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    大黃牡丹湯組方對急性胰腺炎大鼠胰腺細胞凋亡的影響

    2014-08-09 08:47:58張延英汪永鋒張艷霞李存祥康萬榮
    吉林中醫(yī)藥 2014年10期
    關鍵詞:腺泡淀粉酶胰腺炎

    張延英,汪永鋒,張艷霞,李存祥,康萬榮

    (甘肅中醫(yī)學院 甘肅省中藥藥理與毒理學重點實驗室 甘肅省高校中(藏)藥化學與質量研究省級重點實驗室,蘭州 730000)

    急性胰腺炎(acute Pancreatitis,AP)是一種由胰酶激活引起的常見急腹癥之一,由于胰腺腺泡細胞內(nèi)酶原異常激活,導致胰腺局部炎癥反應,其發(fā)病急、病程快、并發(fā)癥多、病情危重、死亡率高,中醫(yī)將之歸屬于“結胸”“陽明腑實證”等范疇,用通里攻下治療[1]。經(jīng)中醫(yī)臨床應用證明,大黃牡丹湯組方(RPDP)具有清熱解毒,通里攻下,活血涼血,消痞除滿等功效,對AP有很好的療效。近年來,有研究對細胞凋亡在急性胰腺炎發(fā)病中所起的作用進行了探索,但RPDP對實驗性急性胰腺炎胰腺腺泡細胞凋亡的影響及其機制的研究較少。本研究將對一次口服給予RPDP后急性胰腺炎大鼠胰腺腺泡細胞凋亡情況及其機制進行觀察。

    1 材料與方法

    1.1 實驗動物 SPF級實驗動物和屏障實驗室均由甘肅中醫(yī)學院提供,生產(chǎn)許可證號:SCXK(甘)2011-0001,使用許可證號:SYXK(甘)2011-0001;SPF雄性SD大鼠60只,體質量200~260 g。將60只SD大鼠隨機分為藥物作用12 h假手術(SO)組、模型組和RPDP組,藥物作用24 h SO組、模型組和RPDP組,每組各10只。分別于RPDP治療后12 h和24 h后處死大鼠并取材。

    1.2 藥物、主要試劑與儀器 RPDP由甘肅省高校中(藏)藥化學與質量研究省級重點實驗室制成生藥濃度為4 kg/L的藥液。牛磺膽酸鈉、TUNEL試劑盒、血清淀粉酶、一氧化氮(NO)和誘生型iNOS測定試劑盒均購自蘭州碩達生物技術公司。所需儀器設備由甘肅中醫(yī)學院科研實驗中心提供。

    1.3 AP模型的建立、治療和取材 SPF級SD大鼠分為藥物作用12 h SO組、AP模型組和RPDP治療組,藥物作用24 h SO組、AP模型組和RPDP治療組。SO組大鼠在開腹后僅輕輕翻動胰腺和胰膽管然后關腹。大鼠禁食,自由飲水12 h后,3%戊巴比妥麻醉下,經(jīng)上腹部正中切口進入腹腔,提起胃、十二指腸,顯露出胰腺,確認膽胰管,在其近端和遠端均以動脈夾暫時結扎,將帶有四號針頭的1 mL注射器沿十二指腸壁漿肌層穿刺距離膽胰管開口0.3 mm處的膽管,注入3.5%的?;悄懰徕c0.1 mL/100 g,以0.1 mL/min的速度注射完成,停留5 min,去除結扎線,指壓穿刺點,查無漏膽,逐層關腹。對照組僅牽引胰腺和十二指腸后關腹[2]。術后10~15 min清醒后限制飲水,籠中自由活動。建立大鼠AP模型,造模后2 h灌胃,治療組給予RPDP劑量為40 g/kg(10 mL/kg)灌胃1次,相當于成人劑量的20倍,模型組和SO組用等量的生理鹽水灌胃1次。給藥后12 h和24 h兩個時間段麻醉股動脈取血,每只動物分兩個采血管,肝素抗凝管分離血漿,普通管分離血清;取血后開腹取胰腺組織,胰體迅速制備勻漿,檢測胰腺組織中NO含量和iNOS的活性;胰頭組織完全浸入4%多聚甲醛,每日更換1次4%多聚甲醛,3 d后用石蠟包埋,用原位缺口末端標記法檢測胰腺組織細胞凋亡率。

    1.4 血清淀粉酶,胰腺組織N0含量、iNOS活性和腺泡細胞凋亡測定 用普通采血管分離血清,檢測血清淀粉酶;檢測胰腺組織勻漿中NO含量和iNOS活性,按照NO含量和iNOS活性試劑盒提供的方法進行檢測,用TUNEL凋亡細胞試劑盒說明書進行定量檢測胰腺腺泡細胞的凋亡。用盲法計數(shù),選取每張TUNEL陽性切片陽性細胞數(shù)最多的高倍視野8個,每個高倍視野計數(shù)100個細胞和其中的凋亡細胞,凋亡指數(shù)=陽性細胞數(shù)/800×100%。

