連作蘋果園土壤真菌的T-RFLP分析

尹承苗, 王功帥, 李園園, 陳學(xué)森, 吳樹敬,毛志泉,*

(1. 山東農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝科學(xué)與工程學(xué)院/作物生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗室，泰安 271018；2. 青島明月藍(lán)海生物科技有限公司， 青島 266400)

連作蘋果園土壤真菌的T-RFLP分析

尹承苗1, 王功帥1, 李園園2, 陳學(xué)森1, 吳樹敬1,毛志泉1,*

(1. 山東農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝科學(xué)與工程學(xué)院/作物生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗室，泰安 271018；2. 青島明月藍(lán)海生物科技有限公司， 青島 266400)

為探討連作蘋果園不同土壤空間真菌群落結(jié)構(gòu)，應(yīng)用T-RFLP(Terminal Restriction Fragment Length Polymorphism)技術(shù)，比較了3個連作園不同取樣位置(行間、原穴、株間)和不同土層(0—30 cm、30—60 cm)的土壤真菌多樣性，并結(jié)合不同樣品T-RFLP圖譜的差異，采用多樣性指數(shù)分析、聚類分析和主成分分析(PCA)，分析了3個連作園土壤真菌群落結(jié)構(gòu)特征。結(jié)果表明，磁窯、道朗和金城連作園的土壤真菌多樣性存在差異，各采樣地區(qū)的Shannon多樣性指數(shù)在0.43—2.47 之間，Pielou 均勻度指數(shù)在0.17—0.85 之間，Simpson優(yōu)勢度指數(shù)在0.12—0.81 之間，Margalef 豐富度指數(shù)最高的是金城樹穴0—30 cm土層 (R=4.55)，最低的是磁窯行間30—60 cm土層 (R=0.77)。在調(diào)查的不同取樣位置、不同土層中，原樹穴具有最高的多樣性指數(shù)、均勻度指數(shù)、豐富度指數(shù)和最低的優(yōu)勢度指數(shù)；0—30 cm土層的土壤真菌多樣性指數(shù)、均勻度指數(shù)、豐富度指數(shù)均高于30—60 cm土層，而優(yōu)勢度指數(shù)的趨勢正好相反；PCA和聚類分析結(jié)果顯示磁窯、道朗和金城連作園的土壤真菌群落結(jié)構(gòu)均有明顯差異，3個連作園的土壤真菌各自構(gòu)成一個獨(dú)立的群落結(jié)構(gòu)，這些群落能夠適應(yīng)各自的土壤環(huán)境并成為環(huán)境的優(yōu)勢群落。

連作果園；土壤真菌；T-RFLP

蘋果是我國栽培面積最大的果樹樹種，受土地資源限制，老果園更新時面臨連作障礙現(xiàn)象較為普遍，即病蟲害嚴(yán)重、產(chǎn)量下降、品質(zhì)變劣等，給果農(nóng)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。如何有效緩解或克服連作障礙已成為蘋果產(chǎn)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的一項重要工作[1- 2]。

蘋果連作障礙由來已久，病因復(fù)雜。在多數(shù)地區(qū)，與土傳真菌有關(guān)的生物因素是造成連作障礙的主要原因[3- 5]。Urashima等[6]研究發(fā)現(xiàn)蘆薈連作障礙與真菌群落結(jié)構(gòu)的變化有關(guān)。李延茂等[7]研究結(jié)果顯示，杉木連作引起土壤真菌種群發(fā)生較大變化。李坤等[8]采用PCR-DGGE技術(shù)，對連作的葡萄種植園進(jìn)行研究表明，葡萄連作對土壤細(xì)菌與真菌的群落組成產(chǎn)生了顯著的影響。因此，探究蘋果連作對土壤真菌群落多樣性及群落結(jié)構(gòu)的影響，特別是不同連作果園真菌群落結(jié)構(gòu)特征，對于進(jìn)一步了解和防控蘋果連作障礙具有重要意義。

