鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶在cTnI基因Asp128Tyr突變致心肌肥大中的作用*

周 琴， 姚 健, 朱健華， 于小紅， 盛紅專△

(南通大學(xué) 1附屬醫(yī)院心內(nèi)科, 3醫(yī)學(xué)院組胚教研室，江蘇 南通 226001； 2南通市第二人民醫(yī)院內(nèi)科，江蘇 南通 226002)

肥厚型心肌病(hypertrophic cardiomyopathy,HCM)是年輕人和運(yùn)動(dòng)員猝死的首要原因，編碼肌小節(jié)結(jié)構(gòu)蛋白的基因突變被認(rèn)為是HCM的病因[1]。本實(shí)驗(yàn)室前期通過(guò)對(duì)臨床確診的HCM患者外周血行基因突變篩查，發(fā)現(xiàn)了一例新的心肌鈣蛋白I (cardiac troponin I,cTnI)基因突變類型[2]，為第127號(hào)密碼子由GAT轉(zhuǎn)換為TAT，使編碼的天冬氨酸(aspartic acid, Asp)變?yōu)槔野彼?tyrosine,Tyr)，即cTnIAsp127Tyr突變。

為探討該突變對(duì)心肌肥大的影響及可能的機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)在前期構(gòu)建大鼠cTnIAsp128Tyr突變(相當(dāng)于人類Asp127Tyr突變)腺病毒載體的基礎(chǔ)上，以該病毒轉(zhuǎn)染心肌細(xì)胞，并采用鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶(calcineurin, CaN)抑制劑環(huán)孢菌素A(cyclosporine A，CsA)或FK506干預(yù)，檢測(cè)心肌細(xì)胞肥大和CaN mRNA及活性變化，以探討該突變對(duì)心肌肥大的影響及CaN在cTnIAsp128Tyr突變致心肌肥大中的作用。

材 料 和 方 法

1 動(dòng)物及主要試劑

新生1日齡的清潔級(jí)SD乳鼠由南通大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。主要試劑：腺病毒純化試劑盒(Biomiga)；HEK293細(xì)胞(中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞研究所細(xì)胞庫(kù))；DMEM高糖培養(yǎng)液及胎牛血清(Gibco)；胰蛋白酶粉(BBI)；CsA、FK506和DMSO(Sigma)；real-time PCR試劑盒(Bioneer)；小鼠抗GAPDH單克隆抗體、羊抗CaN多克隆抗體及羊抗小鼠和兔抗羊Ⅱ抗(Santa Cruz)；CaN測(cè)定試劑盒(南京建成生物工程研究所)。

2 方法

2.1擴(kuò)增和純化重組腺病毒 培養(yǎng)HEK293細(xì)胞，待細(xì)胞鋪滿瓶底80%時(shí)，吸出舊培養(yǎng)基，加入稀釋后的病毒原液，培養(yǎng)3～5 d后，收集所有細(xì)胞至離心管中，于-80 ℃和37 ℃反復(fù)凍融3次，離心后收集上清按腺病毒純化試劑盒說(shuō)明進(jìn)行純化，采用TCID50法測(cè)定重組腺病毒滴度。

2.2心肌細(xì)胞培養(yǎng)及分組 胰蛋白酶消化法制備乳鼠心室肌細(xì)胞，以5×108/L密度將細(xì)胞接種于6孔板中。細(xì)胞分8組：(1) 空白對(duì)照組：除培養(yǎng)液外，無(wú)任何干預(yù)因素；(2) 陰性對(duì)照病毒轉(zhuǎn)染組：加入不含任何目的基因的腺病毒載體；(3) 野生型cTnI基因轉(zhuǎn)染組：給予攜帶正常cTnI基因的腺病毒干預(yù)；(4)突變型cTnI基因轉(zhuǎn)染組：用含cTnIAsp128Tyr突變基因的腺病毒干預(yù)；(5) 突變型cTnI基因轉(zhuǎn)染+CsA組：用含cTnIAsp128Tyr突變基因的腺病毒轉(zhuǎn)染同時(shí)給予CsA；(6) 突變型cTnI基因轉(zhuǎn)染+ FK506組：用含cTnIAsp128Tyr突變基因的腺病毒轉(zhuǎn)染同時(shí)給予FK506。

