P物質(zhì)對大鼠DRG神經(jīng)元H+門控電流的調(diào)制作用

師春梅， 趙 斌， 譚 燕， 趙奉波， 李之望

(1惠州市第一人民醫(yī)院老年科，廣東 惠州 516000； 2廣東醫(yī)學(xué)院神經(jīng)病學(xué)研究所，廣東 湛江 524001；3廣東醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院老年科，廣東 湛江524001； 4華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院電生理實驗室，湖北 武漢 430000)

酸敏感離子通道(acid-sensing ion channels, ASICs)也稱H+門控離子通道(H+-gated ion channels)，屬于上皮鈉通道/退化蛋白(epithelial Na+channel/degenerin，ENaC/DEG)超家族[1]。目前國內(nèi)外對天然ASICs 的電流類型沒有統(tǒng)一的劃分。

ASICs廣泛存在于哺乳動物中樞神經(jīng)系統(tǒng)和外周神經(jīng)系統(tǒng)[2-3]，參與痛覺形成、傷害性刺激感受、味覺傳導(dǎo)，同時也參與學(xué)習(xí)/記憶、突觸可塑性和驚恐反射等過程，另外ASICs在炎癥、缺血、癲癇等病理生理過程中發(fā)揮重要作用[4-5]，尤其在腦缺血損傷和炎癥痛方面發(fā)揮更為重要的病理生理學(xué)作用。

從物種進化方面來看，ASICs和另外一種通道FMRFAmide(苯丙-甲硫-精-苯丙氨酸多肽)門控的鈉離子通道(FaNaCH)相近。該通道可被在軟體動物上普遍存在的神經(jīng)遞質(zhì)FMRFAmide激活，是目前所知道的唯一的肽門控離子通道。而哺乳動物體內(nèi)沒有FMRFamide，但存在FMRFamide相關(guān)肽。最近研究發(fā)現(xiàn)，哺乳動物體內(nèi)的RF肽(RFamide)對ASICs有強有力的調(diào)制作用[6]。

P物質(zhì)(substance P，SP)為11肽，是哺乳動物體內(nèi)重要的肽類神經(jīng)遞質(zhì)，廣泛分布于神經(jīng)系統(tǒng)和其它外周組織器官內(nèi)。具有擴張血管、傳遞疼痛信息、影響心腦血管活動以及參與學(xué)習(xí)、記憶等多種病理生理過程。近年來有研究發(fā)現(xiàn)在外周傳導(dǎo)痛覺神經(jīng)節(jié)細胞中ASICs與SP共同表達，其表達密度都可被炎癥所誘導(dǎo)[7]。另外研究發(fā)現(xiàn)在急性腦缺血后腦中SP的含量顯著增加[8]，與此同時腦缺血引起的酸中毒激活了腦內(nèi)廣泛存在的ASICs。ASICs激活所致的腦損傷已引起了國內(nèi)外學(xué)者特別重視。因此，探討SP和ASICs的相互作用在治療腦缺血損傷中和周圍炎癥痛有著重要的意義，而目前有關(guān)SP對ASICs的調(diào)制作用國內(nèi)外未見有報道。

材 料 和 方 法

1 標本制備

將256只SD大鼠麻醉后斷頭處死，取出胸腰段脊柱沿正中線剖成兩半，置于O2飽和的pH 7.4的DMEM液中，溶液滲透壓為340 mOsm/L。在體視顯微鏡下用精細彈簧剪和游絲鑷清除背根神經(jīng)節(jié)(dorsal root ganglion,DRG)表面相連神經(jīng)和周圍結(jié)締組織被膜，然后將神經(jīng)節(jié)盡可能地剪碎，置于盛有5 mL溶有胰蛋白酶0.5 g/L和膠原酶1.0 g/L的DMEM液的大試管中，在恒溫水浴振蕩器(35 ℃、50 times/min)中振蕩孵育30～35 min，孵育畢加入大豆胰蛋白酶抑制劑1.25 g/L以終止酶的消化作用。將經(jīng)上述酶和機械分離的DRG細胞懸液轉(zhuǎn)移至35mm直徑的培養(yǎng)皿中，在倒置顯微鏡的載物臺上靜置至少30 min后用充氧的細胞外液置換培養(yǎng)皿中加有消化酶的DMEM液。

