GRK5對大鼠星形膠質(zhì)細胞活化的作用及其機制研究*

張 運, 王莉莉, 趙 茜, 馬士程, 賀茂林

(首都醫(yī)科大學附屬北京世紀壇醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，北京 100038)

星形膠質(zhì)細胞(astrocyte, AS) 是中樞神經(jīng)系統(tǒng)具有免疫吞噬功能的細胞, 它在致炎因素作用下被激活?；罨腁S既具有保護神經(jīng)元的作用, 又能分泌細胞毒因子、炎癥因子、補體蛋白而損害神經(jīng)元。近年來, 神經(jīng)膠質(zhì)細胞功能受到研究者的普遍重視[1-2]。 它與多種疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關, 如阿爾茨海默病、腦血管病、帕金森氏病等，大多數(shù)學者認為AS活化引起的炎癥反應、氧化應激可能是上述疾病的重要病理機制之一[3-4]。核因子κB(nuclear factor-kappa B, NF-κB)是一種廣泛存在于體內(nèi)多種細胞的核轉(zhuǎn)錄因子, 參與多種疾病病理生理、多種基因調(diào)控、機體免疫應答和細胞凋亡的信號轉(zhuǎn)導過程[5]。大量研究證實，NF-κB可通過活化星形膠質(zhì)細胞與小膠質(zhì)細胞，誘發(fā)炎癥反應與氧化應激，從而引起神經(jīng)元損傷、凋亡[5-6]。G蛋白偶聯(lián)受體激酶5 (G-protein-coupled receptor kinase 5, GRK5) 是調(diào)節(jié)G蛋白偶聯(lián)受體(G-protein-coupled receptors,GPCRs)的一類絲蘇氨酸激酶, 其主要功能是使激活的GPCRs 脫敏, 從而中止后者介導的信號轉(zhuǎn)導通路[7]。近年研究報道，GRK5能通過誘導NF-κB抑制劑IκBα的高表達而抑制NF-κB[8]。本實驗通過研究對大鼠皮層星形膠質(zhì)細胞GRK5基因沉默后NF-κB表達變化及其與膠質(zhì)細胞活化、炎癥反應和氧化應激的關系，探討GRK5對NF-κB相關膠質(zhì)細胞活化產(chǎn)生影響的可能機制，為神經(jīng)炎性疾病研究提供實驗依據(jù)。

材 料 和 方 法

1 材料

新生24 h內(nèi)的Wistar大鼠(SPF級), 由北京大學醫(yī)學部實驗動物中心提供。DMEM/F12培養(yǎng)基、胎牛血清購自Gibco。N-乙酰半胱氨酸(N-acetylcysteine, NAC)、DMSO、MgATP和HEPES購自Sigma。BCA蛋白定量試劑盒購自Pierce。硝酸纖維素膜購自Millipore。GRK5抗體和IκBα抗體購自Santa Cruz。、膠質(zhì)細胞原纖維酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein, GFAP)抗體、活化半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(caspase-3)抗體、 p65抗體及β-actin抗體購自Sigma。Ⅱ抗購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。 LipofectamineTMRNAiMAX購于Invitrogen。大鼠腫瘤壞死因子α (tumor necrosis factor α, TNF-α) ELISA 試劑盒購自BD Pharmigen; 一氧化氮(nitric oxide, NO)檢測試劑盒購自Promega。超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)試劑盒為南京建成生物工程研究所產(chǎn)品。

2 體外培養(yǎng)大鼠皮層星形膠質(zhì)細胞

消毒斷頭, 取出大腦, 剝?nèi)ボ浤X膜, 分離出大腦皮層, 剪碎后用0.125%胰酶消化,將細胞數(shù)調(diào)整為(3～5)×108/L 種植于培養(yǎng)瓶內(nèi), 在37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng), 每3～4 d換液1次, 見細胞長成致密單層后進行傳代培養(yǎng)、篩選、純化, 用免疫組化法檢測GFAP陽性細胞達95%以上時可進行實驗檢測[9]。