末端限制性片段長度多態(tài)性( Terminal Restriction Fragment Length Polymorphism，T-RFLP)技術(shù)是研究微生物多樣性的一種新興的分子生物學(xué)方法[9- 10]，不依賴于培養(yǎng)即可進(jìn)行群落分析[11]。這種技術(shù)可有效地用于微生物菌種鑒定、群落的對比和多樣性分析[12]。本文將T-RFLP技術(shù)用于連作蘋果園土壤真菌群落結(jié)構(gòu)的研究中，基于T-RFLP圖譜，運(yùn)用多樣性指數(shù)、聚類分析和主成分分析比較了不同連作蘋果園不同取樣位置、不同土層的土壤真菌多樣性及其群落結(jié)構(gòu)特征，以期掌握連作蘋果園土壤真菌分布狀況及群落結(jié)構(gòu)特征變化，為防控蘋果連作障礙提供一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

2012年3月分別在山東省泰安市寧陽縣磁窯鎮(zhèn)大磨莊村、岱岳區(qū)道朗鎮(zhèn)玄莊村和煙臺萊州市金城鎮(zhèn)大沙嶺村選取一片20年生的老果園，去除老樹后，重新栽植兩年生富士/平邑甜茶蘋果幼苗，新建三片連作園。不同園片按原樹穴、原行間和原株間三處分別采樣，采樣在幼樹周圍半徑0.5 m范圍內(nèi)進(jìn)行，挖直徑40 cm，深60 cm的土坑，分0—30 cm和30—60 cm采集土樣，將土樣過篩、裝入封口袋，避光儲存，帶回室內(nèi)分析，3次重復(fù)。

1.2 樣品理化指標(biāo)的測定

參照鮑士旦《土壤農(nóng)化分析》第三版[13]的方法，對土壤氮磷鉀和有機(jī)質(zhì)進(jìn)行測定。速效磷(P2O5)-鉬銻抗比色法；速效鉀(K2O)-火焰光度法；有機(jī)質(zhì)的測定-重鉻酸鉀容量法(稀釋熱法)；銨態(tài)氮和硝態(tài)氮 (NH-H和NO-N)-CaCl2浸提流動注射分析儀法[14]。

1.3 總DNA的提取及純化

樣品基因組總DNA的提取及純化按照E.Z.N.A. Soil DNA Kit說明書進(jìn)行操作。

圖1 磁窯、道朗和金城連作園土壤樣品總DNAFig.1 Total DNA of apple replanted ochard soil of Ciyao, Daolang and Jincheng1： 磁窯行間0—30 cm; 2： 磁窯樹穴0—30 cm; 3： 磁窯行間30—60 cm; 4： 磁窯株間30—60 cm; 5： 磁窯樹穴30—60 cm; 6： 磁窯株間0—30 cm;7： 道朗行間0—30 cm;8： 道朗樹穴0—30 cm;9： 道朗株間0—30 cm;10： 道朗行間30—60 cm;11： 道朗樹穴30—60 cm; 12： 道朗株間 30—60 cm;13： 金城行間0—30 cm;14： 金城樹穴0—30 cm;15： 金城株間0—30 cm;16： 金城行間30—60 cm;17： 金城樹穴30—60 cm;18: 金城株間30—60 cm

1.4 T-RFLP分析

1.4.1 ITS-PCR擴(kuò)增

用于ITS 片段擴(kuò)增的引物采用帶FAM熒光標(biāo)記的真菌通用引物ITS1-F-FAM和ITS4，由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

ITS1-F-FAM(5′→3′): CTTGGTCATTTAGAG GAAGTAA；

ITS4(5′→3′): TCCTCCGCTTATTGATAGC

ITS 擴(kuò)增反應(yīng)體系為：12.5 μL 2×Taq Master Mix，1 μL DNA 模板，ITS1-F 和ITS4(10 μmol/L)各1.5 μL，加ddH2O 至25 μL。PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性60 s，51 ℃退火60 s，72 ℃延伸60 s，共34個循環(huán)；最后72 ℃延伸10min。取5 μL ITS-PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，按照PCR產(chǎn)物純化試劑盒說明書進(jìn)行PCR產(chǎn)物純化，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.2 酶切

