蘋果脫毒技術(shù)研究進(jìn)展

胡國(guó)君， 董雅鳳， 張尊平， 范旭東， 任 芳， 朱紅娟

(中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹研究所國(guó)家落葉果樹脫毒中心，興城 125100)

蘋果脫毒技術(shù)研究進(jìn)展

胡國(guó)君， 董雅鳳*， 張尊平， 范旭東， 任 芳， 朱紅娟

(中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹研究所國(guó)家落葉果樹脫毒中心，興城 125100)

蘋果(MaluspumilaMill.)普遍感染病毒。目前，培育無(wú)病毒原種母本樹，建立用于繁殖接穗和營(yíng)養(yǎng)系砧木的母本園，栽植無(wú)病毒苗木，是防治病毒病的根本措施。本文針對(duì)常見的4 種蘋果病毒及1 種類病毒，綜述了莖尖培養(yǎng)、熱處理、化學(xué)處理、微莖尖嫁接以及低溫處理脫除蘋果病毒方法的研究進(jìn)展，分析了不同方法的應(yīng)用效果，及所適合脫除的病毒種類，以期為我國(guó)蘋果病毒脫除技術(shù)研究提供參考信息。

蘋果； 病毒； 脫除

蘋果(MaluspumilaMill.)是世界范圍內(nèi)廣泛種植的果樹，研究表明，我國(guó)栽植的蘋果普遍感染多種病毒[1-2]。蘋果花葉病毒(Applemosaicvirus, ApMV)、蘋果褪綠葉斑病毒(Applechloroticleafspotvirus, ACLSV)、蘋果莖痘病毒(Applestempittingvirus, ASPV)和蘋果莖溝病毒(Applestemgroovingvirus, ASGV)是侵染蘋果的最常見病毒[3]。ApMV隸屬雀麥花葉病毒科(Bromoviridae)、等軸不穩(wěn)定環(huán)斑病毒屬(Ilarvirus)，是蘋果上的重要病毒，蘋果感病后在葉片上出現(xiàn)大小不一的鮮黃色或黃白色斑塊，形成花葉，還可能出現(xiàn)沿葉脈褪綠黃化的網(wǎng)紋型癥狀[4-5]。ACLSV、ASGV和ASPV分別隸屬β線形病毒科(Betaflexiviridae)的纖毛病毒屬(Trichovirus)、發(fā)線病毒屬(Capillovirus)和凹陷病毒屬(Foveavirus)[6]，3 種病毒在多數(shù)蘋果栽培品種中呈潛隱性，不表現(xiàn)癥狀，只在少數(shù)感病品種或指示植物上表現(xiàn)癥狀[1]。ACLSV可引起‘俄羅斯小蘋果’畸形，葉片變小，褪綠斑和線紋等癥狀[7]。ASGV可引起木本指示植物‘弗吉尼亞小蘋果’產(chǎn)生莖溝槽、嫁接口腫大、不親和等典型癥狀[8]。ASPV可引起‘光輝’蘋果植株矮小、葉片反卷，以及‘Spy 227’長(zhǎng)勢(shì)衰弱[9]。此外，蘋果上還有一種重要的類病毒，蘋果銹果類病毒(Applescarskinviroid, ASSVd)，可引起蘋果的銹果病。1934年，銹果病在我國(guó)蘋果中首次發(fā)現(xiàn)，給我國(guó)蘋果產(chǎn)業(yè)造成了嚴(yán)重?fù)p失，20世紀(jì)50年代，遼寧省有數(shù)以萬(wàn)計(jì)的蘋果樹感染了該病害[10-12]。