3 實驗分組

3.1GRK5基因沉默 將細胞接種于涂有多聚賴氨酸蓋玻片的24孔培養(yǎng)板，并加入DMEM培養(yǎng)液進行siRNA轉(zhuǎn)染實驗。4 μL LipofectamineTMRNAiMAX和5 μL 20 μmol/L siRNA分別加入100 μL Opti-MEM中并靜置5 min。將2種溶液混合后再于室溫靜置20 min。將混合液加入培養(yǎng)的細胞中, 混勻。采用Western blotting檢測siRNA干擾效率。GRK5 siRNA以及control siRNA由Dharmacon公司合成。GRK5 siRNA的干擾序列為 5’-AAG CCG UGC AAA GAA CUC UUU-3’; control siRNA的干擾序列為 5’-AAU UCU CCG AAC GUG UCA CGU-3’。

3.2NAC干預 參照文獻用含5 mmol/L NF-κB抑制劑NAC的DMEM培養(yǎng)液培育24 h，給予置換培養(yǎng)液[10]。

3.3分組 按照RNA干擾沉默GRK5與加入NF-κB抑制劑NAC干預的不同，可分為4組：(1)control siRNA處理的對照組;(2)control siRNA+NAC的NF-κB抑制組;(3)GRK5 siRNA處理的GRK5 siRNA組;(4)GRK5 siRNA處理+NAC的GRK5 siRNA+NF-κB抑制組。

4 培養(yǎng)細胞分泌TNF-α和NO濃度的檢測

收集各組細胞培養(yǎng)的上清,離心去除細胞碎片,采用雙抗體夾心ELISA 法, 按TNF-α的ELISA 檢測試劑盒說明檢測上清中TNF-α濃度。采用常規(guī)Griess法測定培養(yǎng)細胞上清中NO濃度, 在檢測前離心去除細胞碎片,按NO的檢測試劑盒說明進行操作檢測。標準溶液用DMEM(+10%FBS) 溶液進行稀釋和配制，濃度為(μmol/L): 0、1、2、5、10、20、40、60和100，樣品為細胞培養(yǎng)液上清。每孔分別加上述溶液、Griess reagent Ⅰ和Griess Reagent Ⅱ溶液各50 μL。即刻用酶標儀在540 nm 波長處測定吸光度值。繪制標準曲線，然后根據(jù)標準曲線得出相應的數(shù)值。

5 SOD活性的測定

作用終止后,吸去培養(yǎng)液, 以冰生理鹽水洗滌細胞2次, 用細胞刮板刮下細胞, 冰生理鹽水收集, 在冰浴中用超聲細胞破碎儀破碎細胞, 顯微鏡下觀察無完整細胞后, 應用自動生化分析儀和紫外分光光度計嚴格按照試劑盒說明測定細胞內(nèi)SOD 活性, 結(jié)果分別以103U/(g protein)表示。

6 p65、TNF-α、IL-1β及誘導型NO合成酶(indu-cible nitric oxide synthase, iNOS) mRNA 的測定

利用Trizol 法提取細胞RNA, 用紫外分光光度計測量總RNA 的A260和A280值, 計算RNA的濃度和純度。取1 μg總RNA, 以Oligo dT 為引物, 按Fermentas 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書要求先將mRNA 逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。以1 μL cDNA 為模板, 在25 μL real-time PCR 體系, 于ABI PRISM 7000實時定量PCR儀上進行基因擴增(95 ℃ 30 s; 59 ℃ 60 s; 72 ℃ 30 s), 共35個循環(huán); 72 ℃ 10 min。實時監(jiān)測記錄熒光強度。擴增完畢后進行熔解曲線分析。每個樣品重復3遍?；虮磉_變化倍數(shù)采用2-ΔΔCt法進行比較，管家基因GAPDH作為內(nèi)對照, ΔCt=Ct目的基因-Ct管家基因, ΔΔCt=ΔCt實驗組-ΔCt對照組。

引物采用Primer Premier 5.0進行設計, IL-1β上游引物 5’-CTC CAT GAG CTT TGT ACA AGG-3’, 下游引物 5’-TGC TGA TGT ACC AGT TGG GG-3’, 擴增片段長度245 bp; TNF-α上游引物 5’-TGA ACT TCG GGG TGA TCG GTC-3’, 下游引物 5’-AGC CTT GTC CCT TGA AGA GAA C-3’,擴增片段長度295 bp; iNOS上游引物 5’-CCA AGA ACG TGT TCA CCA TG-3’, 下游引物 5’-GAT GTC CAG GAA GTA GGT GAG G-3’,擴增片段長度317 bp; p65上游引物 5’-CAA GTG CCT TAA TAG CAG GGC AAA-3’, 下游引物 5’-AGA GCT AGA AAG AGC AAG AGT CCA AT-3’, 擴增片段長度249 bp; GAPDH上游引物 5’-TGA AGC AGG CAT CTG AGG G-3’, 下游引物 5’-CGA AGG TGG AAG AGT GGG AG-3’, 擴增片段長度347 bp。