具體方法：原代乳鼠心肌細(xì)胞培養(yǎng)48 h后換無(wú)血清培養(yǎng)液，按實(shí)驗(yàn)分組分別加入CsA或FK506，終濃度均為1 μmol/L。預(yù)處理30 min后，按實(shí)驗(yàn)分組給予相應(yīng)病毒干預(yù)(按預(yù)實(shí)驗(yàn)確定的最適MOI 為200給予相應(yīng)病毒量)，培養(yǎng)24 h后換液，繼續(xù)孵育48 h后留取細(xì)胞用于檢測(cè)。

2.3Real-time PCR法檢測(cè)心鈉素(atrial natriuretic factor，ANF)、腦鈉肽 (brain natriuretic peptide, BNP)和CaN mRNA表達(dá) Trizol法提取細(xì)胞總RNA，按照兩步法進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)， PCR條件：第1步，95 ℃ 3 min；第2步，95 ℃ 15 s，58 ℃ 25 s及72 ℃ 35 s，循環(huán)45次。引物序列如下：GAPDH正義鏈5′-CCATCACTGCCACTCAGAAGACT-3′，反義鏈5′-ACATTGGGGGTAGGAACACG-3′；ANF正義鏈5′-GAGCAGACCGATGAAGCG-3′，反義鏈5′-GAGCAGAGCCCTCAGTTTG-3′；BNP正義鏈5′-GCTCTCAAAGGACC AAGGC-3′，反義鏈5′-AAACAACCTCAGCCCGTCA-3′；CaN正義鏈5′-ATGACAG AAGGGGAAGACCAG-3′，反義鏈5′-TCCTCCAGCCAACACTCCA-3′。以GAPDH為內(nèi)參照，采用2-ΔΔCt法進(jìn)行相對(duì)定量，mRNA表達(dá)量以各樣本與空白對(duì)照組的倍數(shù)表示。

2.4CaN檢測(cè)試劑盒測(cè)定CaN活性 超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)裂解細(xì)胞，離心后收集上清，BCA法測(cè)定蛋白濃度后，采用對(duì)硝基苯磷酸發(fā)色底物法，按照CaN測(cè)定試劑盒說(shuō)明檢測(cè)CaN活性，結(jié)果以每毫克蛋白中所含的CaN活力單位表示[U/(mg protein)]。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS Statistics 17.0統(tǒng)計(jì)軟件分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，組間均數(shù)比較采用單因素方差分析及q檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 乳鼠心肌細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察以及ANF和BNP mRNA表達(dá)的變化

乳鼠心肌細(xì)胞培養(yǎng)12 h基本貼壁，48 h后出現(xiàn)成片搏動(dòng)。應(yīng)用前期構(gòu)建并擴(kuò)增的綠色熒光蛋白標(biāo)記的腺病毒感染心肌細(xì)胞10～12 h后，即可見(jiàn)細(xì)胞內(nèi)表達(dá)綠色熒光蛋白。處理因素作用72 h 后, 熒光表達(dá)強(qiáng)烈。與轉(zhuǎn)染含正常cTnI基因的心肌細(xì)胞相比，轉(zhuǎn)染含突變cTnI基因的心肌細(xì)胞呈增大趨勢(shì)；突變型cTnI基因轉(zhuǎn)染合并CsA或FK506干預(yù)組的心肌細(xì)胞較突變型cTnI基因轉(zhuǎn)染的心肌細(xì)胞呈減小趨勢(shì)，見(jiàn)圖1。

Figure 1. The photographs of cardiomyocytes.A: blank control group; B: transfected with the control vector virus; C: transfected with the virus containing the wild-type cTnI gene; D: transfected with the virus containing the mutant cTnI gene; E: transfected with the virus containing the mutant cTnI gene plus CsA intervention; F: transfected with the virus containing the mutant cTnI gene plus FK506 intervention. Bar=50 μm.

