脂多糖通過PI3K/Akt/mTOR通路調(diào)控巨噬細(xì)胞自噬*

杜 濤， 黃 海， 陳 欣， 丁 紅， 張 睿， 劉梅蘭， 陳 慧

(中山大學(xué)孫逸仙紀(jì)念醫(yī)院婦產(chǎn)科，廣東 廣州 510120)

巨噬細(xì)胞是胚胎免疫耐受的核心細(xì)胞，流產(chǎn)患者中巨噬細(xì)胞的增多并活化是導(dǎo)致流產(chǎn)的主要因素之一[1]。自噬是溶酶體對(duì)自身結(jié)構(gòu)的吞噬降解，它既是細(xì)胞內(nèi)的再循環(huán)系統(tǒng)，也是機(jī)體一種重要的防御和保護(hù)機(jī)制。在生理狀態(tài)下，自噬作為機(jī)體的一種防御機(jī)制，在母體對(duì)胚胎免疫耐受的發(fā)病機(jī)制中具有十分重要作用[2]。自噬在對(duì)中樞免疫耐受的誘導(dǎo)中起到關(guān)健作用。因此研究母體中巨噬細(xì)胞的自噬情況及其調(diào)控機(jī)制對(duì)自然流產(chǎn)的發(fā)生具有深遠(yuǎn)意義。本研究擬通過體外實(shí)驗(yàn)利用脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)刺激巨噬細(xì)胞，同時(shí)檢測(cè)巨噬細(xì)胞自噬情況及其經(jīng)典PI3K/Akt/mTOR調(diào)控通路，對(duì)流產(chǎn)中母體巨噬細(xì)胞自噬的機(jī)制進(jìn)行初步探討。

材 料 和 方 法

1 材料

RPMI-1640培養(yǎng)基和胎牛血清(HyClone)；0.25%胰酶(吉瑪公司)；3-磷酸甘油醛脫氫酶(gly-ceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, GAPDH)抗體(Santa)；辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase,HRP)標(biāo)記羊抗兔抗體(ICL)；BCA法蛋白定量試劑盒(上海申能博采)；柯達(dá)黑白膠片；增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光(enhanced chemiluminescence,ECL)試劑盒(Thermo),超敏ECL試劑盒(Millipore)。

2 方法

2.1實(shí)驗(yàn)分組 將巨噬細(xì)胞體外培養(yǎng)，共分為5組，分別檢測(cè)不同狀態(tài)下巨噬細(xì)胞的自噬情況以及PI3K/Akt/mTOR通路激活狀態(tài)；分別從PI3K及mTOR水平阻斷PI3K/Akt/mTOR通路，檢測(cè)巨噬細(xì)胞自噬，明確巨噬細(xì)胞自噬與PI3K/Akt/mTOR之間的關(guān)系。A組：?jiǎn)渭冃∈缶奘杉?xì)胞系RAW264.7 細(xì)胞；B組：Earle’s平衡鹽溶液培養(yǎng)的巨噬細(xì)胞(饑餓狀態(tài)，激活自噬)；C組：LPS刺激的巨噬細(xì)胞；D組：LPS刺激后的巨噬細(xì)胞+PI3K抑制劑(hVps34)；E組：LPS刺激后的巨噬細(xì)胞+mTOR抑制劑(雷帕霉素)。

2.2各組巨噬細(xì)胞體外培養(yǎng) 小鼠巨噬細(xì)胞系RAW264.7 細(xì)胞購(gòu)自American Type Tissue Collection(ATCC)，常規(guī)傳代培養(yǎng)，培養(yǎng)基采用含10%胎牛血清的DMEM。C組用LPS刺激巨噬細(xì)胞，濃度為1 μg/L。D組和E組分別加入hVps34和雷帕霉素阻斷PI3K/Akt/mTOR通路。

2.3穩(wěn)定表達(dá)GFP-LC3的RAW264.7細(xì)胞系的建立 構(gòu)建pcDNA3.1-GFP-LC3真核表達(dá)載體，應(yīng)用轉(zhuǎn)染技術(shù)將該質(zhì)粒導(dǎo)入RAW264.7細(xì)胞，用G418篩選穩(wěn)定表達(dá)的細(xì)胞系。真核細(xì)胞中GFP-LC3的表達(dá)分別用熒光顯微鏡檢測(cè)，并利用該穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系觀察內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激時(shí)細(xì)胞發(fā)生自噬的情況。

2.4檢測(cè)各組巨噬細(xì)胞自噬情況

2.4.1用qRT-PCR方法檢測(cè)細(xì)胞自噬相關(guān)基因的mRNA表達(dá)水平 qRT-PCR采用的是LightCycler Real Time PCR擴(kuò)增儀。用TRIzol從細(xì)胞內(nèi)提取總RNA。然后用SuperScript試劑盒合成cDNA。Atg5上游引物5’-TTGACGTTGGTAACTGACAAAGT-3’,下游引物5’-TGTGATGTTCCAAGGAAGAGC-3’;Atg7上游引物5’-GATCCGGGGATTTCTTTCACG-3’,下游引物5’-CAGCAGCTTGGGTTTCTTGAT-3’;LC3-Ⅱ上游引物5’-GATGTCCGACTTATTCGAGAGC-3’,下游引物5’-TTGAGCTGTAAGCGCCTTCTA-3’;Bnip3上游引物5’-TGGACGGAGTAGCTCCAAGAG-3’,下游引物5’-CCGACTTGACCAATCCCATATC-3’。