7 免疫熒光檢測GFAP與活化caspase-3的表達

經(jīng)多聚甲醛固定后的各組細胞, 采用免疫熒光染色。0.2% Triton X-100處理10 min, 并用10% 牛血清白蛋白室溫孵育1 h 封閉無關抗原。加入Ⅰ抗4 ℃孵育24 h, PBS 充分漂洗后, 加入標記有熒光染料的Ⅱ抗中室溫孵育1 h。Ⅰ抗包括兔來源抗GFAP抗體和羊來源抗活化caspase-3抗體 (Sigma)；Ⅱ抗包括羊抗兔FITC 和兔抗羊TRITC(北京中杉金橋)。陰性對照以PBS代替I抗。DAPI(Sigma)用于染細胞核。倒置熒光顯微鏡采集圖片。

熒光顯微鏡下觀察。GFAP為綠色熒光，caspase-3為紅色熒光。利用Image-Pro Plus圖像分析系統(tǒng)測定所選區(qū)域caspase-3+細胞個數(shù)，并求得其占區(qū)域內(nèi)總體細胞(DAPI+)百分比。

8 細胞蛋白的提取以及Western blotting檢測蛋白表達

倒掉培養(yǎng)液, 用0.01 mol/L PBS 清洗2次后, 加上2 mL 0.01 mol/L PBS后放冰上孵育5 min, 將PBS倒掉甩干, 加入100 μL細胞裂解液(50 mmol/L Tris-HCl，pH 6.8，10 mmol/L EDTA，2% SDS，5 mmol/L DTT，0.5 mmol/L PMSF) 混勻后, 放冰上孵育15 min, 將裂解液刮下, 吸入EP管中, 12 000×g離心5 min(4 ℃)后提取上清液。BCA試劑盒定量蛋白。取等量樣本總蛋白, 加入5× SDS loading buffer, 混勻后煮沸5 min, 10% SDS-PAGE電泳分離, 電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜(300 V, 1 h), 含5%脫脂奶粉的TBST封閉,分別加入GRK5抗體(1∶200)、p65抗體(1∶500)、 IκBα抗體(1∶200)及β-actin(1∶5 000)Ⅰ抗, 4 ℃過夜。次日TBST洗膜, 辣根過氧化物酶標記的Ⅱ抗室溫孵育1 h, TBST洗膜, ECL顯示特異條帶。β-actin抗體作為內(nèi)參照。利用柯達數(shù)碼1D軟件對每個條帶灰度進行定量分析。

9 統(tǒng)計學處理

數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差(mean±SD)表示。采用SPSS 11.0統(tǒng)計軟件包處理。所有數(shù)據(jù)進行正態(tài)性檢驗。兩組樣本均數(shù)比較采用兩個獨立樣本的t檢驗,多組間比較采用單因素方差分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

1 細胞形態(tài)學觀察

倒置顯微鏡下, 初接種的細胞呈球形, 4～6 h后開始貼壁, 伸出突起, 成片狀聚集生長。隨著培養(yǎng)時間的延長, 細胞體積逐漸增大, 突起伸長。傳代3次以后,細胞形態(tài)趨于一致, 以纖維性星形膠質(zhì)細胞為主。胞體相對較小, 但突起較長，見圖1A。

2 RNA干擾沉默GRK5基因后其蛋白的表達

將細胞克隆接種于涂有多聚賴氨酸蓋玻片的24孔培養(yǎng)板，并加入DMEM培養(yǎng)液進行siRNA轉(zhuǎn)染實驗。Western blotting檢測發(fā)現(xiàn)經(jīng)GRK5基因沉默后細胞內(nèi)GRK5蛋白表達較對照組顯著減少,見圖1B。

3 免疫熒光法檢測各組星形膠質(zhì)細胞形態(tài)及凋亡率

對經(jīng)過不同干預后的各組星形膠質(zhì)細胞用免疫熒光法進行鑒定并檢測其凋亡率。與對照組相比, NF-κB抑制組細胞GFAP熒光強度明顯減弱，突起減少;GRK5 siRNA組細胞總數(shù)未見明顯差異，但是細胞GFAP熒光強度增強，胞體肥大，突起增多;GRK5 siRNA+NAC組與對照組相比細胞形態(tài)及突起數(shù)量則無明顯變化;GRK5 siRNA組與NF-κB抑制組及GRK5 siRNA+NAC組相比GFAP熒光強度增強，胞體肥大，突起增多，見圖2A。