對(duì)轉(zhuǎn)染72 h后的心肌細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞肥大分子標(biāo)志物ANF和BNP mRNA表達(dá)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)：與空白對(duì)照組相比，陰性對(duì)照病毒轉(zhuǎn)染組(ANF：1.024±0.341;BNP： 1.004±0.273)、野生型cTnI基因轉(zhuǎn)染組(ANF：1.076±0.375;BNP：1.193±0.621)細(xì)胞內(nèi)ANF和BNP mRNA表達(dá)無(wú)顯著差異(P>0.05)，提示無(wú)論病毒或正常肌鈣蛋白I轉(zhuǎn)染對(duì)心肌肥大分子標(biāo)志物表達(dá)均無(wú)影響。與空白對(duì)照組、陰性對(duì)照病毒轉(zhuǎn)染組或野生型cTnI基因轉(zhuǎn)染組相比，轉(zhuǎn)染突變型cTnI基因的心肌細(xì)胞其ANF mRNA(2.390±1.022)和BNP mRNA(2.696±1.134)表達(dá)均顯著增高(P<0.05)，提示cTnIAsp128Tyr突變可引起心肌細(xì)胞肥大。ANF和BNP mRNA表達(dá)在突變型cTnI基因轉(zhuǎn)染+CsA干預(yù)(ANF：0.882±0.301；BNP：1.215±1.235)或突變型cTnI基因轉(zhuǎn)染+FK506干預(yù)(ANF：0.863±0.572；BNP：1.030±0.543)都較單純轉(zhuǎn)染突變型cTnI基因的心肌細(xì)胞顯著降低(P<0.05)，提示CsA或FK506可抑制心肌肥厚,見(jiàn)圖2。

Figure 2. The mRNA expression of ANF and BNP in the cardiomyocytes with different treatments. Control: blank control group; negative: transfected with the control vector virus; wild: transfected with the virus containing the wild-type cTnI; mutation: transfected with the virus containing the cTnI Asp128Tyr mutation; CsA: CsA+cTnI Asp128Tyr mutation; FK506: FK506+cTnI Asp128Tyr mutation.Mean±SD.n=6.*P<0.05 vs control, negative or wild; #P<0.05 vs mutation.

2 不同處理對(duì)心肌細(xì)胞中CaN活性的影響

通過(guò)對(duì)各組心肌細(xì)胞中CaN活性的測(cè)定發(fā)現(xiàn)：空白對(duì)照組[(9.476±1.892) U/(mg protein)]、陰性對(duì)照病毒轉(zhuǎn)染組 [(13.683±2.265) U/(mg protein)] 及野生型cTnI基因轉(zhuǎn)染組 [(14.153±0.608) U/(mg protein)] 3組間CaN活性無(wú)顯著差異(P>0.05)，但與這3組相比，突變型cTnI基因轉(zhuǎn)染組 [(19.920±0.702) U/(mg protein)] 的心肌細(xì)胞中的CaN活性顯著增高(P<0.05)，突變型cTnI基因轉(zhuǎn)染+CsA干預(yù) [(12.329±0.277) U/(mg protein)] 或突變型cTnI基因轉(zhuǎn)染+FK506干預(yù) [(12.582±1.303) U/(mg protein)] 后CaN 活性較單純突變型cTnI基因轉(zhuǎn)染組顯著下降(P<0.05)。

