沙利度胺抑制TGF-β1誘導(dǎo)的HELF細(xì)胞中結(jié)締組織生長因子基因啟動(dòng)子的激活*

王達(dá)安， 林逸心， 王 崢， 桑朝磊， 陸大祥， 王華東， 胡巢鳳， 魏 偉， 蔣建偉， 付詠梅， 李紅梅

(暨南大學(xué)醫(yī)學(xué)院 1病理生理學(xué)系， 2國家中醫(yī)藥管理局病理生理學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，3口腔系2010級學(xué)生， 4生物化學(xué)系，廣東 廣州 510632)

沙利度胺(thalidomide, THD)目前主要用于麻風(fēng)病、多發(fā)性骨髓瘤等疾病的治療[1]。最新研究資料顯示，沙利度胺也具有良好的抗肺纖維化(pulmonary fibrosis, PF)作用，但確切的藥理機(jī)制尚未闡明[2-4]。轉(zhuǎn)化生長因子β1(transforming growth factor β1, TGF-β1)誘導(dǎo)肺成纖維細(xì)胞等多種細(xì)胞的結(jié)締組織生長因子(connective tissue growth factor, CTGF)表達(dá)增多被認(rèn)為是肺纖維化發(fā)病的重要環(huán)節(jié)[5]。本研究利用螢光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)，觀察沙利度胺對TGF-β1誘導(dǎo)的人胚肺成纖維細(xì)胞(human embryonic lung fibroblast, HELF)CTGF基因啟動(dòng)子激活作用的影響，為闡明沙利度胺抗肺纖維化的藥理機(jī)制提供進(jìn)一步的依據(jù)。

材 料 和 方 法

1 材料

人胚肺成纖維細(xì)胞系(南京凱基)；DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液(Gibco)；小牛血清(浙江天杭)；DM2000 DNA ladder、Taq MasterMix試劑盒和感受態(tài)大腸桿菌DH5α(廣州美津)；限制性內(nèi)切酶HindⅢ和BglⅡ(Toyobo)；T4 DNA連接酶(NEB)；pGL3-Basic質(zhì)粒、pRL-SV40質(zhì)粒和螢光素酶檢測試劑盒Dual-Lucife-rase Reporter Assay System(Promega)；PCR產(chǎn)物抽提試劑盒和去內(nèi)素質(zhì)粒小提試劑盒(Biomiga)，GeneFinderTM核酸染料(夏門致善)；瓊脂糖(無錫NEST)；脂質(zhì)體Polyplus-transfection試劑盒(Bioparc-Bd S. Brant)；人類重組TGF-β1(PeproTech)；THD(Sigma)。

2 方法

2.1構(gòu)建熒光素酶報(bào)告基因重組質(zhì)粒pGL3-CTGFP 根據(jù)人類CTGF基因啟動(dòng)子序列(GenBank登錄號(hào)AF316368)設(shè)計(jì)合成引物(由上海捷瑞合成)，上游引物5’-GCCAGATCTTCCCTTTTTCTGGAAACATTGATGG-3’(BglⅡ)，下游引物5’-CTGAAGCTTCTGACAGGGCGAGGAGGAGGAC-3’(HindⅢ)，以正常人外周血白細(xì)胞cDNA為模板，通過PCR擴(kuò)增獲取人CTGF基因啟動(dòng)子片段，PCR產(chǎn)物長度為1026 bp，反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性2 min，94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，68 ℃ 1 min，共35個(gè)循環(huán)。用限制性內(nèi)切酶BglⅡ和HindⅢ雙酶切載體pGL3-Basic，用T4連接酶將PCR目的片段連接到酶切載體上，構(gòu)成pGL3-CTGFP重組質(zhì)粒，所構(gòu)建重組質(zhì)粒經(jīng)PCR、雙酶切和測序(華大基因)鑒定。