NF-κB抑制組中表達活化caspase-3的細胞顯著少于對照組(P<0.05)；GRK5 siRNA組活化caspase-3明顯高于對照組(P<0.01)；而GRK5 siRNA+NAC組表達活化caspase-3的細胞比率明顯低于GRK5 siRNA組(P<0.01)，與對照組無明顯差異(P>0.05), 但是仍然顯著高于NF-κB抑制組(P<0.01)，見圖2A、B。上述結(jié)果表明抑制NF-κB可使星形膠質(zhì)細胞凋亡減少，而GRK5基因沉默可導致星形膠質(zhì)細胞凋亡增加。盡管向GRK5 siRNA組細胞培養(yǎng)液中加入NF-κB抑制劑NAC能部分減少凋亡, 但是與NF-κB抑制組比較仍存在顯著差異。

Figure 1. Morphology of the cultured astrocytes from brain cortex of newborn Wistar rats (A) and expression of GRK5 protein after GRK5 gene silencing. Scale bar=50 μm.

4 各組星形膠質(zhì)細胞中p65、TBF-α、IL-1β及iNOS mRNA的表達

實時熒光定量PCR檢測發(fā)現(xiàn), NF-κB抑制組細胞p65 mRNA水平顯著低于對照組(P<0.01)；GRK5 siRNA組細胞中p65 mRNA水平顯著高于對照組(P<0.01)；而GRK5 siRNA+NAC組p65 mRNA水平顯著低于對照組和GRK5 siRNA組(P<0.05或P<0.01)，但是仍然顯著高于NF-κB抑制組 (P<0.01)，見圖2C。這表明GRK5基因沉默可導致星形膠質(zhì)細胞NF-κB表達增加。

與此同時，NF-κB抑制組細胞TNF-α、IL-1β及iNOS mRNA水平低于對照組(P<0.05或P<0.01);GRK5基因沉默可顯著增加細胞中TNF-α、IL-1β及iNOS mRNA水平(P<0.01)；而GRK5 siRNA+NAC組上述細胞因子mRNA水平顯著低于GRK5 siRNA組(P<0.01)，與對照組無明顯差異(P>0.05), 但是仍然顯著高于NF-κB抑制組(P<0.01)，見圖2C。這表明GRK5基因沉默可導致星形膠質(zhì)細胞炎癥因子顯著升高。

Figure 2. Identification of the cultured astrocytes, and the expression of activated caspase-3 and the mRNA levels of NF-κB p65, TNF-α, IL-1β and iNOS in the astrocytes. A: expression of GFAP (a～d) and activated caspase-3 (e～h) detected by immunofluorescence staining; B: semi-quantitative analysis of the ratio of activated caspase-3-positive cells to DAPI-positive cells; C: the mRNA levels of NF-κB p65, TNF-α, IL-1β and iNOS detected by real-time PCR. Scale bar=50 μm. Mean+SD. n=6. *P<0.05, **P<0.01 vs control siRNA group; &&P<0.01 vs GRK5 siRNA group; ##P<0.01 vs control siRNA +NAC group.

5 各組星形膠質(zhì)細胞分泌TNF-α、NO濃度的檢測與SOD活性的測定

ELISA檢測發(fā)現(xiàn)，對照組的星形膠質(zhì)細胞分泌處于較低水平的TNF-α和NO;NF-κB抑制劑NAC能降低TNF-α和NO分泌 (P<0.01);GRK5基因沉默后細胞分泌TNF-α和NO水平顯著高于對照組(P<0.01)；雖然GRK5 siRNA+NAC組TNF-α和NO水平與GRK5 siRNA組相比均顯著降低(P<0.01)，但仍然高于對照組(TNF-αP<0.01, NOP<0.05)，且顯著高于NF-κB抑制組(P<0.01),見圖3A、B，可見GRK5基因沉默可以刺激星形膠質(zhì)細胞分泌NO和TNF-α。

Figure 3. Effects of GRK5 siRNA on the secretion of TNF-α (A) and NO (B) and the activity of SOD (C) in astrocytes. Mean±SD. n=6. *P<0.05, **P<0.01 vs control siRNA group; &P<0.05， &&P<0.01 vs GRK5 siRNA group; ##P<0.01 vs control siRNA+NAC group.

