血管緊張素Ⅱ?qū)θ藛魏思毎礃渫粻罴毎庖吖δ艿挠绊?

黃 東， 陸 浩， 姚 康， 孫愛軍， 鄒云增， 葛均波

(復旦大學附屬中山醫(yī)院心內(nèi)科，上海市心血管病研究所,上海 200032)

血管緊張素II(angiotensin II, Ang II)是腎素-血管緊張素系統(tǒng)(renin-angiotensin system，RAS)激活后產(chǎn)生的主要血管活性物質(zhì)，在多種心血管疾病，如高血壓、心力衰竭和冠心病的發(fā)生發(fā)展中起重要作用[1]。近來的研究發(fā)現(xiàn)，Ang II還與很多炎癥性疾病，如免疫介導的腎小球腎炎、移植物排斥、關節(jié)炎等的發(fā)生發(fā)展有關[2]。另一方面，在免疫過程中起重要抗原遞呈作用及免疫調(diào)節(jié)作用的樹突狀細胞(dendritic cells，DCs)在動脈粥樣硬化發(fā)病中的作用受到廣泛關注[3]。然而，Ang II對樹突狀細胞分化及免疫功能的影響仍不清楚。本研究擬通過體外觀察Ang II對人單核細胞源樹突狀細胞免疫成熟進程及其攝取氧化低密度脂蛋白(oxidized low-density lipoprotein，Ox-LDL)功能的影響，以初步探討Ang II參與動脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展的新機制。

材 料 和 方 法

1 主要試劑

濃縮白細胞由上海市血液中心提供。CD14+免疫磁珠及相關產(chǎn)品購自Milteny Biotech。白細胞介素(interleukin, IL)-12和干擾素(interferon, IFN)-γ的酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)檢測試劑盒購自R&D。淋巴細胞分離液(Histopaque-1077)購自Sigma。RPMI-1640培養(yǎng)基和胎牛血清購自Gibco。重組人粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(recombinant human granulocyte-macrophage colony-stimulating factor,rhGM-CSF)和重組人IL-4(recombinant human interleukin-4, rhIL-4)購自R&D。Ang II和血管緊張素II受體1拮抗劑(angiotensin II receptor 1 antagonist, ARB)洛沙坦購自Sigma。FITC熒光標記的抗人單克隆抗體CD83和人類白細胞抗原DR(human leukocyte antigen DR, HLA-DR)購自BD。Trizol試劑和SuperScript III逆轉(zhuǎn)錄酶購自Invitrogen。GoTaq qPCR Master Mix購自Promega。熒光DiI標記的氧化低密度脂蛋白(DiI-labelled oxidized low-density lipoprotein, DiI-Ox-LDL)購自北京協(xié)生生物科技有限責任公司。

2 DCs的培養(yǎng)及分組[1]

取正常人外周血單采白細胞，經(jīng)淋巴細胞分離液密度梯度離心分離出單個核細胞，PBS重懸后加入Fc拮抗劑和CD14+免疫磁珠，4 ℃孵育20 min，經(jīng)分離柱流洗，分選出純度大于98%的CD14+單核細胞，加入含有10%胎牛血清、100 μg/L rhGM-CSF和50 μg/L rhIL-4的RPMI-1640培養(yǎng)液，隔天換液。在細胞培養(yǎng)的第6天分別加入不同終濃度的Ang II(1、10、100 nmol/L)干預24 h，以PBS作為陰性對照。在細胞培養(yǎng)的第5天加入10 μmol/L洛沙坦預干預24 h，然后加入100 nmol/L Ang II干預24 h，以PBS作為陰性對照。每日觀察細胞生長情況，干預結(jié)束后收集懸浮細胞和上清。

3 DCs免疫表型和細胞因子的檢測

收集干預的DCs，用PBS清洗后重懸，調(diào)整細胞濃度為5×108/L，分別加入FITC熒光標記的抗人單克隆抗體CD83和HLA-DR，4 ℃孵育30 min，PBS洗2次后，加2%多聚甲醛固定，置4 ℃避光保存，24 h內(nèi)用FACSCalibur流式細胞儀檢測，CellQuest軟件分析檢測結(jié)果。