2.2TGF-β1對CTGF基因啟動(dòng)子活性影響的分析 按每孔1×105個(gè)細(xì)胞將HELF細(xì)胞接種于含10%小牛血清的DMEM培養(yǎng)液中，置5% CO2、37 ℃中培養(yǎng)，待細(xì)胞生長至融合度約70%時(shí)，更換不含小牛血清的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h，用脂質(zhì)體Polyplus-transfection(1 μL)將重組質(zhì)粒pGL3-CTGFP(0.5 μg)轉(zhuǎn)染至培養(yǎng)的HELF細(xì)胞中，同時(shí)轉(zhuǎn)染含有海腎螢光素酶的pRL-SV40質(zhì)粒(0.5 μg)作為內(nèi)參照，培養(yǎng)24 h后，按加入的TGF-β1濃度分組(TGF-β1終濃度分別為0、2.5、5、10和20 μg/L)，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后收獲細(xì)胞檢測螢光素酶報(bào)告基因活性變化，其中，0 μg/L TGF-β1為對照組(control group)，其余為實(shí)驗(yàn)組；另外，以同條件培養(yǎng)并轉(zhuǎn)染等量空載體pGL3-Basic和pRL-SV40質(zhì)粒的HELF細(xì)胞(不加TGF-β1)為空白對照組(blank group)，以觀察TGF-β1對CTGF基因啟動(dòng)子作用的量效關(guān)系；為觀察TGF-β1對CTGF基因啟動(dòng)子作用的時(shí)效關(guān)系，按同樣方法進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)、重組質(zhì)粒pGL3-CTGFP和內(nèi)參照質(zhì)粒pRL-SV40轉(zhuǎn)染后24 h，加入5 μg/L TGF-β1，按分組分別培養(yǎng)0 h、12 h、24 h、48 h和72 h后收獲細(xì)胞，其中，加入TGF-β1后培養(yǎng)0 h的為對照組(control group)，其余為實(shí)驗(yàn)組；另外，以同條件培養(yǎng)并轉(zhuǎn)染等量空載體pGL3-Basic和pRL-SV40質(zhì)粒的HELF細(xì)胞(不加TGF-β1)為空白對照組(blank group)；各組細(xì)胞培養(yǎng)至預(yù)定時(shí)間后收獲細(xì)胞，按Dual-Luciferase Reporter Assay System試劑盒操作手冊，使用MD-SpectraMax M5多光譜微孔板閱讀器在560 nm和465 nm波長處檢測2種螢光素酶的發(fā)光值，以螢火蟲螢光素酶發(fā)光值/海腎螢光素酶發(fā)光值的比值為相對螢光素酶活性，以反映CTGF基因啟動(dòng)子的活性；每次每組3復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2.3THD對TGF-β1誘導(dǎo)的CTGF基因啟動(dòng)子活性上調(diào)的干預(yù)作用分析 按2.2的同樣方法進(jìn)行HELF細(xì)胞培養(yǎng)、質(zhì)粒轉(zhuǎn)染；pGL3-CTGFP質(zhì)粒和pRL-SV40質(zhì)粒轉(zhuǎn)染24 h后，加入5 μg/L TGF-β1，并同時(shí)按分組分別加入不同濃度THD (THD終濃度分別為0、25、50和100 μg/L)，繼續(xù)培養(yǎng)24 h收獲細(xì)胞，其中，0 μg/L THD為對照組(control group)，其余為實(shí)驗(yàn)組；另外，以同條件培養(yǎng)并轉(zhuǎn)染等量重組質(zhì)粒pGL3-CTGFP和pRL-SV40質(zhì)粒的HELF細(xì)胞(不加TGF-β1和THD)為無剌激組(non-treatment group)，另一組按前述方法轉(zhuǎn)染pGL3-CTGFP質(zhì)粒后不加TGF-β1，而只加入50 μg/L的THD為單純藥物組(THD組)；培養(yǎng)結(jié)束后，按方法2.2所述測定各組相對螢光素酶活性；每次每組3復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 11.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件處理，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，各組間均數(shù)比較采用方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 重組質(zhì)粒鑒定

重組質(zhì)粒pGL3-CTGFP以前述引物作PCR擴(kuò)增、用限制性內(nèi)切酶BglⅡ和HindⅢ作雙酶切處理，產(chǎn)物經(jīng)1% 瓊脂糖凝膠電泳后，PCR產(chǎn)物和雙酶切產(chǎn)物均在1 000 bp(1 026 bp)左右位置顯示清晰條帶，與預(yù)期的插入片段大小相符，見圖1。應(yīng)用GL2和RV3通用測序引物對pGL3-CTGFP質(zhì)粒進(jìn)行雙向測序鑒定，測序結(jié)果與GenBank上提供的序列完全相同，提示含有人類CTGF基因啟動(dòng)子的螢光素酶報(bào)告基因重組質(zhì)粒pGL3-CTGFP構(gòu)建成功。

Figure 1. Identification of recombinant plasmid pGL3-CTGFP．Lane 1: PCR product; Lane 2: DNA marker; Lane 3: plasmid pGL3-CTGFP digested by restriction endonuclease.