    2 結果

    2.1 手術后觀察 取血后開腹觀察胰腺,模型組和治療組有腹水,胰腺局部腫脹變硬,模型組的壞死灶比治療組多;SO組腹腔內(nèi)未見腹水和其他異常,胰腺正常。

    2.2 血清淀粉酶活性 AP模型組血清淀粉酶顯著高于SO組;與AP模型組比較,RPDP治療后12 h和24 h血清淀粉酶顯著降低(P<0.05);與12 hRPDP治療組比較,24 hRPDP治療組血清淀粉酶顯著降低(P<0.05),見表1。

    2.3 胰腺組織NO含量和iNOS活性 AP模型大鼠胰腺組織NO含量和iNOS活性顯著低于SO組;與AP模型組比較,RPDP治療后12 h和24 h,胰腺組織內(nèi)NO含量和iNOS活性顯著升高(P<0.05);與12 h RPDP治療組比較,24 h RPDP治療組NO含量和iNOS活性顯著升高(P<0.05),見表1。

    2.4 細胞凋亡指數(shù) 實驗結果顯示,SO組和模型組大鼠胰腺腺泡細胞凋亡發(fā)生率較低;與模型組比較,RPDP治療后12 h和24 h胰腺腺泡細胞凋亡率顯著升高(P<0.05);與12 h RPDP治療組比較,24 h RPDP治療組胰腺腺泡細胞凋亡率顯著升高(P<0.05),見表1。

    表1 RPDP對SD大鼠血清中淀粉酶、NO、iNOS和細胞凋亡的影響

    注:與SO組比,#P<0.05;與12 h比,△P<0.05

    3 討論

    AP較輕時胰腺腺泡細胞凋亡較多,很少有壞死,AP較重時胰腺腺泡細胞壞死較多,很少有細胞凋亡;胰腺腺泡細胞凋亡之后,多種酶原物質從腺泡細胞內(nèi)釋放到腺泡細胞外,致胰腺炎癥反應減輕[3-4]。細胞凋亡有可能是機體自我保護的一種現(xiàn)象,胰腺腺泡細胞凋亡,有可能減輕AP的嚴重程度。Flint RS研究說明,病情嚴重程度與胰腺腺泡細胞凋亡呈負相關[5]。研究發(fā)現(xiàn),胰腺組織損害越嚴重,胰腺細胞凋亡指數(shù)就越低,RPDP對胰腺細胞凋亡有誘導作用。

    胰腺腺泡細胞NO含量和iNOS活性在AP中有何作用,AP時胰腺腺泡細胞NO含量和iNOS活性顯著降低,Werner J認為iNOS活性誘導胰腺腺泡細胞使其NO含量增加,一定含量的NO對AP胰腺微循環(huán)有所改善,NO能保護血管內(nèi)皮細胞,從而對胰腺腺泡細胞起到了保護作用,AP的嚴重程度減輕了[6],內(nèi)源性的NO阻斷或含量減少有可能加重AP損傷[7-8]。實驗說明,經(jīng)RPDP治療后胰腺腺泡細胞NO含量和iNOS活性增加,血清淀粉酶降低和誘導胰腺腺泡細胞凋亡指數(shù)增加,此實驗結果與Thatte U研究一致[9]。RPDP對AP胰腺組織有保護作用是通過增加胰腺組織內(nèi)NO含量和iNOS活性,協(xié)同誘導胰腺腺泡細胞凋亡而實現(xiàn),但其作用機理還需要大量研究來進一步闡明。

    [1]高青松,劉源,張濤,等.不同類型脂肪酸對SD大鼠血清生化指標及胰島素抵抗的影響[J].實驗動物科學,2010,27(1):16-21.

    [2]張馨木,孫波,李志滿,等.重組人KD/APP var對實驗性大鼠急性壞死性胰腺炎作用的研究[J].實驗動物科學,2010,27(5):26-28.

    [3]Kaiser A M,Saluja A K,Sengupta A,et al.Relationship between severity,necrosis,and apoptosis in five models of experimental acute pancreatitis[J].The American Journal of Physiology,1995,269(5 Pt 1):C1295-C1304.

    [4]Saluja A,Hofbauer B,Yamaguchi Y,et al.Induction of apoptosis reduces the severity of caerulein-induced pancreatitis in mice[J].Biochemical and Biophysical Research Communications,1996,220(3):875-878.

    [5]Flint R S,Phillips A R,Power S E,et al.Acute pancreatitis severity is exacerbated by intestinal ischemia-reperfusion conditioned mesenteric lymph[J].Surgery,2008,143(3):404-413.

    [6]Werner J,Fernndez-del Castillo C,Rivera J A,et al.On the protective mechanisms of nitric oxide in acute pancreatitis[J].Gut,1998,43(3):401-407.

    [7]張在興,孫家邦,李非,等.內(nèi)源性一氧化氮對大鼠急性壞死性胰腺炎的胰腺保護作用[J].中華普通外科雜志,2000,15(10):29-31.

    [8]吳濤,陳熹,紀宗正.精氨酸對急性胰腺炎大鼠胰腺腺泡細胞凋亡的影響[J].第四軍醫(yī)大學學報,2007,28(17):1570-1572.

    [9]Thatte U,Bagadey S,Dahanukar S.Modulation of programmed cell death by medicinal plants[J].Cellular and Molecular Biology (Noisy-le-Grand,France),2000,46(1):199-214.

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