收集細胞培養(yǎng)上清，儲存于-70 ℃冰箱，按照說明書用ELISA檢測試劑盒測定各組細胞培養(yǎng)上清液中細胞因子IL-12和IFN-γ的濃度。

4 Real-time PCR檢測清道夫受體mRNA的表達

收集干預的DCs，采用Trizol試劑常規(guī)方法抽提總RNA，分光光度法測定計算提取的總RNA含量及濃度。取5 μg總RNA以oligo-dT為引物，SuperScript III RT為逆轉(zhuǎn)錄酶進行逆轉(zhuǎn)錄反應。將上述逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物稀釋后作為模板進行3種清道夫受體[清道夫受體A(scavenger receptor A,SR-A)、CD36和凝集素樣Ox-LDL受體1(lectin-like Ox-LDL receptor 1, LOX-1)]的PCR擴增，其引物序列分別為：SR-A上游引物5’-TCCTCGTGTTTGCAGTTCTC-3’，下游引物5’-GCAATTCTTCGTTTCCCACT-3’；CD36上游引物5’-CGCTGAGGACAACACAGTCT-3’，下游引物5’-GTTGTCAGCCTCTGTTCCAA-3’；LOX-1上游引物5’-GGGCTCATTTAACTGGGAAA-3’，下游引物 5’-GAAATTGCTTGCTGGATGAA-3’。采用ABI 7500實時熒光定量PCR儀進行PCR 反應，mRNA的表達采用標準曲線法分析。

5 Ox-LDL的攝取

為了檢測DCs對Ox-LDL的攝取，收集干預的DCs，用PBS清洗后重懸，各組細胞加入10 mg/L的熒光標記的DiI-Ox-LDL，37 ℃孵育60 min，PBS洗3次后，用流式細胞儀檢測DiI-Ox-LDL的攝取分數(shù)。

6 統(tǒng)計學處理

數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差(mean±SD)表示，組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，LSD法進行兩兩比較，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

1 AngⅡ和洛沙坦對DCs免疫表型和分泌細胞因子的影響

收集干預24 h的懸浮細胞，經(jīng)流式細胞術進行表型分析顯示，與陰性對照PBS組相比，Ang II干預后細胞表達CD83和HLA-DR明顯增加，且呈濃度依賴性升高。與濃度為100 nmol/L Ang II干預的DCs相比，10 μmol/L洛沙坦預處理可明顯抑制Ang II誘導的CD83、HLA-DR表面分子的表達，見圖1A、B。通過ELISA法對細胞培養(yǎng)上清液定量檢測表明，與PBS組相比，Ang II干預后DCs分泌IL-12和IFN-γ水平明顯升高，且呈濃度依賴性，同樣10 μmol/L洛沙坦預處理可明顯減弱Ang II誘導的DCs分泌IL-12和IFN-γ，見圖1C、D。

Figure 1. Immunophenotypic expression and cytokine secretion in DCs exposed to Ang II and losartan. Flow cytometric analysis was performed for surface HLA-DR (A) and CD83 (B) expression examinations. The concentrations of IL-12 (C) and IFN-γ (D) in the supernatants of the culture were measured by ELISA.Mean±SD.n=3.*P<0.05 vs control; #P<0.05 vs 1 nmol/L Ang II；△P<0.05 vs 10 nmol/L Ang II;▲P<0.05 vs 100 nmol/L Ang II.

2 AngⅡ和洛沙坦對DCs攝取Ox-LDL的影響

與對照組相比，Ang II干預可呈濃度依賴性促進DCs對DiI-Ox-LDL的攝取。而在100 nmol/L Ang II基礎上，10 μmol/L洛沙坦預處理可部分抑制DCs對DiI-Ox-LDL的攝取，見圖2。

Figure 2. Effects of Ang II and losartan on the uptake of DiI-Ox-LDL by DCs.

3 AngⅡ和洛沙坦對DCs清道夫受體mRNA表達的影響

Ang II干預可呈濃度依賴性上調(diào)LOX-1的表達，但對SR-A和CD36的表達無明顯影響，見圖3。與100 nmol/L Ang II干預相比，10 μmol/L洛沙坦預處理可明顯抑制LOX-1的表達，但對SR-A和CD36的表達無明顯影響，見圖3。

討 論

1 Ang II參與動脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展的新機制

目前已有大量研究表明RAS參與了動脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展過程，動物實驗也發(fā)現(xiàn)血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑(angiotensin-converting enzyme inhibitor, ACEI)及ARB類藥物有抗動脈粥樣硬化的作用[4]。Ang II是RAS激活后產(chǎn)生的主要血管活性物質(zhì)，主要通過其2種受體，即1型受體(angiotensin II type 1 receptor, AT1)和2型受體(angiotensin II type 2 receptor, AT2)，發(fā)揮其生物學效應。目前已知的大部分Ang II的作用，包括血管收縮、醛固酮釋放、心肌和血管壁細胞的生長和增殖等促動脈粥樣硬化的絕大部分作用，都是通過與AT1受體結(jié)合而實現(xiàn)的[2]。近來的研究發(fā)現(xiàn)Ang II除可引起血管收縮，導致高血壓，繼發(fā)性引起動脈粥樣硬化以外，還具有致炎癥作用，可引起內(nèi)皮細胞產(chǎn)生黏附分子和趨化因子升高，促進單核/巨噬細胞浸潤，能刺激平滑肌細胞產(chǎn)生IL-6等細胞因子[5]，從而提出了Ang II致炎癥作用參與動脈粥樣硬化發(fā)病機制的新觀點。

Figure 3. Effects of Ang II and losartan on the mRNA expression of SR-A, CD36 and LOX-1 analyzed by real-time PCR.Mean±SD.n=3.*P<0.05 vs control;#P<0.05 vs 1 nmol/L Ang II;△P<0.05 vs 10 nmol/L Ang II;▲P<0.05 vs 100 nmol/L Ang II.