2 TGF-β1對HELF細(xì)胞中CTGF基因啟動(dòng)子活性的影響

從圖2、3可見，不加TGF-β1而單純轉(zhuǎn)染pGL3-CTGFP質(zhì)粒的對照組的相對螢光素酶活性顯著高于僅轉(zhuǎn)染pGL3-Basic空載體的空白對照組(P<0.05)，說明靜息狀態(tài)下HELF細(xì)胞中CTGF也有一定的基礎(chǔ)表達(dá)；而轉(zhuǎn)染pGL3-CTGFP質(zhì)粒并給予不同TGF-β1剌激24 h的各實(shí)驗(yàn)組的相對螢光素酶活性均高于對照組(P<0.05)，其中以5 μg/L TGF-β1實(shí)驗(yàn)組的相對螢光素酶活性最高，其相對螢光素酶活性為對照組的2.16倍，見圖2；在觀察TGF-β1對CTGF基因啟動(dòng)子作用時(shí)效關(guān)系的實(shí)驗(yàn)中，轉(zhuǎn)染pGL3-CTGFP質(zhì)粒后加入TGF-β1培養(yǎng)0 h的對照組的相對螢光素酶活性也顯著高于空白對照組(P<0.05)，而添加TGF-β1后培養(yǎng)不同時(shí)間的各實(shí)驗(yàn)組相對螢光素酶活性均高于對照組(P<0.05)，其中以剌激12 h實(shí)驗(yàn)組的相對螢光素酶活性最高，其相對螢光素酶活性為對照組的2.52倍，見圖3。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，TGF-β1能以劑量依賴和時(shí)間依賴方式顯著上調(diào)HELF細(xì)胞中CTGF基因啟動(dòng)子的活性。

Figure 2. Dose-effect relationship of CTGF gene promoter activation by TGF-β1 in HELF cell line. #P<0.05 vs blank group (with pGL3-Basic alone);*P<0.05 vs control group (with pGL3-CTGFP alone).

Figure 3. Time-effect relationship of aviation of CTGF gene promoter by TGF-β1 in HELF cell line.#P<0.05 vs blank group (with pGL3-Basic alone); *P<0.05 vs control group(with pGL3-CTGFP alone).

3 THD對TGF-β1誘導(dǎo)的HELF細(xì)胞中CTGF基因啟動(dòng)子活性上調(diào)的影響

從圖4可見，轉(zhuǎn)染pGL3-CTGFP質(zhì)粒并添加TGF-β1的對照組的相對螢光素酶活性顯著高于單純轉(zhuǎn)染pGL3-CTGFP質(zhì)粒而不加TGF-β1的無剌激組(P<0.05)；但pGL3-CTGFP質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后同時(shí)加入TGF-β1和不同濃度THD的實(shí)驗(yàn)組，其相對螢光素酶活性又均低于對照組(P<0.05)，其中以添加50 μg/L THD實(shí)驗(yàn)組的相對螢光素酶活性最低，其相對螢光素酶活性僅為對照組的0.61倍。轉(zhuǎn)染pGL3-CTGFP后50 μg/L THD的單純藥物組的相對螢光素酶活性與無剌激組無顯著差別(P>0.05)。此實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，THD能以劑量依賴方式抑制TGF-β1誘導(dǎo)的CTGF基因啟動(dòng)子的激活，而THD對CTGF基因啟動(dòng)子基礎(chǔ)活性無明顯影響。

Figure 4. Effects of thalidomide (THD) on TGF-β1-induced activation of CTGF gene promoter in HELF cell line. #P<0.05 vs non-treatment group (with pGL3-CTGFP alone);*P<0.05 vs control group (with pGL3-CTGFP and TGF-β1， without THD).

