HSP27作為評價(jià)皮膚急性刺激性生物標(biāo)志物的研究*

張賢英， 張 磊， 戴桃李， 孟 甜， 李淑華， 張齊好,2△， 黃亞東,2△

(1暨南大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院醫(yī)藥生物研究院， 2廣東省生物醫(yī)學(xué)工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510632；3廣東省生物制品與藥物研究所，廣東 廣州 510300; 4廣州市婦女兒童醫(yī)療中心， 廣東 廣州 510623)

皮膚刺激性定義為皮膚暴露于受試物后局部產(chǎn)生的可逆性炎性變化。常用評價(jià)方法是由Draize等[1]建立的皮膚刺激性實(shí)驗(yàn)(Draize實(shí)驗(yàn))，觀察指標(biāo)包括紅斑、焦痂或水腫。然而，以動(dòng)物作為受試對象，該評價(jià)體系具有明顯的缺點(diǎn)：天然皮膚結(jié)構(gòu)不僅與遺傳、營養(yǎng)、精神狀態(tài)有關(guān)，還受生理狀態(tài)和環(huán)境因素的影響，個(gè)體差異大，重復(fù)性較差；觀察指標(biāo)為表觀的定性判別，難以量化[2]。隨著國際動(dòng)物保護(hù)和動(dòng)物福利運(yùn)動(dòng)的興起，以動(dòng)物替代為主的原則已成為藥品和化妝品質(zhì)量檢驗(yàn)的重要理念。因此，構(gòu)建皮膚替代模型，開發(fā)出新的、能夠有效評價(jià)體外皮膚刺激效應(yīng)的生物標(biāo)志，建立完整的替代方法成為關(guān)鍵的核心問題。

在評價(jià)皮膚刺激性標(biāo)記物的研究中，除了經(jīng)典的細(xì)胞活性和白細(xì)胞介素1α(interleukin 1α，IL-1α)指標(biāo)外[3-4]，學(xué)者嘗試將更多標(biāo)志物作為刺激性評價(jià)的檢測點(diǎn)，以增加替代方法的敏感性和特異性，如角質(zhì)形成細(xì)胞前列腺素E2(prostaglandin E2，PGE2)、主要組織相容性復(fù)合體(major histocompatibility complex，MHC)表達(dá)變化以及IL-8、腫瘤壞死因子 α(tumor necrosis factor α，TNF-α)、IL-1受體拮抗劑(interleukin-1 receptor antagonist，IL-1RA)、干擾素γ(interferon γ，IFN-γ)等炎癥介質(zhì)的釋放[5-7]。由于藥物、化妝品等物質(zhì)的皮膚毒性是非常復(fù)雜的生物過程，其效應(yīng)可能是皮膚老化、接觸性皮炎、過敏反應(yīng)，也可能是黑素增生、細(xì)胞癌變等。它們涉及到不同的損傷機(jī)制，既具有共性，又具有特異性。而目前所用的生物標(biāo)志物雖然能滿足某些種類物質(zhì)刺激性的區(qū)分，但還不足以區(qū)分不同類別的化學(xué)物質(zhì)[8]，因此需要進(jìn)一步尋找更多的標(biāo)志物用于體外皮膚毒性實(shí)驗(yàn)，以提高體外實(shí)驗(yàn)方法的敏感性和特異性。本研究以歐盟規(guī)定的刺激性化合物作用于人體皮膚組織，應(yīng)用蛋白組學(xué)技術(shù)篩選用于評價(jià)化合物皮膚急性刺激性的特異性生物標(biāo)志。

材 料 和 方 法

1 材料與儀器

人體皮膚組織(由廣州市兒童醫(yī)院提供)，DMEM培養(yǎng)基(Gibco)，胎牛血清(杭州四季青)，十二烷基硫酸鈉(sodium lauryl sulfate，SLS;Sigma)，3,3’-二硫代二丙酸(3,3’-dithiodipropionic acid，DA；Sigma)，10-十一碳烯酸(10-undecenoic acid，UA;Alfa)，組織裂解液{7 mol/L 尿素，4% 3-[3-(膽酰胺丙基)二甲氨基]丙磺酸內(nèi)鹽(CHAPS)，2 mol/L硫脲}，水化液(2%CHAPS，7 mol/L尿素)，Ettan IPGphor Ⅲ等電聚焦系統(tǒng)(GE)，SE 600 Ruby 標(biāo)準(zhǔn)垂直電泳系統(tǒng)，預(yù)制干膠條(pH 3～10)。