3 不同處理對(duì)心肌細(xì)胞中CaN mRNA表達(dá)的影響

空白對(duì)照組、陰性對(duì)照病毒轉(zhuǎn)染組(0.938±0.365)及野生型cTnI基因轉(zhuǎn)染組(1.054±0.521)3組間的CaN mRNA表達(dá)水平相近(P>0.05)；與這3組相比，突變型cTnI基因轉(zhuǎn)染組的心肌細(xì)胞中CaN mRNA表達(dá)(1.722±0.606)顯著升高(P<0.05)；突變型cTnI基因轉(zhuǎn)染+CsA干預(yù)組(0.975±0.351)或突變型cTnI基因轉(zhuǎn)染+FK506干預(yù)組(0.955±0.239)的CaN mRNA表達(dá)較突變病毒轉(zhuǎn)染組下降(P<0.05)，見(jiàn)圖3。

Figure 3. The mRNA expression of CaN in the cardiomyocytes with different treatments. Control: blank control group; negative: transfected with the negative control vector virus; wild: transfected with the virus containing the wild-type cTnI; mutation: transfected with the virus containing the cTnI Asp128Tyr mutation; CsA: CsA+cTnI Asp128Tyr mutation; FK506: FK506+ cTnI Asp128Tyr mutation.Mean±SD.n=6. *P<0.05 vs control, negative or wild; #P<0.05 vs mutation.

討 論

肥厚型心肌病是一種以常染色體顯性遺傳為特征的具有遺傳異質(zhì)性的心臟疾病[1]，臨床表現(xiàn)可從無(wú)癥狀到黑矇、暈厥、心絞痛、心衰甚至猝死。近年研究認(rèn)為HCM是一種心肌肌小節(jié)基因相關(guān)疾病, 編碼肌小節(jié)蛋白基因中的1個(gè)基因突變即可致病[3]。為探討前期在肥厚型心肌病患者中新發(fā)現(xiàn)的cTnIAsp127Tyr突變是否可致心肌肥大及其可能的機(jī)制，我們構(gòu)建了含大鼠cTnIAsp128Tyr突變的腺病毒載體，以該病毒轉(zhuǎn)染培養(yǎng)的心肌細(xì)胞，觀察心肌細(xì)胞中肥大基因表達(dá)的變化，并以CaN抑制劑CsA或FK506干預(yù)，探討CaN在cTnIAsp128Tyr突變致心肌肥大中的作用。

為了排除突變病毒轉(zhuǎn)染過(guò)程中腺病毒或肌鈣蛋白轉(zhuǎn)染對(duì)心肌肥大可能的影響，我們?cè)谠O(shè)置空白對(duì)照組(不加任何干預(yù)因素)的同時(shí)，設(shè)置了不含任何目的基因的單純腺病毒組(陰性對(duì)照病毒轉(zhuǎn)染組)和攜帶正常cTnI基因的腺病毒組(野生型cTnI基因轉(zhuǎn)染組)作為對(duì)照。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)：與空白對(duì)照組相比，陰性對(duì)照病毒轉(zhuǎn)染組或野生型cTnI基因轉(zhuǎn)染組的ANF和BNP mRNA表達(dá)量的均無(wú)顯著差異，提示單純腺病毒或肌鈣蛋白轉(zhuǎn)染對(duì)心肌細(xì)胞肥大均無(wú)影響。與空白對(duì)照組、陰性對(duì)照病毒轉(zhuǎn)染組或野生型cTnI基因轉(zhuǎn)染組相比，用含cTnIAsp128Tyr突變基因的腺病毒轉(zhuǎn)染心肌細(xì)胞(突變型cTnI基因轉(zhuǎn)染組)可上調(diào)其ANF和BNP mRNA的表達(dá)，突變型cTnI基因轉(zhuǎn)染組的心肌細(xì)胞較野生型cTnI基因轉(zhuǎn)染組的心肌細(xì)胞具增大趨勢(shì)。實(shí)驗(yàn)采用細(xì)胞培養(yǎng)方法證實(shí)了cTnIAsp128Tyr突變可導(dǎo)致心肌細(xì)胞肥大，與臨床攜帶該突變的患者表現(xiàn)為肥厚型心肌病相一致[2]。