在我國(guó)蘋果主要栽培區(qū)，上述3 種蘋果潛隱病毒的帶毒株率高達(dá)80% ～ 100%[1]，每年使蘋果減產(chǎn)約17% ～ 40%[3]。帶病毒和無(wú)病毒樹對(duì)比試驗(yàn)結(jié)果顯示，感病后蘋果果實(shí)畸形、變小、著色不良、風(fēng)味淡、不耐貯藏，商品果率下降16.9% ～ 60.0%；果實(shí)內(nèi)可溶性固形物、總糖、還原糖及Ca、Fe、Mn 含量下降，果肉硬度降低；樹體內(nèi)含物質(zhì)GA3、CTK、IAA、RNA 和蛋白質(zhì)含量降低，DNA含量升高；總光合強(qiáng)度及凈光合強(qiáng)度下降，呼吸強(qiáng)度升高；葉片變小、畸形、失綠，營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)受阻；樹高、干徑、冠徑和一年生枝長(zhǎng)勢(shì)減弱，坐果率和產(chǎn)量降低，總生長(zhǎng)量減少16% ～ 40%。如果土壤貧瘠、水肥欠缺、管理不善或利用了對(duì)病毒較敏感的砧木和品種時(shí)，會(huì)使植株衰弱死亡，造成果園殘缺不全，甚至全園毀滅[13-15]。蘋果病毒主要通過(guò)嫁接傳染，隨帶毒繁殖材料(如苗木、接穗、營(yíng)養(yǎng)系砧木等)遠(yuǎn)距離傳播擴(kuò)散，迄今尚未發(fā)現(xiàn)任何傳毒介體。蘋果一旦感染病毒，就很難防治。目前，采用脫毒技術(shù)，培育無(wú)病毒原種，建立用于繁殖接穗和營(yíng)養(yǎng)系砧木的母本園，栽植無(wú)病毒苗木，加強(qiáng)病毒檢疫，是防治病毒病的根本措施[16-17]。本文針對(duì)常見的蘋果病毒，綜述了莖尖培養(yǎng)、熱處理、化學(xué)處理、微莖尖嫁接等蘋果病毒脫除方法的研究進(jìn)展，以期為我國(guó)蘋果病毒脫除技術(shù)研究提供參考信息。

1 微莖尖嫁接(shoot-tip micrografting)

隨著嫁接材料和方式的不斷改進(jìn)，發(fā)展出了微莖尖嫁接技術(shù)，主要是將微小的莖尖嫁接到砧木上[18-20]。White[21]在20 世紀(jì)30 年代初提出，病毒在植物體內(nèi)的分布不均一, 植物頂端分生組織幾乎沒有病毒。之后，微莖尖嫁接技術(shù)在病毒的脫除研究中得到應(yīng)用[22]。柑橘是最早通過(guò)該技術(shù)獲得無(wú)病毒植株的樹種[23]。20 世紀(jì)80 年代，獲得了蘋果的無(wú)毒植株[24]。研究表明，接穗的大小與病毒的脫除率成反比，與嫁接成活率成正比，一般離體接穗大小為含2個(gè)葉原基的莖尖[24]。

2 莖尖培養(yǎng)(shoot tip culture)

植物莖尖處存在一個(gè)直徑為0.1 mm，長(zhǎng)為0.25 mm的無(wú)毒區(qū)，此外，愈傷組織中也存在大量的健康細(xì)胞，這是進(jìn)行莖尖培養(yǎng)脫毒的依據(jù)[25-26]。人們最初認(rèn)為莖尖不含病毒是因?yàn)轫敹朔稚M織分化速度快、生長(zhǎng)旺，且不含維管束，病毒很難到達(dá)[27]。現(xiàn)在有研究認(rèn)為，莖尖無(wú)毒區(qū)的存在可能是由于病毒在具有分生能力的莖尖細(xì)胞中發(fā)生了RNA沉默[28]。脫毒過(guò)程中，莖尖培養(yǎng)脫毒效果的高低，主要取決于切取的莖尖大小，莖尖大于0.2 mm難以脫除病毒。

通常，單獨(dú)莖尖培養(yǎng)的脫毒效率較低，王煥玉等[16]采用莖尖培養(yǎng)的方法進(jìn)行蘋果病毒的脫除研究，莖尖的大小為0.1～0.2 mm，雖然獲得了‘千秋’和‘長(zhǎng)富’2個(gè)品種的無(wú)毒植株，但平均脫毒率只有30%。然而，莖尖培養(yǎng)對(duì)脫除ApMV的效果較好，Plopa和Preda[29]切取1 mm莖尖能獲得無(wú)ApMV的再生植株，‘金冠’、‘蘭蓬王’和‘Golden Spur’3 個(gè)品種的ApMV脫除率分別為 83%、80%和77%，此外，根尖(0.3 mm)培養(yǎng)也能獲得無(wú)毒的再生植株，3 個(gè)品種的脫毒率為50% ～ 58%。

3 熱處理脫毒(thermotherapy)