用限制性內(nèi)切酶Hha I對上述PCR純化產(chǎn)物進(jìn)行酶切。酶切反應(yīng)體系為30 μL： 含10 μL ITS-PCR 純化產(chǎn)物、2 μL Hha I (10 U/μL)、2 μL 10×Buffer、加ddH2O 至30 μL。置于37 ℃水浴中溫育4 h, 酶切完畢后65 ℃水浴20 min 終止反應(yīng)。將酶切產(chǎn)物送至上海生工生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測序。

1.5 數(shù)據(jù)分析

1.5.1 真菌群落多樣性分析和相似度分析

用 Peak Scanner軟件分析各樣品的T-RFLP圖譜，去掉引物峰及雜峰，其中T-RF小于50 bp為引物峰，相對峰面積(每個限制性片段的峰面積除以累計峰面積)小于0.5%為雜峰[15- 16]。單個T-RF(Terminal Restriction Fragment) 的相對峰面積(Ap) 按照公式Ap=ni/N×100計算，式中ni代表每個可分辨的T-RF 的峰面積，N代表所有T-RF 峰面積的總和[17]。以圖譜中每一個可統(tǒng)計的T-RF，視為一個OTU(Operational Taxonomic Unit)。根據(jù)圖譜中OTU 的數(shù)目及其豐度通過BIO-DAP程序(http://nhsbig.inhs.uiuc.edu/wes/populations.html)計算樣品的多樣性指數(shù) (H)、優(yōu)勢度指數(shù)(D)、豐富度指數(shù) (SR) 和均勻度指數(shù) (E)[18- 19]。同時，計算18個樣品兩兩之間的Sorenson相似指數(shù):Cs=2NAB/(NA+NB)，式中NAB指A、B兩個樣品共有的條帶數(shù)目(相差士l bp內(nèi)算同一條帶)，NA、NB指A、B兩樣品各自的條帶數(shù)。

1.5.2 聚類分析和主成分分析

根據(jù)T-RFs在不同樣品圖譜中的分布及豐度，采用SPSS軟件對18個樣品進(jìn)行主成分分析(PCA)和聚類分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 連作果園土壤樣品的理化性狀

由表1數(shù)據(jù)可以看出，磁窯、道朗和金城連作園的土壤樣品間理化指標(biāo)差異顯著，各采樣地行間、樹穴和株間處理間的土壤樣品間理化指標(biāo)差異顯著，且0—30 cm和30—60 cm土層的理化指標(biāo)也差異顯著(P≤0.05)。除個別樣品外，0—30 cm土層的銨態(tài)氮(NH-N)、硝態(tài)氮(NO-N)、速效磷(P)、速效鉀(K)和有機(jī)質(zhì)(TOC)的含量要高于30—60 cm土層，且達(dá)顯著性差異；金城連作園各處理的硝態(tài)氮、速效磷、速效鉀和有機(jī)質(zhì)含量均高于磁窯、道朗連作園，且達(dá)顯著性差異；而磁窯和金城連作園0—30 cm土層各處理的銨態(tài)氮含量均高于道朗連作園，且達(dá)顯著性差異，在30—60 cm土層各處理的銨態(tài)氮含量道朗、金城連作園均高于磁窯連作園。

2.2 不同樣品的土壤真菌T-RFLP 分析結(jié)果

限制性內(nèi)切酶的種類是影響T-RFLP 結(jié)果的關(guān)鍵因素[20]。不同限制性內(nèi)切酶的酶切所獲T-RFs 數(shù)量不同, 段魏魏[21]等研究發(fā)現(xiàn)酶HhaⅠ相對于Hae Ⅲ更適合分析真菌的群落多樣性，本實(shí)驗利用限制性內(nèi)切酶HhaⅠ對磁窯、道朗和金城連作園樣品的土壤真菌ITS 區(qū)進(jìn)行酶切，T-RFLP 分析結(jié)果見圖1。從圖1 可以看出，酶切譜帶清晰，T-RFs 比較明顯，酶切片段在50—600 bp 之間，不同樣品間真菌群落存在明顯差異。