酶活性檢測發(fā)現(xiàn)，NF-κB抑制組SOD活性明顯高于對照組(P<0.01);GRK5基因沉默后細胞SOD活性顯著低于對照組(P<0.01);雖然GRK5 siRNA+NAC組SOD活性與GRK5 siRNA組相比明顯升高(P<0.05)，但仍顯著低于對照組(P<0.01)與NF-κB抑制組(P<0.01)，見圖3C，可見GRK5基因沉默可抑制星形膠質(zhì)細胞內(nèi)SOD活性。

6 各組細胞中GRK5、p65及IκBα的表達

Western blotting檢測發(fā)現(xiàn)NF-κB抑制劑NAC處理膠質(zhì)細胞后不影響GRK5表達, 但可導致IκBα表達增加及p65表達減少(P<0.01)。GRK5基因沉默后GRK5表達低于對照組，其差異有統(tǒng)計學意義，同時IκBα蛋白表達較對照組顯著降低, p65蛋白表達較之對照組顯著增加(P<0.01)。與GRK5基因沉默組比較，GRK5 siRNA+NAC組GRK5表達無明顯改變。與GRK5 siRNA組相比較，GRK5 siRNA+NAC組能增加IκBα蛋白表達, 減少p65蛋白表達水平(P<0.05)，其p65蛋白表達水平與對照組無明顯差異(P>0.05)，但二者與NF-κB抑制組比較仍存在顯著差異(P<0.01)，見圖4。上述結(jié)果表明GRK5基因沉默可能抑制IκBα蛋白的表達，從而增加NF-κB蛋白表達。

Figure 4. Western blotting assay for GRK5, IκBα and p65 protein expression. Mean±SD. n=6. **P<0.01 vs control siRNA group; &P<0.05 vs GRK5 siRNA group; ##P<0.01 vs control siRNA+NAC group.

討 論

星形膠質(zhì)細胞與神經(jīng)元之間存在復雜的相互作用, 以維持神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定。當中樞神經(jīng)系統(tǒng)遭遇炎癥、缺血、損傷時，AS從靜息狀態(tài)快速轉(zhuǎn)變?yōu)榛罨癄顟B(tài), 激活后AS對神經(jīng)元的影響包括兩方面: (1)通過分泌大量的神經(jīng)營養(yǎng)因子、細胞因子和基質(zhì)分子促進軸突再生, 保護神經(jīng)元免受損傷, 有利于損傷后神經(jīng)元的功能恢復; (2)可產(chǎn)生細胞炎癥因子、補體、氧自由基等, 啟動炎癥反應、氧化應激，促進神經(jīng)細胞的損傷和死亡, 加重疾病進程[11]。 而NF-κB是介導許多免疫與炎癥反應的中心物質(zhì)。大量研究證實，NF-κB可通過活化AS與小膠質(zhì)細胞，誘發(fā)炎癥反應與氧化應激，從而引起神經(jīng)元損傷、凋亡[5-6]。近年研究報道，GRK5敲除小鼠老化時表現(xiàn)出β-淀粉樣蛋白生成增加,誘發(fā)炎癥反應并引起細胞凋亡[12]。更有研究發(fā)現(xiàn)GRK5能通過誘導IκBα表達增高,從而抑制NF-κB的表達[8]，提示GRK5可能參與NF-κB激活星形膠質(zhì)細胞及引起的相關反應。