病毒在植株中的濃度代表復(fù)制和降解的平衡，而升高溫度可以促進(jìn)寄主對(duì)病毒的降解。自Kunkel[30]發(fā)現(xiàn)34.4 ℃和36.3 ℃對(duì)桃樹的黃化病和叢枝病有抑制作用后，采用高溫進(jìn)行病毒脫除的技術(shù)逐漸被建立起來(lái)。熱處理脫毒主要是依據(jù)病毒和寄主細(xì)胞對(duì)高溫忍耐性不同，選擇適當(dāng)?shù)臏囟群吞幚頃r(shí)間，可抑制病毒繁殖、延緩其擴(kuò)散速度，使寄主細(xì)胞的生長(zhǎng)速度超過(guò)病毒擴(kuò)散速度，從而在這一高溫下長(zhǎng)出的新植株、器官或組織都有可能不帶有病毒[31]。關(guān)于熱處理脫毒的機(jī)理還不是很明確，最初，人們普遍認(rèn)為病毒的鈍化溫度是高溫能夠脫除病毒的主要原因，后來(lái)，也有研究表明高溫與植物體內(nèi)的防御酶關(guān)系密切[32]。最近，一些學(xué)者在研究溫度與癥狀表現(xiàn)的關(guān)系時(shí)發(fā)現(xiàn)，在高溫條件下病毒產(chǎn)生的siRNA量急劇增加，所以推測(cè)熱處理脫毒可能與RNA沉默有關(guān)[33]。最初的熱處理脫毒是將感病植株懸掛在熱處理箱上進(jìn)行高溫處理。一般來(lái)說(shuō)，熱處理的溫度越高，脫毒率越高，但是苗木的死亡率也高。在蘋果的熱處理脫毒研究中，根據(jù)處理材料不同，可分為盆栽苗熱處理和試管苗熱處理，處理完成后一般進(jìn)行嫩梢嫁接或莖尖培養(yǎng)。

3.1 試管苗熱處理

主要是指將離體的蘋果試管苗在高溫條件下進(jìn)行熱處理。處理結(jié)束后，切取一定大小的莖尖再進(jìn)行組織培養(yǎng)，獲得再生植株。

一般采用37～39 ℃的高溫，處理20～30 d，然后切取0.3～1 mm的莖尖，就可獲得無(wú)毒的蘋果再生植株[4, 15, 34]。蘇佳明等[35]將‘紅將軍’蘋果的試管苗在38 ℃高溫條件下恒定熱處理20 d， ASGV、ASPV、ApMV和ACLSV 等病毒的脫毒率達(dá)86.4%～100%。根據(jù)處理溫度的不同，試管苗熱處理可分為恒溫和變溫兩種形式，恒溫?zé)崽幚淼牟《久摮氏鄬?duì)高，但是死亡率也較高，變溫?zé)崽幚砻摮氏鄬?duì)較低，但有利于延長(zhǎng)苗木在處理期間的壽命[36]。程玉琴等[36]恒溫38 ℃處理蘋果品種‘小金海棠’20 d，ACLSV和ASGV的脫除率分別為86.7%和73.3%；而變溫38 ℃/22 ℃處理30 d，兩種病毒的脫除率分別為73.3%和60.0%。不同蘋果品種的耐熱性不同，脫除率也存在差異，研究表明，恒溫39 ℃處理6 d可完全脫除蘋果品種‘Idared’中的病毒，但對(duì)‘Sampion’中的病毒幾乎未產(chǎn)生作用[37]。當(dāng)莖尖在一定長(zhǎng)度范圍內(nèi)(約1 mm)時(shí)，莖尖成活率與試材、熱處理方式、處理時(shí)間等無(wú)明顯關(guān)系, 而與培養(yǎng)溫度等外界條件的關(guān)系密切[38]。

3.2 盆栽苗熱處理

主要是指將盆栽的蘋果苗在高溫條件下進(jìn)行熱處理。一般處理結(jié)束后，切取一定大小的嫩梢(1～2 cm)進(jìn)行嫁接，或是切取一定大小的莖尖(1～2 mm)進(jìn)行組織培養(yǎng)。