表1 樣品的理化性狀

Duncan′s 檢測，同列不同小寫字母表示 0.05 水平上差異顯著;1. 磁窯行間0—30 cm(Ciyao inter-row top soil);2. 磁窯樹穴0—30 cm (Ciyao tree hole top soil) ;3. 磁窯行間30—60 cm (Ciyao inter-row subsoil;4. 磁窯株間30—60 cm (Ciyao between the trees subsoil;5. 磁窯樹穴30—60 cm(Ciyao tree hole subsoil);6. 磁窯株間0—30 cm (Ciyao between the trees top soil);7. 道朗行間0—30 cm (Daolang inter-row top soil);8. 道朗樹穴0—30 cm (Daolang tree hole top soil);9. 道朗株間0—30 cm (Daolang between the trees top soil);10. 道朗行間30—60 cm (Daolang inter-row subsoil);11. 道朗樹穴30—60 cm (Daolang tree hole subsoil);12. 道朗株間 30—60 cm (Daolang between the trees subsoil);13. 金城行間0—30 cm(Jincheng inter-row top soil);14. 金城樹穴0—30 cm (Jincheng tree hole top soil);15. 金城株間0—30 cm(Jincheng between the trees top soil);16. 金城行間30—60 cm(Jincheng inter-row subsoil);17. 金城樹穴30—60 cm (Jincheng tree hole subsoil);18. 金城株間30—60 cm(Jincheng between the trees subsoil)

圖2 連作果園的土壤樣品的T-RFLP圖譜Fig.2 T-RFLP profiles of soil samples in apple replanted ochard

2.3 不同樣品的土壤真菌多樣性分析

根據(jù)T-RFLP圖譜中OTU的數(shù)量、種類及豐度，分別計算了3個地區(qū)18個土壤樣品的真菌多樣性指數(shù)(表2)。在0—30 cm土層，金城連作園樹穴處理具有最高的多樣性指數(shù)、均勻度指數(shù)、豐富度指數(shù)和最低的優(yōu)勢度指數(shù)；磁窯、道朗連作園的樹穴處理也具有較高的多樣性指數(shù)、均勻度指數(shù)、豐富度指數(shù)和較低的優(yōu)勢度指數(shù)。在30—60 cm土層，磁窯連作園的行間、樹穴和株間處理均具有最低的多樣性指數(shù)、均勻度指數(shù)、豐富度指數(shù)和最高的優(yōu)勢度指數(shù)，而除金城行間外，道朗、金城連作園的行間、樹穴和株間處理均具有較高的多樣性指數(shù)、均勻度指數(shù)、豐富度指數(shù)和較低的優(yōu)勢度指數(shù)。總體來說，除道朗株間處理外，0—30 cm土層的土壤真菌的多樣性指數(shù)、均勻度指數(shù)、豐富度指數(shù)均高于30—60 cm土層，優(yōu)勢度指數(shù)的趨勢正好相反。

2.4 不同樣品間相似性分析

根據(jù)18個樣品間相同的T-RFs計算出相似系數(shù)(表3)，根據(jù)T-RFs及其相對峰面積對各樣品進(jìn)行了聚類分析(圖3)。

表2 土壤真菌多樣性分析

Duncan′s 檢測，同列不同小寫字母表示 0.05 水平上差異顯著

圖3 不同樣品間T-RFLP圖譜的聚類分析Fig.3 Cluster analysis of T-RFLP patterns of different samples

表3 各樣品間相似系數(shù)