2 化合物處理皮膚組織

無菌條件下，去除包皮切除術(shù)后皮膚組織的皮下脂肪，并剪成小塊，大小為0.8 mm×0.8 mm。皮膚組織放置于自制的不銹鋼網(wǎng)架上，采用氣液交界培養(yǎng)法培養(yǎng)，表皮面朝上，在12孔培養(yǎng)板的孔內(nèi)加入0.9 mL的DMEM培養(yǎng)基(含10% FBS)。分別把SLS、UA和DA涂抹于皮膚表皮面：其中液體化合物取(10±1)μL；固體化合物取(10±2)mg+10 μL PBS，以利于樣品均勻分布，與皮膚表面充分接觸。作用時(shí)間為15 min，然后用無菌PBS將組織樣品反復(fù)沖洗10遍后收集樣品。

3 組織蛋白的提取

組織樣品剪碎后，加入組織裂解液充分研磨10 min。然后在冰上放置約1 h，期間不定時(shí)進(jìn)行研磨。收集液體，9 000×g離心1 h，收集上清蛋白，測定蛋白濃度。

4 二維電泳

取300 μg樣品進(jìn)行等電聚焦，上樣體積為250 μL。樣品與水化液混合后上樣，膠條與樣品接觸后，充分吸脹30 min，進(jìn)行等電聚焦，時(shí)間約22 h，條件為：30 V 12 min；500 V 1 h；1 000 V 1 h；8 000～64 000 V 10 h；2 000 V 10 h。等電聚焦結(jié)束后，分別用含有1%二硫蘇糖醇的平衡液和含有2.5%吲哚-3-乙酸平衡液各平衡15 min。用12.5% SDS-PAGE進(jìn)行第二相電泳，先每個(gè)膠15 mA，電泳15 min后，然后每個(gè)膠30 mA直至電泳結(jié)束。

固定液固定過夜，敏化液敏化30 min，水洗4次，每次10 min，0.1% AgNO3銀染40 min，簡單水洗后加入NaCO3顯色液顯色。

5 圖像和質(zhì)譜分析

用ImageMaster 2D Platinum軟件分析電泳膠，蛋白點(diǎn)匹配后，以差異度達(dá)到2倍或者2倍以上作為具有顯著性差異的蛋白點(diǎn)進(jìn)行質(zhì)譜鑒定。從膠上挖出蛋白點(diǎn)，酶解后凍干。凍干的蛋白質(zhì)多肽溶于3 μL 30%乙腈(含0.1%的三氟乙酸)中，點(diǎn)樣0.5 μL于MALDI板上，再加入0.5 μL 10 g/L α-氰基-4-羥基肉桂酸基質(zhì)，晾干后，行MALDI-TOF/TOF MS質(zhì)譜鑒定。完全凍干的樣品重新用0.1%三氟乙酸溶解，然后使用美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司4800 Plus MALDI-TOF-TOF Analyzer串聯(lián)飛行時(shí)間質(zhì)譜儀進(jìn)行分析。質(zhì)譜鑒定采用板上混合點(diǎn)樣方法，操作參數(shù)如下：反射模式，正離子檢測，一級質(zhì)譜的質(zhì)量掃描范圍為800～4 000 Da，使用標(biāo)準(zhǔn)肽混合物作為外標(biāo)校正，每一個(gè)樣品質(zhì)譜信號累加600～800個(gè)激光shots；對于每一個(gè)樣品，再選擇信噪比最強(qiáng)的且大于或等于50以上的5個(gè)峰分別作為前體離子，然后進(jìn)行二級質(zhì)譜分析，單個(gè)前體離子的質(zhì)譜信號累加1 200激光shots。獲得的一級和二級質(zhì)譜數(shù)據(jù)使用GPS Explore 3.6(美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司)軟件進(jìn)行分析，分析后的每一個(gè)樣品的一級和二級質(zhì)譜數(shù)據(jù)再整合成一個(gè)文件,使用MASCOT 2.1 (Matrix Science)搜庫軟件對本地?cái)?shù)據(jù)庫進(jìn)行檢索，鑒定蛋白質(zhì)。