研究表明，盆栽苗經(jīng)熱處理后，病毒癥狀將明顯減弱。Welsh和Nyland[39]將盆栽的蘋果植株先在35 ℃處理7 d，再在38 ℃條件下處理7 d，然后將芽嫁接到新的砧木上，可抑制‘弗吉尼亞小蘋果’上的莖痘、‘Spy 227’的樹皮壞死、‘蘭蓬王’蘋果上的木質(zhì)部膠化以及‘海棠’子葉和莖尖上的癥狀。通過(guò)比較發(fā)現(xiàn)，熱處理后莖尖培養(yǎng)的病毒脫除率高于嫩梢嫁接的脫毒率。王煥玉等[16]將‘金冠’、‘紅星’和‘國(guó)光’3 個(gè)蘋果品種的盆栽苗在(37 ± 1) ℃條件下恒溫?zé)崽幚恚?5～28 d后切取1.0～1.5 cm嫩梢嫁接到實(shí)生砧木上，成活植株中3 種潛隱病毒的脫除率為27%～45%；而同樣的熱處理?xiàng)l件下，莖尖培養(yǎng)再生植株的脫毒率可達(dá)100.0%[40-41]。除潛隱病毒外，盆栽苗熱處理對(duì)ApMV的脫除效果也較好，Bhardwaj等[42]研究表明，37 ℃處理4周或是40 ℃處理2 周即可完全脫除蘋果上的ApMV。

4 化學(xué)處理(chemotherapy)

植物的抗病毒基因與抗其他病原菌的基因不同，不是由單一的顯性性狀控制，不能被優(yōu)先遺傳，因此，一般化學(xué)防治所用的化學(xué)試劑不能控制病毒病害[43]。目前，從病毒的吸附、滲透、脫衣殼到核酸復(fù)制和蛋白質(zhì)合成的各個(gè)環(huán)節(jié)都有相應(yīng)的病毒抑制劑[44]。植物病毒的抑制劑包括天然的抗病毒物質(zhì)及核酸類似物。黃酮(flavonoids)是一種廣泛存在于植物內(nèi)的具有抗病毒活性的物質(zhì)，主要通過(guò)抑制cAMP 磷酸二酯酶的活性來(lái)促進(jìn)cAMP的合成，從而抑制病毒的復(fù)制[45]。桑色素(morin，3, 5, 7, 2′, 3′-五羥基黃酮)、槲皮素(quercetin，3, 5, 7, 3′, 4′-五羥基黃酮)、7, 4′-di-O-芐槲皮素和商陸素(ombuin)，7, 4′-二甲基槲皮素等都屬于黃酮類[46]。甘草酸(glycyrrhizin)也是一種天然的病毒抑制劑，其作用機(jī)制還不是很明確[47]。James等[48]選用多種病毒抑制劑來(lái)脫除蘋果上的ASGV，結(jié)果表明，黃酮類似物中只有商陸素可抑制ASGV，桑色素、槲皮素和7, 4′-di-O-芐槲皮素單獨(dú)使用都對(duì)ASGV沒有作用，但如果將槲皮素與甘草酸等混合使用可抑制ASGV的復(fù)制。此外，James等[49]通過(guò)跟蹤發(fā)現(xiàn)，經(jīng)化學(xué)試劑處理后獲得的無(wú)毒蘋果植株，生長(zhǎng)11 年后仍檢測(cè)不到病毒的存在。

常用于蘋果病毒脫除的抗病毒劑還包括2′, 4′, 4′-三羥基查耳酮、2, 4-二羰基六氫-1, 3, 5-三嗪 (DHT) 和病毒醚(ribavirin)等核酸類似物。其中，病毒醚應(yīng)用最為廣泛，其作用機(jī)理主要是抑制病毒mRNA的加帽和延伸，尤其是阻止鳥嘌呤核苷5′磷酸的合成，以及阻止已合成的mRNA帽子結(jié)構(gòu)的甲基化反應(yīng)，從而抑制病毒核酸的合成[50-51]。采用病毒醚處理已獲得多個(gè)蘋果品種的無(wú)病毒植株[48, 52-55]。研究表明，當(dāng)病毒醚的濃度高于40 mg/L時(shí)，寄主將產(chǎn)生嚴(yán)重的藥害[52-54, 56]，但藥害的產(chǎn)生與品種及品種的基因型關(guān)系密切，有些品種在病毒醚濃度很高(≥100 mg/L)時(shí)，仍不產(chǎn)生藥害[55]。

5 熱處理結(jié)合化學(xué)處理(thermotherapy combined with chemotherapy)

6 低溫處理(cold therapy)