根據(jù)Jaccard[22]相似性系數(shù)原理，當(dāng)Cs值為0.00—0.25時，為極不相似；當(dāng)Cs值為0.25—0.75時，為中等相似；當(dāng)Cs值為0.75—1.00時，為極相似。由各樣品間的相似系數(shù)和聚類分析可知，磁窯連作園各樣品之間土壤真菌相似性系數(shù)很高，在0.522—0.800之間，根據(jù)Jaccard 相似性原理，處于極相似與中等相似之間，以4號(磁窯株間30—60 cm)與5號(磁窯樹穴30—60 cm)樣品之間的相似度最高，相似系數(shù)達(dá)到0.800；道朗連作園各樣品之間土壤真菌相似性系數(shù)在0.261—0.714之間，處于中等相似與中等不相似之間，以11號(道朗樹穴30—60 cm)與12號(道朗株間30—60 cm)樣品之間的相似度最高，相似系數(shù)達(dá)到0.714；金城連作園各樣品之間土壤真菌相似性系數(shù)在0.435—0.800之間，金城30—60 cm土層行間、樹穴、株間各樣品之間處于中等相似與中等不相似之間，其他各樣品之間處于極相似與中等相似之間。磁窯、道朗和金城連作園的各樣品之間土壤真菌群落結(jié)構(gòu)的相似性則處于極不相似與中等不相似之間。

2.5 基于T-RFLP的主成分分析

根據(jù)主成分的提取原則，被選的主成分所代表的主軸總長度占所有主軸長度之和的大約85%即可，本文對各樣品獲得的所有數(shù)據(jù)進(jìn)行主成分分析，前3個主成分特征值的貢獻(xiàn)率總和為83.8%，后面的特征值的貢獻(xiàn)越來越少，所以本文選取3個主成分來進(jìn)行分析(圖4)。由圖4可以看出，磁窯、道朗和金城連作園的所有樣品可以分為3個相對獨(dú)立的群，磁窯連作園的所有樣品具有最高的第一主成分得分和較低的第二、第三主成分得分；道朗連作園的所有樣品僅具有最高的第二主成分得分；金城連作園的所有樣品僅具有最高的第三主成分得分。磁窯、道朗和金城連作園的土壤真菌群落結(jié)構(gòu)均有明顯差異，各自構(gòu)成1個獨(dú)立的群落結(jié)構(gòu)。

圖4 不同樣品間T-RFLP圖譜的主成分分析Fig.4 PCA for T-RFLP patterns of different samples圖中阿拉伯?dāng)?shù)字1,2,3代表每個樣品進(jìn)行的3次平行重復(fù)

3 討論

連作障礙的發(fā)生與根際微生態(tài)系統(tǒng)的失衡密切相關(guān)，長期連作可導(dǎo)致根際微生物群落結(jié)構(gòu)和功能多樣性改變，降低有益微生物數(shù)量，增加土傳病害菌數(shù)量，從而導(dǎo)致作物減產(chǎn)[23- 24]。果樹連作障礙不僅導(dǎo)致病原菌如疫霉、腐霉和絲核菌等種群數(shù)量的明顯增加，而且還影響土壤微生物的種群結(jié)構(gòu)，在未栽培果樹土壤中以腐生真菌、巨大芽孢桿菌和洋蔥伯克霍爾德菌等細(xì)菌為主，而連作土壤則以病原真菌為主[25]。已報道與蘋果連作障礙有關(guān)的主要致病真菌屬有柱孢屬、鐮刀屬、絲核屬、疫霉屬和腐霉屬等[26- 27]。Tewoldemedhin[5]從連作果園蘋果腐爛的根中分離到了大量的尖孢鐮刀菌。Van Schoor[4]研究發(fā)現(xiàn)在南非所有連作蘋果園中土壤有害真菌鐮刀屬、柱孢屬以及腐霉屬是引起連作障礙的主要原因，真菌是某些地區(qū)導(dǎo)致蘋果連作障礙的主要原因，病原菌往往是許多真菌組成的真菌復(fù)合體。