已知IκBα是NF-κB的抑制蛋白。在靜息狀態(tài)下，染色體區(qū)域維持蛋白1(chromosome region maintenance 1, CRM-1)通過識別IκBα C末端的核轉(zhuǎn)出序列(nuclear exporting sequence, NES)將IκBα/NF-κB復合體轉(zhuǎn)出細胞核，NF-κB的p65和p50亞單位以失活狀態(tài)存在于細胞質(zhì)中[8]。當上游信號激活IκB激酶(IκB kinase，IKK)后，活化的IKK會泛素化、磷酸化并降解IκBα，使得NF-κB 2個亞單位從失活狀態(tài)活化，并從細胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到細胞核內(nèi)(尤其是p65亞單位)，與相應的炎癥相關基因結(jié)合，啟動炎癥細胞因子轉(zhuǎn)錄，誘發(fā)炎癥[5-6]。研究報道GRK5同源調(diào)節(jié)域能與IκBα N末端相結(jié)合，掩蓋了IκBα C末端NES功能區(qū)，使得IκBα/NF-κB復合體在核內(nèi)聚集，抑制了NF-κB的活化[8]。本研究通過Western blotting檢測發(fā)現(xiàn)將培養(yǎng)膠質(zhì)細胞GRK5基因沉默后，IκBα表達減弱，p65亞單位表達增強。該結(jié)果表明GRK5基因沉默可引起星形膠質(zhì)細胞NF-κB活化，推測GRK5基因沉默解除了對IκBα C末端NES功能區(qū)的抑制，IκBα可順利轉(zhuǎn)出細胞核，易于被降解失活，從而激活NF-κB。

已有大量研究證實，TNF-α等炎癥因子的分泌可活化星形膠質(zhì)細胞?；罨男切文z質(zhì)細胞在損傷早期也可加快釋放致炎因子如TNF-α和IL-1β, 進一步激活NF-κB，加重炎癥變化[5-6]。本實驗熒光顯微鏡下觀察到GRK5 siRNA組GFAP熒光強度增強、胞體肥大、突起增多,形態(tài)學上提示星形膠質(zhì)細胞活化[13]。此外，實時熒光定量PCR結(jié)果顯示，GRK5基因沉默刺激膠質(zhì)細胞TNF-α、IL-1β和iNOS mRNA表達水平增高，結(jié)合檢測到該組膠質(zhì)細胞IκBα表達減弱，p65亞單位表達增多，推測與NF-κB活化刺激相關炎癥因子表達增加有關[14]。收集各組細胞培養(yǎng)上清后，檢測發(fā)現(xiàn)GRK5基因沉默刺激膠質(zhì)細胞分泌TNF-α增多，表明GRK5基因沉默誘發(fā)了炎癥反應，而炎癥反應也可加劇AS活化、激活NF-κB，從而進一步分泌炎癥因子。本實驗還發(fā)現(xiàn)GRK5基因沉默刺激膠質(zhì)細胞分泌NO增多，且酶活性檢測結(jié)果顯示，SOD活性降低。SOD是自由基清除酶,GRK5基因沉默后SOD活性下降，也反映出膠質(zhì)細胞內(nèi)源性抗氧化能力下降，結(jié)合檢測到細胞內(nèi)iNOS mRNA表達增多，表明GRK5基因沉默誘發(fā)了氧化應激反應，可能與AS活化或NF-κB活性增強相關。研究顯示，活化的星形膠質(zhì)細胞可誘導iNOS表達增多,產(chǎn)生的一氧化氮導致過亞硝酸鹽生成和氧化應激反應，導致神經(jīng)元損傷和凋亡[15]。亦有研究報道，NF-κB可通過上調(diào)環(huán)氧化酶2增加有害自由基的產(chǎn)生[16]。Caspase家族是調(diào)節(jié)細胞凋亡的關鍵成員, 它的級聯(lián)激活引發(fā)細胞發(fā)生凋亡特異改變, 并最終崩解。Caspase-3是caspase級聯(lián)反應中最關鍵的效應蛋白酶, 通常以酶原的形式存在, 激活后通過酶解其特異性底物, 使細胞發(fā)生凋亡[17]。本實驗發(fā)現(xiàn)GRK5基因沉默后活性caspase-3表達增多，NF-κB抑制使得活性caspase-3表達顯著減少。而GRK5基因沉默聯(lián)合NAC抑制組活化caspase-3的表達明顯低于GRK5 siRNA組，與對照組無明顯差異, 但是仍然顯著高于NF-κB抑制組。提示星形膠質(zhì)細胞GRK5基因正常表達可能通過抑制caspase-3的活化而發(fā)揮抗凋亡作用。

本實驗結(jié)果表明，GRK5基因沉默可能通過刺激NF-κB表達增多引起星形膠質(zhì)細胞活化。推測GRK5的正常表達可通過抑制星形膠質(zhì)細胞活化發(fā)揮抗炎癥反應、抗氧化作用。星形膠質(zhì)細胞在神經(jīng)變性病的發(fā)病機制中有著不可忽視的作用,如何調(diào)控膠質(zhì)細胞的功能使其向保護神經(jīng)元的方向發(fā)展值得深入探索。

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