2 電生理記錄

全細胞膜片鉗記錄所用放大器為PC2C型膜片鉗放大器(華中科技大學(xué)自控系生產(chǎn))，玻璃微電極所充內(nèi)液成分為(mmol/L)：KCl 150, MgCl22, HEPES 10, EGTA 11, ATP 4。用KOH將pH值調(diào)至7.2，用蔗糖將滲透壓調(diào)為310 msOm/L，電極電阻2～4 MΩ。灌流用之標準細胞外液成分為(mmol/L)：NaCl 150，KCl 5，CaCl22.5，MgCl21，HEPES 10，D-glucose 10。用NaOH將pH值調(diào)至7.4，用蔗糖將滲透壓調(diào)為340 msOm/L。在電極和細胞之間形成高阻封接后(>1GΩ)，進一步將細胞膜吸穿，調(diào)節(jié)電容和串聯(lián)電阻補償，除了特別標明以外，膜電位鉗制于-60 mV,膜電流應(yīng)用低通濾波(1 kHz，-3dB)。電極通過放大器探頭與膜片鉗放大器連接，放大器通過轉(zhuǎn)換器將刺激信號轉(zhuǎn)換為數(shù)據(jù)信號，存于計算機硬盤中。

3 給藥

P物質(zhì)、GR82334、GDP-β-S和WIN51708均為Sigma生產(chǎn)，其它藥品為國內(nèi)生產(chǎn)。GDP-β-S通過膜片鉗玻璃內(nèi)為插管加入到充灌電極的細胞內(nèi)液行胞內(nèi)透析。SP和GR82334均用標準外液配制。實驗中所用的酸(pH 4.0～6.0)是標準外液加HCl(1 mol/L)調(diào)配而成。給藥系通過微操縱器移動快速換液裝置的排管進行，每管內(nèi)徑∶外徑為200 μm∶500 μm，管口距所記錄的細胞約100 μm。實驗在室溫22～25 ℃范圍內(nèi)進行。

4 統(tǒng)計學(xué)處理

數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差(mean±SD)表示，兩組之間采用t檢驗進行分析；實驗數(shù)據(jù)的處理、分析以及統(tǒng)計圖形的繪制采用SigmaPlot軟件進行。

結(jié) 果

1 大鼠DRG神經(jīng)元H+門控電流的分類

在實驗中記錄的H+門控電流，觀察到在pH 5.0時H+門控電流形狀最為穩(wěn)定，因此以pH 5.0時記錄的電流為準劃分H+門控電流的類型有4種，見圖1。

Figure 1. Four types of H+-gated currents in rat DRG neurons, T(transient)-type, S(sustained)-type, B(biphasic)-type and O(opposite)-type.

(1) 短暫內(nèi)向電流(T-type，transient inward current)——T型H+門控電流呈快激活和快失活的特點。(2) 持續(xù)內(nèi)向電流(S-type， sustained inward current)—— S型H+門控電流呈快或中激活，無失活或極緩慢失活。(3) 雙相內(nèi)向電流(B-type， biphasic inward current)—— B型H+門控電流呈快速激活，其失活相包括快速失活和無失活或極緩慢失活2種成分。即失活相包括短暫和持續(xù)成分。(4) 反向電流(O-type， opposite current)—— O型H+門控電流包含內(nèi)、外2個方向的電流成分。

2 共加SP和H+對H+門控電流的增強作用

在觀察的100例細胞中發(fā)現(xiàn)有34例細胞SP對S型和B型中持續(xù)成分的H+門控電流有明顯增強作用，這種電流幅值增強達(85.53±22.93)%，出乎意外的是約81.8%(9/11)細胞的這種增強效應(yīng)不能被選擇性的SP受體NK1拮抗劑GR82334(3.6×10-6mol/L;含有11個氨基酸肽類)阻斷(n=11,P>0.05)，GR82334單獨作用未見有電流產(chǎn)生；而非肽類的SP受體NK1拮抗劑WIN51708(10-7mol/L) 對約75%的DRG神經(jīng)元可明顯阻斷這種增強效應(yīng)(n=8,P<0.05),見圖2。

Figure 2. Enhancement of H+-gated currents caused by both SP and H+. A,B and C: current traces showed enhancement of the sustained component of H+-gated currents caused by both SP and H+ ;D: the enhancement could not be blocked by SP receptor antagonist, GR82334;E:other antagonist WIN51708 could block the enhancement; F: enhancement caused by both SP and H+ in the same single DRG neuron; G: GR82334 could not block the enhancement; H: WIN51708 could block the enhancement.Mean±SD.n=34，11 or 18. *P<0.05 vs pH 5.0; #P<0.05 vs pH 5.0+SP.