討 論

CTGF是一種富含半胱氨酸、分子量為36～38 kD的分泌性多肽，屬于高度保守的即刻早期基因CCN家族成員，1991年由Bradham等[6]首次在人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)，其廣泛存在于人類心臟、肺臟、肝臟、腎臟和結(jié)締組織等多種組織器官中；CTGF具有促有絲分裂、刺激細(xì)胞遷移、介導(dǎo)細(xì)胞黏附、促進(jìn)細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化、促進(jìn)成纖維細(xì)胞增殖和細(xì)胞外基質(zhì)合成，以及促進(jìn)血管形成等生物學(xué)作用；病理情況下，過度表達(dá)的CTGF與肺纖維化、肝硬化、糖尿病腎病等器官纖維化發(fā)病有密切關(guān)系[7]。Lasky等[5]發(fā)現(xiàn)，分別給予博萊霉素敏感的C57BL/6小鼠和博萊霉素抵抗的BALB/c小鼠同等劑量的博萊霉素氣管內(nèi)注入后，只有C57BL/6博萊霉素敏感小鼠發(fā)生肺纖維化及CTGF mRNA表達(dá)的上調(diào)，而BALB/c博萊霉素抵抗小鼠CTGF mRNA的表達(dá)無明顯改變。研究發(fā)現(xiàn)，在特發(fā)性肺纖維化(idiopathic pulmonary interstitial fibrosis，IPF)患者的肺泡灌洗液和纖維化肺組織中CTGF mRNA和蛋白表達(dá)明顯上調(diào)，纖維化組織中的CTGF主要定位于增生的Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞和活化的成纖維細(xì)胞中[8-10]。齊曼古力·吾守爾等[11]報(bào)道，原位雜交和免疫組化顯示IPF患者肺組織的CTGF 的mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)上調(diào)，并與反映纖維化程度的纖維連接蛋白(fibronectin，F(xiàn)N)表達(dá)水平呈正相關(guān)關(guān)系，ELISA檢測結(jié)果表明肺纖維化程度較嚴(yán)重的IPF患者血清中CTGF水平也是升高的。CTGF在器官纖維化發(fā)病中的主要作用包括剌激成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)分化、增殖和分泌膠原[7]；CTGF參與肺成纖維細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化過程，而肌成纖維細(xì)胞是肺纖維化時(shí)肺間質(zhì)中膠原纖維的主要來源。劉小菁等[12]報(bào)道，CTGF-siRNA能抑制肺成纖維細(xì)胞的增殖、表型轉(zhuǎn)化及細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)合成。

TGF-β1是器官纖維化過程中最重要的致纖維化因子之一，在肝、肺、腎等臟器纖維化模型中均有過度表達(dá)；眾多研究表明，CTGF很可能是介導(dǎo)TGF-β1促纖維化作用的一個(gè)重要的下游因子[13]。體外細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)表明，肺成纖維細(xì)胞不但可以表達(dá)CTGF，而且當(dāng)培養(yǎng)液中加入TGF -β1后能夠誘導(dǎo)CTGF表達(dá)明顯增加[5]。Grotendorst等[14]發(fā)現(xiàn)在CTGF啟動(dòng)子-157到-145位有一個(gè)TGF-β反應(yīng)元件(TGF-β response element, TβRE)，該區(qū)域點(diǎn)突變可致TGF-β1對CTGF的誘導(dǎo)作用完全消除；應(yīng)用反義CTGF技術(shù)可以阻斷TGF-β1引起的促纖維化效應(yīng)[15]。雖然TGF-β1和CTGF在器官纖維化發(fā)生機(jī)制中屬同一信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的信號(hào)分子，但TGF-β1具有雙面作用，正常表達(dá)時(shí)發(fā)揮抑制炎癥和細(xì)胞過度增殖的正面效應(yīng)，過度表達(dá)時(shí)才會(huì)引起ECM積聚和組織器官纖維化等負(fù)面效應(yīng)；例如，研究發(fā)現(xiàn)，敲除TGF-β1基因的小鼠因?yàn)槭ρ装Y的抑制作用而在出生后很快死于全身性炎癥[16]，因此限制了拮抗TGF-β1作為靶標(biāo)的治療策略的應(yīng)用。CTGF作為TGF-β1的下游效應(yīng)介質(zhì)，只介導(dǎo)TGF-β1的負(fù)面效應(yīng)，TGF-β1的正面效應(yīng)則由非CTGF途徑所介導(dǎo)；在正常情況下CTGF表達(dá)水平很低，而且主要在間質(zhì)細(xì)胞表達(dá)，其作用也限于結(jié)締組織，拮抗CTGF不會(huì)出現(xiàn)阻斷TGF-β1后可能產(chǎn)生的有害臨床反應(yīng)。因此，相比TGF-β1來說，通過阻斷CTGF達(dá)到的抗纖維化作用應(yīng)該更加特異和安全。