多樣性分析結(jié)果顯示連作蘋果園不同取樣位置的真菌多樣性存在差異，磁窯、道朗和金城三片連作園中均表現(xiàn)為樹穴處理具有最高的多樣性指數(shù)、均勻度指數(shù)、豐富度指數(shù)和最低的優(yōu)勢度指數(shù)，可能是因為樹穴中殘留許多老果樹根系向土壤環(huán)境釋放的代謝產(chǎn)物，其主要包括糖類、蛋白質(zhì)、氨基酸、維生素以及有機(jī)酸、酚類等化合物[28]，其中很多低分子量的化合物可作為化感物質(zhì)影響植物根際土壤中微生物群落[29- 30]。當(dāng)根系分泌物中自毒物質(zhì)積累較少時，根系分泌物給病原菌提供豐富的營養(yǎng)，從而使病原菌數(shù)量和種類較豐富，多樣性指數(shù)較高[31]。張淑香等[32]和劉金波等[33]證明連作后根系分泌物的數(shù)量增多會誘導(dǎo)土壤真菌數(shù)量的增加。眾多研究也表明，連作導(dǎo)致致病真菌的增加絕不是偶然現(xiàn)象，而是與連作及連作產(chǎn)生分泌物密切相關(guān)[34]。這些物質(zhì)對微生物和植株具有自毒作用，連續(xù)種植可導(dǎo)致其積累，進(jìn)而發(fā)生連作障礙[35]。

微生物是土壤生態(tài)系統(tǒng)中最具活力的組成部分。根際是植物與土壤環(huán)境接觸的重要界面，植物根系以多種形式向周圍的土壤釋放有機(jī)物質(zhì)，并以其自身的活動影響這部分土壤的理化及生物學(xué)性狀，特別是影響微生物區(qū)系的發(fā)育[36]。自然條件下，不同的植物根系有不同的分泌物、不同的根部碎片和其它有機(jī)成分，形成根際獨(dú)特而穩(wěn)定的微生物區(qū)系[37]。砧木、樹勢及季節(jié)變化等因子對土壤微生物的種群結(jié)構(gòu)、分布和數(shù)量均有顯著影響[38]。馬寧寧等[39]研究發(fā)現(xiàn)對于土壤土著微生物來說，土著真菌的群落結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性優(yōu)于土著細(xì)菌，優(yōu)勢種群沒有因為受到溫度、濕度、人為耕作措施等的影響而消失。PCA和聚類分析結(jié)果顯示磁窯、道朗和金城連作園的土壤真菌群落結(jié)構(gòu)均有明顯差異，且磁窯、道朗和金城連作園的土壤真菌群落結(jié)構(gòu)處于極不相似與中等不相似之間，說明磁窯、道朗和金城連作園土壤中已經(jīng)形成了穩(wěn)定的土著真菌群落，這些群落能夠適應(yīng)磁窯、道朗和金城連作園各自土壤環(huán)境中的變化并成為環(huán)境的優(yōu)勢群落，各自構(gòu)成1個獨(dú)立的群落結(jié)構(gòu)。

蘋果連作障礙的病因復(fù)雜，土壤真菌對重茬再植植株的影響起著重要的作用，不同地區(qū)病因不同，即使同一地區(qū)，主要病因也存在細(xì)微差別[3]。導(dǎo)致連作障礙發(fā)生的原因很多，如植物種類、土壤類型、栽培措施、連作年限等，果樹的長期定植引起了土壤理化性質(zhì)及土壤微生物數(shù)量、活性、多樣性及種群結(jié)構(gòu)的改變，果園土壤有機(jī)質(zhì)含量降低、土壤酸化、微生物數(shù)量減少、活性及多樣性改變是土壤質(zhì)量退化的標(biāo)志[40]，但最重要的是連作改變了土壤微生物的種群結(jié)構(gòu)和數(shù)量，一些依賴于植物及其代謝產(chǎn)物的微生物種群(尤其是病原菌)數(shù)量逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)閮?yōu)勢種群，相反，一些受植物代謝產(chǎn)物抑制的微生物種群(一些有益微生物)數(shù)量將逐漸降低。連作后的這種有益與有害微生物種群結(jié)構(gòu)和數(shù)量的失衡，土壤真菌群落結(jié)構(gòu)變化可能是導(dǎo)致連作障礙嚴(yán)重發(fā)生的重要原因之一。