3 共加SP和H+對H+門控電流的抑制作用

在所觀察的100例細胞中發(fā)現(xiàn)有35例SP對S型和B型中持續(xù)成分的H+門控電流有明顯抑制作用,抑制的幅值達(48.46±4.45)%，并且約88.9%(8/9)細胞的這種抑制效應(yīng)不能被SP受體NK1拮抗劑GR82334所阻斷(n=9，P>0.05),見圖3。

Figure 3. Inhibition of H+-gated currents by both SP and H+. A and B: current trace showed inhibition of the currents caused by both SP and H+; C: GR 82334 could not block the inhibitory effect of SP;D: shows inhibition of H+-gated current caused by both SP and H+ ;E: the inhibition could not be blocked by GR82334.Mean±SD.n=35 or 9.*P<0.05 vs pH 5.0.

4 胞內(nèi)透析GDP-β-S后不能阻斷SP對H+門控電流的調(diào)制作用

在所觀察的2例細胞中發(fā)現(xiàn)通過胞內(nèi)透析技術(shù)在細胞內(nèi)液中加入GDP-β-S(5×10-4mol/L)后不能消除SP對ASICs電流的調(diào)制作用，見圖4。為排除實驗操作技術(shù)問題，在實驗中做了2例SP(10-7mol/L)對ATP(10-6mol/L)的調(diào)制作用發(fā)現(xiàn)通過同樣胞內(nèi)透析技術(shù)操作在細胞內(nèi)液中加入GDP-β-S(5×10-4mol/L)后可明顯阻斷SP對ATP的增強作用。目前SP對ATP的調(diào)制作用通過G-蛋白偶聯(lián)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑已基本明確。由此GDP-β-S不能阻斷SP對ASICs電流的調(diào)制作用是很有意義的陰性結(jié)果。

Figure 4. After intracellular dialysis, GDP-β-S could not block the enhanced effects of SP on H+-gated currents.

討 論

1981年Krishtal等[9]首次在大鼠三叉和背根神經(jīng)節(jié)上對ASICs進行了描述。H+是目前僅知的ASICs激活物。

1 大鼠DRG神經(jīng)元H+門控電流的分類

由于ASICs在生理和病理過程中發(fā)揮的重要作用，最近幾年來越來越多的學(xué)者把焦點轉(zhuǎn)向了對ASICs的研究。為了便于實驗的研究，不少學(xué)者試著將記錄到的ASICs電流類型分類，但很多學(xué)者對ASICs電流的類型的分類比較繁瑣，不實用。到目前為止對ASICs電流的類型仍沒有統(tǒng)一的劃分。

我室依據(jù)在pH 5.0條件下記錄的H+門控電流的動力學(xué)特征，將急性分離的DRG神經(jīng)元上的H+門控電流分為4類：T型(短暫內(nèi)向電流，transient inward current)、S型(持續(xù)內(nèi)向電流，sustained inward current)、B型(雙相內(nèi)向電流，biphasic inward current)和O型(反向電流，opposite current)。T型H+門控電流呈快速激活和失活，即激活迅速并且立即可回復(fù)到原有電流水平；S型H+門控電流激活快但失活極其緩慢或無失活；B型H+門控電流激活快，但失活相包括快和持續(xù)2種成分，即快速失活到某一值后電流不再失活或失活非常緩慢；O型H+門控電流包括內(nèi)、外2個方向的電流，先為內(nèi)向電流同S型，在撤藥時出現(xiàn)一外向電流成分。這4種電流類型較為全面地囊括了在急性分離的DRG神經(jīng)元上記錄的H+門控電流的形狀和其各自獨特的失活動力學(xué)特征。這種分類方法簡單實用。我室Li等[10]依據(jù)此方法對ATP激活的電流類型分類已得到了國內(nèi)外學(xué)者的普遍認可。