沙利度胺又名反應(yīng)停，化學(xué)名為α-肽胺哌啶酮；沙利度胺在20世紀(jì)50年代曾作為鎮(zhèn)靜劑用于治療妊娠嘔吐, 但其后不久因被發(fā)現(xiàn)可引起嬰兒的肢畸形及無肢畸形(海豹綜合征)，使該藥迅速撤出市場。20世紀(jì)90年代后，由于發(fā)現(xiàn)沙利度胺具有抗炎和免疫調(diào)節(jié)、抗血管生成、抗腫瘤等作用，沙利度胺又被重新以新的適應(yīng)癥開發(fā)使用。美國FDA于1998年批準(zhǔn)了沙利度胺作為麻風(fēng)病的治療用藥，2006年又增加其治療多發(fā)性骨髓瘤的適應(yīng)證[1]。近年臨床及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究表明，沙利度胺對肝、腎、肺等器官纖維化均有一定的治療作用。臨床研究顯示，沙利度胺可提高肺間質(zhì)纖維化老年患者的臨床治療總有效率、胸部CT病變吸收率和肺功能指標(biāo)[2]。Ye等[17]證實(shí)沙利度胺能減少IPF患者肺泡灌洗液中IL-18、IL-8和TNF-α的釋放。Tabata等[3]和羅瀟等[4]分別報(bào)道，沙利度胺能明顯抑制博萊霉素誘導(dǎo)的小鼠肺組織I型膠原α1(collagen type I α1,COL1α1)的表達(dá)。體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)，沙利度胺對TGF-β1誘導(dǎo)的人胚肺成纖維細(xì)胞系HFLF轉(zhuǎn)分化為肌成纖維細(xì)胞的過程有抑制作用，可抑制α-SMA和Ⅲ型膠原mRNA的表達(dá)[18]?？梢?，沙度利胺具有較好的抗肺纖維化作用，然而，其確切的作用機(jī)制至今尚未清楚。為進(jìn)一步了解沙利度胺的抗纖維化作用機(jī)制，本研究利用螢光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)，觀察了沙利度胺對CTGF基因啟動(dòng)子活性的影響。在本實(shí)驗(yàn)研究中，我們首先構(gòu)建了CTGF啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的螢光素酶報(bào)告基因載體pGL3-CTGFP，并將其轉(zhuǎn)染至HELF細(xì)胞，以此作為檢測各種測試物對CTGF基因啟動(dòng)子活性影響的細(xì)胞模型。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染pGL3-CTGFP的HELF細(xì)胞的螢光素酶活性高于轉(zhuǎn)染空載體pGL3-Basic的細(xì)胞，表明CTGF基因在靜息狀態(tài)已有一定水平的表達(dá)；而加入TGF-β1后，轉(zhuǎn)染pGL3-CTGFP的HELF細(xì)胞的螢光素酶活性明顯增強(qiáng)，此作用呈一定量效和時(shí)效關(guān)系，表明TGF-β1確實(shí)是上調(diào)CTGF表達(dá)的重要因素之一；在此基礎(chǔ)上，我們又觀察到在加入TGF-β1的同時(shí)添加沙利度胺，能使CTGF基因啟動(dòng)子的活性又明顯低于單獨(dú)TGF-β1作用下的水平，并呈一定的劑量依賴關(guān)系，這表明沙利度胺對TGF-β1誘導(dǎo)的CTGF啟動(dòng)子激活效應(yīng)有明顯的抑制作用，此作用可能與沙利度胺抗纖維化作用有密切關(guān)系，深入探討其作用的分子機(jī)制有可能為抗肺纖維化治療提供新的思路。

[參 考 文 獻(xiàn)]

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