近年來的研究已證實在免疫過程中起重要抗原遞呈作用及免疫調(diào)節(jié)作用的DCs參與了動脈粥樣硬化的發(fā)生和發(fā)展[3]。多種致動脈粥樣硬化的危險因素，如Ox-LDL、尼古丁和晚期糖基化終產(chǎn)物(advanced glycosylation end products,AGEs)等都可通過促使DCs免疫功能成熟，參與并放大動脈粥樣硬化炎癥免疫反應[6-7]。其中DCs的成熟是其發(fā)揮免疫作用的關鍵。成熟DCs表達高水平的HLA-DR、CD80、CD83和CD86，還可通過分泌細胞因子，如IL-12、IFN-γ和IL-10等調(diào)節(jié)T輔助細胞的分化，從而調(diào)節(jié)細胞免疫和體液免疫的發(fā)生。本研究發(fā)現(xiàn)Ang II可濃度依賴性活化DCs，促進其免疫成熟，表現(xiàn)在其細胞表面成熟標志(HLA-DR和CD83)的表達增加，分泌多種細胞因子增加，從而使其介導的免疫反應增強，這可能是Ang II致炎癥促動脈粥樣硬化的一種新機制。而這些作用可被ARB類藥物洛沙坦所抑制，提示AT1的激活是Ang II發(fā)揮作用的主要受體。

2 Ang II與Ox-LDL在動脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展中的新聯(lián)系

我們既往的研究發(fā)現(xiàn)在動脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展中起核心作用的危險因素——Ox-LDL除了可以促進DCs的活化和免疫成熟外，DCs還可吞噬Ox-LDL形成泡沫細胞，可能是除單核-巨噬細胞和平滑肌細胞以外泡沫細胞的一個新來源[6]。而本研究發(fā)現(xiàn)Ang II可促進DCs對Ox-LDL的攝取，從而可能促進泡沫細胞的形成，這也是Ang II促動脈粥樣硬化的另一新機制，并且提供了Ang II與Ox-LDL這2種危險因素在動脈粥樣硬化發(fā)生中相互促進、存在密切聯(lián)系的新證據(jù)。

由于DCs攝取Ox-LDL依賴其與細胞表面的清道夫受體結(jié)合，因此為進一步探討Ang II促進DCs攝取Ox-LDL的機制，我們檢測了DCs表面清道夫受體(scavenger receptor，SR)的表達。傳統(tǒng)的SR包括SR-A、CD36、CD68和SR-EC等，它們主要表達于巨噬細胞和平滑肌細胞表面，是這些細胞攝取Ox-LDL的主要受體，參與泡沫細胞的形成。近年來一種新型的Ox-LDL的特異性受體——LOX-1越來越受到人們的重視。其結(jié)構不同于傳統(tǒng)的SR，表達于參與動脈粥樣硬化的多種細胞表面(如內(nèi)皮細胞、平滑肌細胞和巨噬細胞)，是內(nèi)皮細胞攝取Ox-LDL的主要受體[8]。最近的研究發(fā)現(xiàn)在DCs表面存在多種清道夫受體的表達，其中LOX-1參與了抗原和脂質(zhì)提呈的過程[9-10]。本研究發(fā)現(xiàn)Ang II可上調(diào)DCs表面LOX-1的表達，且可被洛沙坦阻斷，但Ang II和洛沙坦對SR-A和CD36的表達無影響。這提示LOX-1，而不是傳統(tǒng)的清道夫受體SR-A和CD36，可能在Ang II促進DCs攝取Ox-LDL中起重要作用。Ang II可通過活化AT1受體，上調(diào)LOX-1的表達，促進DCs對Ox-LDL的攝取，這可能是Ang II除直接促進DCs的免疫成熟以外，通過DCs發(fā)揮促動脈粥樣硬化作用的另一新機制，也是提供RAS活化與血脂異常之間聯(lián)系的新證據(jù)。

綜上所述，Ang II是DCs免疫成熟的重要刺激因素，并且可能通過上調(diào)LOX-1的表達，促進DCs對Ox-LDL的攝取，這可能是Ang II促動脈粥樣硬化的新機制。

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