6 Real-time RT-PCR檢測

按照Qiagen RNeasy Mini Kit (Qiagen)的操作方法分別提取各處理組及對照組的組織總RNA，檢測RNA濃度和純度，放置于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?yīng)用M-MLV first-strand synthesis system試劑盒(Bio-Rad)逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，隨后加入引物和cDNA，設(shè)計(jì)程序進(jìn)行qPCR檢測。熱休克蛋白27(heat-shock protein 27,HSP27) 上游引物5’-GGACGAGCATGGCTACATCT-3’，下游引物5’-GACTGGGATGGTGATCTCGT-3’；62 ℃退火10 s；40循環(huán)；產(chǎn)物166 bp。GAPDH上游引物5’- GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3’，下游引物5’-AAGATGGTGATGGGATTTC-3’；60 ℃退火10 s；40循環(huán)；產(chǎn)物226 bp。

7 Western blotting檢測

配備12% SDS-PAGE凝膠，蛋白樣品上樣電泳；轉(zhuǎn)膜后室溫下封閉1～2 h，然后孵育Ⅰ抗(goat anti-human HSP27 antibody; Santa Cruz，1∶2 000)4 ℃過夜；以辣根過氧化物酶標(biāo)記的Ⅱ抗(Sigma-Aldrich, 1∶200)在室溫下孵育2 h；采用ECL化學(xué)發(fā)光法檢測蛋白；對蛋白條帶進(jìn)行灰度分析(ImageJ)。

8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

用SPSS 11.0軟件分析，數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，組間差異采用單因素方差分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 二維電泳和MALDI-TOF/TOF MS的結(jié)果

SLS、UA和DA處理皮膚組織后，提取全蛋白，進(jìn)行二維電泳，共獲得約1 400個(gè)蛋白點(diǎn)，經(jīng)過軟件分析選取了有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的10個(gè)蛋白表達(dá)差異點(diǎn)。圖1是2-D電泳圖譜，箭頭標(biāo)示的是差異表達(dá)蛋白點(diǎn)。在這些差異表達(dá)蛋白中，HSP27表現(xiàn)為顯著上調(diào)，在SDS和UA處理組中分別上調(diào)2.86和3.66倍。圖2顯示的是HSP27在2-D圖譜中的確切位點(diǎn)。能夠被MALDI-TOF/TOF MS質(zhì)譜分析法所鑒定的蛋白點(diǎn)有8個(gè)，差異倍數(shù)詳見表1。

Figure 1. Representative 2-D maps of protein expression in human skin with different treatments.N: normal group.

Figure 2. Expression of HSP27 in 2-DE maps of human skin with different treatments.

表1 MALDI-TOF/TOF MS鑒定不同處理組皮膚樣品中差異蛋白的表達(dá)

2 Real-time RT-PCR檢測HSP27 mRNA的表達(dá)

SLS和UA處理15 min后，皮膚組織HSP27 mRNA的表達(dá)并沒有發(fā)生顯著改變，見圖3。

3 Western blotting驗(yàn)證HSP27蛋白的表達(dá)

與正常組比較，SLS和UA刺激使人體皮膚HSP27蛋白的表達(dá)明顯上調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；而陰性對照組DA與正常組比較，HSP27的表達(dá)沒有顯著差異，見圖4。

Figure 3. The mRNA expression of HSP27 in skin tissues exposed to SLS, UA and DA detected by real-time RT-PCR.Mean±SD.n=3.

Figure 4. The protein expression of HSP27 in skin tissues exposed to SLS, UA and DA detected by Western blotting.Mean±SD.n=3.**P<0.01 vs N group.