熱處理可脫除ApMV、ACLSV、ASGV和ASPV等多種病毒，但對(duì)ASSVd的脫除率只有20% ～ 60%，有些品種甚至不足6%[60-61]。后來(lái)，人們發(fā)現(xiàn)，較低的溫度可以抑制或停止類病毒的復(fù)制和移動(dòng)，其機(jī)理尚不清楚[62]。采用低溫處理脫除類病毒的溫度一般為4～10 ℃，目前已經(jīng)脫除了馬鈴薯紡錘形塊莖類病毒(PSTVd)、菊花矮小類病毒(CSV)和啤酒花矮化類病毒(HSVd)等類病毒[63-65]。此外，也有研究將熱處理和低溫處理可結(jié)合起來(lái)進(jìn)行脫毒處理。Desvignes等[61]將處理植株先在4～5 ℃條件下處理3個(gè)月，然后再進(jìn)行恒溫(36～ 37 ℃)熱處理，嫁接成活的植株中ASSVd的脫除率達(dá)88.4%。

7 結(jié)論與展望

病毒的脫除效果不僅與病毒的種類和含量、栽培品種的基因型以及采用的脫除方法有關(guān)，還受試驗(yàn)條件以及試驗(yàn)完成情況的影響[66-68]。此外，研究還發(fā)現(xiàn)，脫毒率與病毒的組成關(guān)系密切，復(fù)合感染的病毒較單一感染的病毒難于脫除[37, 69]。其中，熱處理的應(yīng)用廣泛，形式多樣，常見的處理方式為熱處理結(jié)合莖尖培養(yǎng)[32-38]。熱處理過(guò)程中，由于品種間的耐熱性不同，致使同種病毒的脫除效果不同，此外，處理溫度和處理時(shí)間也與寄主的耐熱性有關(guān)[15, 36-37, 70]。進(jìn)行化學(xué)處理時(shí)，處理時(shí)間相對(duì)較長(zhǎng)，其脫除率不僅與病毒和寄主的種類等因素有關(guān)，還與選用的化學(xué)試劑濃度有關(guān)[48, 50-56]。微莖尖嫁接由于受技術(shù)條件影響，在蘋果病毒的脫除中應(yīng)用相對(duì)較少[24]，低溫處理主要針對(duì)ASSVd的脫除[61]。

常見的蘋果病毒及類病毒中，ApMV最容易脫除，早在1959年，Hunter便采用熱處理的方法脫除了該病毒，莖尖培養(yǎng)也很容易脫除ApMV[29-30]；3種潛隱病毒中，ACLSV的脫除較為容易，其次為ASPV，通過(guò)短期的熱處理或是莖尖培養(yǎng)便能脫除，ASGV的耐受性很強(qiáng)，熱處理和莖尖培養(yǎng)的方法很難脫除[36-40]，而病毒醚等抗病毒劑能很好地抑制該病毒的復(fù)制[48-49, 55]；此外，低溫處理能較好地脫除類病毒ASSVd[61]。

我國(guó)是世界第一大蘋果生產(chǎn)國(guó)，栽培面積已達(dá)222 萬(wàn)hm2，年產(chǎn)量達(dá)3370 萬(wàn)t，培育和栽植無(wú)病毒苗木是控制蘋果病毒病傳播、蔓延和危害的最經(jīng)濟(jì)有效措施[71]。脫毒處理作為控制蘋果病毒最為行之有效的方法，越來(lái)越被人們所認(rèn)識(shí)。在蘋果的脫毒研究中，要綜合考慮處理的品種、感染病毒的種類等多種因素，制定出合理的實(shí)施方案，選用適宜的脫毒方法。

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Researchprogressinviruseliminationtechniquesforappletrees

Hu Guojun, Dong Yafeng, Zhang Zunping, Fan Xudong, Ren Fang, Zhu Hongjuan

(NationalCenterforEliminatingVirusesfromDeciduousFruitTree，ResearchInstituteofPomology，ChineseAcademyofAgriculturalSciences，Xingcheng125100，China)

Apple(MaluspumilaMill.) is affected by many viral diseases. The major measure for controlling apple virus diseases is eliminating virus from mother trees, constructing parent plants for reproducing scion and stock materials and planting virus-free seedlings. Four kinds of viruses and one kind of viroid commonly occurred in apple trees. This review summarized the measures applied for apple virus elimination,e.g. shoot tip culture, thermotherapy, chemotherapy, shoot-tip micrografting and cold therapy, and analyzed the application efficiency and different approaches for different virus types. It will help the future research in the field of virus elimination from apple trees.

apple; viruses; elimination

2014-03-24

：2014-04-26

公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專項(xiàng)(201203076)

S 436.611

：ADOI：10.3969/j.issn.0529-1542.2014.06.002

* 通信作者 Tel: 0429-3598278；E-mail: yfdong@163.com