近年研究發(fā)現(xiàn)：CaN作為唯一的鈣/鈣調(diào)素活化的蛋白磷酸酶，在離體細(xì)胞培養(yǎng)和在體壓力負(fù)荷增加等多種原因[4-7]導(dǎo)致的心肌肥大中發(fā)揮重要作用。但CaN在基因突變致肥厚型心肌病中的作用尚未獲定論。肌肉細(xì)胞特異性泛素蛋白連接酶1、肌球蛋白重鏈等基因突變致小鼠肥厚型心肌病模型中存在CaN活化[8-9]，但myozenin 2突變致肥厚型心肌病的心肌肥厚過(guò)程則不依賴于CaN信號(hào)通路的活化[10]。為探討CaN在cTnIAsp128Tyr突變中的作用，本實(shí)驗(yàn)對(duì)病毒轉(zhuǎn)染的心肌細(xì)胞進(jìn)行了CaN活性測(cè)定并觀察CaN抑制劑CsA或FK506對(duì)心肌細(xì)胞肥大的影響。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)：與空白對(duì)照組、陰性對(duì)照病毒轉(zhuǎn)染組或野生型cTnI基因轉(zhuǎn)染組相比，轉(zhuǎn)染了cTnIAsp128Tyr突變基因的心肌細(xì)胞在細(xì)胞增大、心肌肥厚分子標(biāo)志物ANF和BNP mRNA表達(dá)上調(diào)同時(shí)，細(xì)胞內(nèi)的CaN活性顯著升高；用CaN抑制劑CsA或FK506干預(yù)在降低CaN活性同時(shí)，大鼠心肌細(xì)胞縮小，胞內(nèi)ANF和BNP mRNA表達(dá)下調(diào)，提示CaN信號(hào)通路參與了cTnIAsp128Tyr突變致心肌肥大過(guò)程。

CaN作為一種酶，既往的研究主要是檢測(cè)其活性水平的變化，本實(shí)驗(yàn)中，我們?cè)谶M(jìn)行心肌細(xì)胞內(nèi)CaN活性檢測(cè)的同時(shí)，進(jìn)行了mRNA表達(dá)水平的測(cè)定。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，與空白對(duì)照組相比，陰性對(duì)照病毒轉(zhuǎn)染組或野生型cTnI基因轉(zhuǎn)染組的CaN mRNA表達(dá)量均無(wú)顯著差異。與空白對(duì)照組、陰性對(duì)照病毒轉(zhuǎn)染組或野生型cTnI基因轉(zhuǎn)染組相比，轉(zhuǎn)染了cTnIAsp128Tyr突變基因的心肌細(xì)胞在CaN活性增高同時(shí)，還存在胞內(nèi)CaN mRNA的表達(dá)量增加。用CaN抑制劑CsA或FK506干預(yù)在降低CaN活性、抑制心肌肥大的同時(shí)，CaN mRNA表達(dá)下調(diào)，提示在cTnIAsp128Tyr突變病毒轉(zhuǎn)染致心肌肥大過(guò)程中，不僅存在CaN活性水平的變化，還存在mRNA水平的調(diào)節(jié)。

除CaN外，尚有多條胞內(nèi)信號(hào)通路參與了心肌肥厚的發(fā)生和發(fā)展：如蛋白激酶C[11]、絲裂素活化蛋白激酶通路包括胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(extracellular signal-regulated kinase, ERK)、c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase, JNK)和p38等[12-14]，且多條通路間?；ハ鄥f(xié)調(diào)、制約，共同調(diào)控心肌肥厚反應(yīng)[13-14]。ERK和JNK信號(hào)通路參與了myozenin 2突變所致肥厚型心肌病的心肌肥厚[10]，ERK還參與了Raf1L613V基因突變導(dǎo)致Noonan 綜合癥的心肌肥厚[15]。本實(shí)驗(yàn)中我們主要探討了CaN在cTnIAsp128Tyr突變致心肌肥大中的作用，今后我們將進(jìn)一步探討其它胞內(nèi)信號(hào)通路在該突變中的作用。

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