討 論

在本實(shí)驗(yàn)中，根據(jù)歐洲替代方法驗(yàn)證中心(the European Centre for the Validation of Alternative Methods, ECVAM)的測試流程[9](ECVAM SIVS, 2007)，人體皮膚組織暴露于歐盟定義的刺激性化合物SLS、UA和非刺激性化合物DA中，作用15 min后，應(yīng)用雙向電泳的蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，篩選出8個(gè)差異表達(dá)蛋白，其中HSP27表達(dá)顯著上調(diào)。我們的前期研究已經(jīng)證實(shí)，在細(xì)胞模型中，HSP27有可能成為評價(jià)皮膚刺激性的候選生物標(biāo)志。

人HSP27的分子量為27 kD，在生物體內(nèi)主要有2種HSP：誘導(dǎo)型和構(gòu)成型。誘導(dǎo)型HSP主要在外界環(huán)境的刺激下表達(dá)，具有保護(hù)細(xì)胞的功能；構(gòu)成型HSP在生理狀態(tài)下表達(dá)，與細(xì)胞的分化、發(fā)育密切相關(guān)。應(yīng)激條件下，熱休克轉(zhuǎn)錄因子(heat-shock transcription factor，HSF)與熱休克調(diào)節(jié)元件結(jié)合，激活HSP27基因,使HSP27表達(dá)增加。HSP27主要在皮膚的上皮層中表達(dá)，在多種應(yīng)激條件下，誘導(dǎo)型HSP27表達(dá)增加，作為分子伴侶保護(hù)細(xì)胞功能[10]。紫外線[11]、加熱[12]和對羥基苯甲酸甲酯[13]都可以使角質(zhì)細(xì)胞中的HSP27表達(dá)上調(diào)。HSP27能夠啟動(dòng)接觸超敏反應(yīng)，誘導(dǎo)樹突狀細(xì)胞中IL-1α、TNF-α、IL-6、IL-12 p70和IL-12 p40的上調(diào)，建立接觸過敏早期階段適應(yīng)性和先天免疫之間的聯(lián)系[14]。紫外線照射后誘導(dǎo)上調(diào)的HSP27可以調(diào)節(jié)角質(zhì)細(xì)胞中促炎細(xì)胞因子IL-8和IL-1的釋放，并且還可以調(diào)節(jié)NF-κB通路依賴促炎介質(zhì)的產(chǎn)生[15]。

在我們前期的研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，SLS和酸堿化合物能夠使角質(zhì)細(xì)胞的HSP27表達(dá)下調(diào)[16]，重金屬則可以使HSP27表達(dá)上調(diào)[17]；而在本實(shí)驗(yàn)中，SLS和UA使皮膚組織中HSP27表達(dá)上調(diào)。有研究發(fā)現(xiàn)，數(shù)小時(shí)的缺氧導(dǎo)致臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞HSP27表達(dá)下調(diào)，最終導(dǎo)致細(xì)胞骨架崩潰死亡[18]。也就是說，HSP27蛋白表達(dá)的改變與刺激的時(shí)間、強(qiáng)度有關(guān)，而細(xì)胞和組織對同種刺激也會產(chǎn)生不同的效應(yīng)。在2-D圖譜中，1號點(diǎn)和3號點(diǎn)同時(shí)鑒定為HSP27，提示HSP27可能發(fā)生了蛋白磷酸化修飾，有待后續(xù)研究進(jìn)一步驗(yàn)證。此外，SLS和UA處理15 min后，與蛋白表達(dá)比較，HSP27在mRNA水平上的表達(dá)并沒有發(fā)生改變，說明是在翻譯水平上調(diào)HSP27蛋白的表達(dá)，與HSP27對細(xì)胞的保護(hù)作用相關(guān)。綜上所述，HSP27有可能成為評價(jià)皮膚刺激性體外替代方法體系的候選生物標(biāo)志物，其表達(dá)改變的強(qiáng)度需要與既定的體外模型對應(yīng)。

[參 考 文 獻(xiàn)]

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