加，菌株對大蒜鱗莖的致病力降低。

圖1 大蒜根系分泌物對禾谷鐮刀菌的抑制率與禾谷鐮刀菌對大蒜致病力相關(guān)分析Fig.1 The correlation analysis between the inhibition rate of F. graminearum to garlic root exudates and the virulence of F. graminearum to garlic bulb

供試尖孢鐮刀菌對大蒜根系分泌物的敏感性與其致病力相關(guān)性分析結(jié)果表明(圖2)，供試尖孢鐮刀菌對大蒜鱗莖均能致病，但其對根系分泌物的敏感性與其對大蒜鱗莖的致病力間無明顯相關(guān)性。

圖2 大蒜根系分泌物對尖孢鐮刀菌的抑制率與尖孢鐮刀菌對大蒜致病力相關(guān)分析Fig.2 The correlation analysis between the inhibition rate of F. oxysporum to garlic root exudates and the virulence of F. oxysporum to garlic bulb

3 結(jié)論與討論

本研究結(jié)果表明，大蒜根系分泌物對引起作物病害的尖孢鐮刀菌及禾谷鐮刀菌等均具有抑制活性。試驗(yàn)比較了利用根系分泌物自動(dòng)連續(xù)收集裝置、砂培法和有機(jī)溶劑蘸根法收集的大蒜根系分泌物的抑菌活性，自動(dòng)連續(xù)裝置收集的根系分泌物抑菌活性最高，砂培法次之，有機(jī)溶劑蘸根法最低。這與不同的收集方法對根系分泌物的富集程度有關(guān)，自動(dòng)連續(xù)收集裝置采用的XAD-4樹脂對根系分泌物中的疏水化合物具有吸附效應(yīng)。眾多的研究表明，植物根系能分泌抑菌物質(zhì)抵御病原菌的侵染[15-16,22]。Bais等將擬南芥根系分泌的抑菌物質(zhì)用活性炭吸附后，對根系分泌抑菌物質(zhì)非常敏感的非寄主病原菌(Pseudomonassyringaepv.phaseolicola)也能使擬南芥致病[23]。大蒜根系分泌物具有抑菌活性可能與其含有大蒜素類物質(zhì)有關(guān)。大蒜中含有的主要抑菌活性物質(zhì)是大蒜素及其降解產(chǎn)物，這些化合物具有廣譜的抑菌活性[24-26]。大蒜素也能通過根系分泌物釋放到根際環(huán)境中[27]，本研究收集的根系分泌物具有抑菌活性可能也與這些化合物有關(guān)。因此，生產(chǎn)上利用大蒜間作或輪作能控制鐮刀菌引起的根腐病與根系分泌抑菌物質(zhì)有關(guān)。

本試驗(yàn)從腐爛蒜瓣上分離的尖孢鐮刀菌對根系分泌物的敏感性明顯低于從小麥上分離的禾谷鐮刀菌，這表明鐮刀菌對大蒜根系分泌物也能產(chǎn)生抗性。因此，在利用大蒜與其他作物間作或輪作控制鐮刀菌引起的病害的過程中也面臨鐮刀菌對根系分泌物產(chǎn)生抗性，從而防效降低的風(fēng)險(xiǎn)。進(jìn)一步分析表明，從小麥上分離的禾谷鐮刀菌多數(shù)菌株對大蒜根系分泌物敏感且對大蒜鱗莖不致病，但一些敏感性低的菌株也能侵染蒜瓣。這表明禾谷鐮刀菌對根系分泌物產(chǎn)生抗性后也具有致病能力。前人的研究也表明，病原菌對寄主抗菌物質(zhì)的抗性與致病力有關(guān)，病原菌可以通過代謝解毒、有毒物質(zhì)外排等機(jī)制降低植物分泌的抗菌物質(zhì)對其產(chǎn)生的危害，從而增強(qiáng)病原菌侵染植物的能力[28]。該結(jié)果表明，鐮刀菌對大蒜根系分泌物的抗性是其具有致病能力的重要因素之一。

綜上所述，大蒜根系分泌物對引起大蒜腐爛的尖孢鐮刀菌和引起小麥赤霉病的禾谷鐮刀菌均具有抑菌活性，但對引起蒜瓣腐爛的尖孢鐮刀菌的抑菌能力顯著低于引起小麥赤霉病的禾谷鐮刀菌，且禾谷鐮刀菌中對大蒜根系分泌物敏感性低的菌株對蒜瓣也具有致病能力。這表明利用大蒜根系分泌抗菌物質(zhì)的特性進(jìn)行間作或輪作可以防治由鐮刀菌引起的土傳病害，但長期種植也可能面臨鐮刀菌對大蒜根系分泌物產(chǎn)生抗性，從而防效降低的風(fēng)險(xiǎn)。

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CorrelationanalysisofthesensitivityofFusariumspp.togarlicrootexudatesandtheirpathogenicitytogarlicbulb

Zhang Xiaodan, Liao Jingjing, Deng Weiping, Song Dongdong, Mei Qiong, Zhu Shusheng, Yang Min

(KeyLaboratoryofAgriculturalBiodiversityforPlantDiseaseManagement,MinistryofEducation,YunnanAgriculturalUniversity,Kunming650201,China)

The method of mycelia growth rate was used to determine the antifungal activity of garlic root exudates to theFusariumisolates, and the relationships between the pathogenicity of 18F.oxysporumisolates from rotten garlic and 12F.graminearumisolates from wheat scab samples and their sensitivity to garlic root exudates were analyzed. The results indicated that the root exudates of garlic showed antifungal activity to allFusariumisolates. However, the isolates ofF.oxysporumfrom rotten garlic showed lower sensitivity to the root exudates. Pathogenicity tests showed that the 18 isolates ofF.oxysporumfrom rotten garlic could infect garlic, but there was no correlation between the sensitivity ofF.oxysporumisolates and their pathogenicity to garlic. Only four isolates ofF.graminearumwith low sensitivity exhibited pathogenicity to garlic, but the isolates ofF.graminearumwith high sensitivity could not infect garlic. In addition, there was an apparent negative correlation between antifungal activity of garlic root exudates and pathogenicity ofF.graminearumto the garlic. These results indicated that the exudation of inhibitive ingredients in garlic roots was the important defence mechanism of garlic roots againstFusariuminfection, but some strains could generate resistance to the garlic root exudates. Based on this study, it is known that the root exudates of garlic showed antifungal activity toF.oxysporumandF.graminearum, so garlic may be used for control of root disease by intercropping and rotation with other crops. But after long-term intercropping or rotation with other crops, there might be a risk thatFusariumcould generate resistance to the garlic root exudates, causing lower control effect.

garlic; root exudate;Fusariumoxysporum;Fusariumgraminearum; sensitivity; pathogenicity

2013-12-09

：2014-05-30

國家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目(2011CB100400)；國家自然科學(xué)基金(31260447)

S 482.292

：ADOI：10.3969/j.issn.0529-1542.2014.06.010

* 通信作者 Tel:0871-65220591，E-mail：yangminscnc@126.com