2 P物質(zhì)對大鼠DRG神經(jīng)元膜H+門控電流的調(diào)制作用及其機制

P物質(zhì)是哺乳動物體內(nèi)另一種由11個氨基酸殘基組成的神經(jīng)肽， 也是存在人體內(nèi)主要的神經(jīng)遞質(zhì)[11]，由小的初級傳入神經(jīng)元釋放并存在這些神經(jīng)元內(nèi)[12]。SP與 NKA、NKB共同組成哺乳動物的速激肽家族。秦立鵬等[13]人發(fā)現(xiàn)P物質(zhì)還有增強失血性休克大鼠離體淋巴管的泵功能。近年來有研究發(fā)現(xiàn)ASICs在傳導(dǎo)痛覺的外周神經(jīng)節(jié)小細胞中與SP共同表達，其表達密度都可被炎癥所誘導(dǎo)。另外很多證據(jù)表明大鼠DRG神經(jīng)元膜上存在SP受體[14-15]。SP受體NK1屬于G蛋白偶聯(lián)受體，其激活后主要通過PLC-DAG-PKC通路發(fā)揮作用。那么ASICs和SP之間有什么樣的互相作用呢？SP是否能作用于ASICs一直未見報道。

在急性分離的DRG神經(jīng)元上記錄的ASICs電流的4種類型中，S型占多數(shù)，O型包含有外向成分，電流成分較為復(fù)雜，另外T型主要集中在小細胞，且出現(xiàn)機率較少，B型中的持續(xù)成分形成機制同S型。所以本實驗重點研究SP對S型和B型持續(xù)成分的調(diào)制作用。在實驗中將SP的濃度定在10-7mol/L，H+的濃度為pH 5.0。結(jié)果發(fā)現(xiàn)SP對H+門控電流S型和B型持續(xù)成分的調(diào)制作用表現(xiàn)為：增強或抑制。在對所觀察的100例細胞中這2種作用出現(xiàn)比率基本均等，但SP對H+門控電流幅值的增強作用強于其抑制作用。很顯然，SP對H+門控電流的增強作用有著很重要的生理病理學(xué)意義，為SP和ASICs之間的相互作用加劇了炎癥痛提供了電生理學(xué)的依據(jù)，從而為炎癥痛的治療找到了又一個可干預(yù)靶點。同時我們推測在中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)也會同樣存在SP對H+門控電流幅值的增強作用，兩者的相互增強作用加劇腦缺血損傷。如果是這樣，那么靶向SP和ASICs的治療為腦卒中病人提供了又一個新的治療思路。

可為什么在同種條件下SP對H+門控電流表現(xiàn)為抑制作用呢？目前無法解釋做出合理的解釋，值得探討。

在實驗中發(fā)現(xiàn)，非肽類的SP受體NK1拮抗劑 WIN51708 對75%急性分離的DRG神經(jīng)元可明顯阻斷SP對H+門控電流的增強效應(yīng)(P<0.05)。而對25%的DRG神經(jīng)元則沒有作用。由此推斷對大部分的DRG神經(jīng)元來說，NK1受體參與了SP對ASICs的調(diào)制作用。由于NK1受體屬于G-蛋白偶聯(lián)受體，其激活后主要通過PLC-DAG-PKC通路發(fā)揮作用。推測SP與NK1受體結(jié)合后，通過G蛋白偶聯(lián)到PLC，后者將PIP2水解為IP3和DAG。IP3可促使內(nèi)質(zhì)網(wǎng)Ca2+釋放，DAG可以激活PKC，而PKC磷酸化ASIC亞基從而增強H+門控電流的S型和B型持續(xù)成分。為了證實我們的推測，通過胞內(nèi)透析技術(shù)往標準內(nèi)液中加入G蛋白類似物GDP-β-S在所觀察的2例細胞中發(fā)現(xiàn)加入GDP-β-S后不能阻斷SP的作用，由此推測在一部分細胞上(很可能是小部分)SP是通過和ASICs的某一位點直接結(jié)合來發(fā)揮對ASICs的調(diào)制作用的。由于目前所做胞內(nèi)透析的細胞例數(shù)較少尚需要進一步實驗驗證。

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