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Assessment of fungal diversity in apple replanted orchard soils by T-RFLP analysis

YIN Chengmiao1, WANG Gongshuai1, LI Yuanyuan2, CHEN Xuesen1, WU Shujing1, MAO Zhiquan1,*

1StateKeyLaboratoryofCropBiology，CollegeofHorticultureScienceandEngineering，ShandongAgriculturalUniversity,Tai′an，Shandong271018，China2QingdaoBrightMoonBlueseaBio-TechCo,LTD，Qingdao，Shandong266400，China

Apple replant disease (ARD) has been reported from all major fruit-growing regions of the world. ARD is a serious problem in about half of old orchard sites surveyed, with typical symptoms including stunted above- and below-ground tree growth, necrosis of feeder roots, water stress and nutrient deficiencies. The etiology of ARD is complex and causal agents vary among different sites and regions. In most sites, biotic factors seem to be prevalent, including nematodes, bacteria, actinomycete, oomycetes and fungi species thought thatPratylenchuspenetranswas the primary nematode species involved in ARD. Although several bacterial genera and species have been associated and suggested as being involved in ARD, most bacteria likely impaired plant at inordinately high densities. Evidence for the involvement of actinomycetes in ARD is circumstantial. However, most researches demonstrated fungal and oomycete genera were the main reason for apple replant disease, i.e. fungal genera:Fusarium,Rhizoctonia,Cylindrocarpon; oomycete genera:Phytophthora,Pythium. To investigate the spatial structure of soil fungal community structure in replanted orchards, three replanted orchards in Ciyao, Daolang and Jincheng town were used to take soil samples, which were collected from 0—30 cm and 30—60 cm depth of the row, inter-row and tree hole, respectively. T-RFLP (Terminal Restriction Fragment Length Polymorphism) was applied in the analysis of soil fungal diversity. Based on the T-RFLP pattern differences, diversity index analysis, cluster analysis and principal component analysis (PCA) were combined to do the further analysis of soil fungal diversity from different orchards. The results indicated that soil fungal diversity differed in three orhcards, Shannon diversity index, Pielou evenness index and Simpson index in all samples were between 0.43—2.47, 0.17—0.85 and 0.12—0.81, respectively. The highest Margalef richness index (R=4.55) was observed at 0—30 cm soil layer of tree hole in Jincheng and the lowest value (R=0.77) was obtained at 30—60 cm soil layer of tree inter-row in Ciyao. In all investigated sites and soil layers, original tree hole showed the highest diversity index, evenness index, richness index and the lowest Simpson index. Soil fungal diversity index, evenness index, richness index of 0—30 cm soil layer were higher than those of 30—60 cm soil layer; however, Simpson index expressed a reverse trend. PCA and cluster analysis indicated that soil fungi of Ciyao, Daolang and Jincheng formed independent community structure, respectively, and these communities could adapt to their own specific soil environment and became the dominant population.

apple replanted orchards; soil fungi; T-RFLP

現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項資金資助項目(CARS- 28); 山東省農(nóng)業(yè)重大應(yīng)用技術(shù)創(chuàng)新課題資助項目; 教育部長江學(xué)者和創(chuàng)新團(tuán)隊發(fā)展計劃資助項目(IRT1155)

2013- 06- 24;

2013- 11- 08

10.5846/stxb201306241765

*通訊作者Corresponding author.E-mail: mzhiquan@sdau.edu.cn

尹承苗, 王功帥, 李園園, 陳學(xué)森, 吳樹敬,毛志泉.連作蘋果園土壤真菌的T-RFLP分析.生態(tài)學(xué)報,2014,34(4):837- 846.

Yin C M, Wang G S, Li Y Y, Chen X S, Wu S J, Mao Z Q.Assessment of fungal diversity in apple replanted orchard soils by T-RFLP analysis.Acta Ecologica Sinica,2014,34(4):837- 846.