預(yù)變性：95 ℃ 30 s；PCR反應(yīng)： 95 ℃ 5 s，60 ℃ 20 s，循環(huán)40次；熔解曲線分析：95 ℃ 1 s，65 ℃ 15 s，95 ℃ 5 s。反應(yīng)結(jié)束后確認(rèn)擴(kuò)增曲線和熔解曲線。

2.4.2在熒光顯微鏡下采用GFP-LC3融合蛋白示蹤自噬形成 由于電鏡耗時(shí)長(zhǎng)，不利于監(jiān)測(cè)自噬形成過程，我們利用LC3在自噬形成過程中發(fā)生聚集的現(xiàn)象對(duì)此進(jìn)行觀察。無自噬時(shí)，GFP-LC3融合蛋白彌散在胞漿中；自噬形成時(shí)，GFP-LC3融合蛋白轉(zhuǎn)位至自噬體膜，在熒光顯微鏡下形成多個(gè)明亮的綠色熒光斑點(diǎn)，一個(gè)斑點(diǎn)相當(dāng)于一個(gè)自噬體，可以通過計(jì)數(shù)來評(píng)價(jià)自噬活性的高低。

2.4.3利用Western blotting檢測(cè)LC3-II、p-Akt和p-mTOR的表達(dá) 將5組細(xì)胞培養(yǎng)后，吸除培養(yǎng)基，冰上RIPA 按70 μL/well，PMSF 按RIPA 的1/100 加入，冰上裂解30 min。刮取裂解細(xì)胞于4 ℃、14 000 r/min離心30 min，取上清為細(xì)胞總蛋白。BCA 法蛋白定量，于12%SDS-PAGE 行細(xì)胞蛋白電泳，轉(zhuǎn)于PVDF 膜上，剪取目的條帶，5%脫脂奶封閉3 h，分別孵LC3-II、p-Akt和p-mTORⅠ抗過夜，第2天孵HRP 標(biāo)記Ⅱ抗1 h，暗室中加入發(fā)光液，黑白膠片曝光。所得到免疫印跡的定量可以用Bio-Rad提供的Molecular Analyst software進(jìn)行灰度分析。計(jì)算LC3-II、p-Akt、p-mTOR和內(nèi)參照GAPDH比值，評(píng)價(jià)自噬形成及mTOR通路激活情況。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，計(jì)量資料采用單因素方差分析或者Kruskal-Wallis檢驗(yàn)；統(tǒng)計(jì)分析軟件使用SPSS 17.0。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 穩(wěn)定表達(dá)GFP-LC3的RAW264.7細(xì)胞系的建立

構(gòu)建pcDNA3.1-GFP-LC3真核表達(dá)載體，應(yīng)用轉(zhuǎn)染技術(shù)將該質(zhì)粒導(dǎo)入RAW264.7細(xì)胞，用G418篩選穩(wěn)定表達(dá)的細(xì)胞系。真核細(xì)胞中GFP-LC3的表達(dá)用熒光顯微鏡檢測(cè)，如圖1所示，可見RAW264.7細(xì)胞穩(wěn)定表達(dá)GFP-LC3并在藍(lán)光照射下發(fā)出綠色熒光。

2 檢測(cè)各組巨噬細(xì)胞自噬情況

2.1用qRT-PCR方法檢測(cè)細(xì)胞自噬相關(guān)基因的mRNA表達(dá)水平 如圖2所示，在5組細(xì)胞中，自噬相關(guān)基因的表達(dá)存在明顯差異，在饑餓狀態(tài)下巨噬細(xì)胞均處于自噬激活狀態(tài)，自噬相關(guān)基因Atg5、Atg7、LC3-II和Bnip3的mRNA表達(dá)均上升；在LPS刺激下，巨噬細(xì)胞的自噬處于抑制狀態(tài)，與對(duì)照組比，Atg5、LC3-II和Bnip3存在顯著差異，但是Atg7的mRNA水平與對(duì)照組沒有明顯差異；加入PI3K抑制劑(hVps34)和mTOR抑制劑(雷帕霉素)后，巨噬細(xì)胞的自噬明顯處于激活狀態(tài)，與對(duì)照組相比，Atg5、 Atg7、LC3-II和Bnip3的mRNA表達(dá)均上升。

Figure 1. pcDNA3.1-GFP-LC3 transfected into RAW264.7 cells (×200).A:fluorescence; B: phase-contrast; C: merged.

Figure 2. The mRNA expression of Atg5, Atg7, LC3-II and Bnip3 in each group. Mean±SD. n=3.*P<0.05,**P<0.01 vs control.

2.2在熒光顯微鏡下采用GFP-LC3融合蛋白來示蹤自噬形成 如圖3所示，將GFP-LC3融合蛋白轉(zhuǎn)入巨噬細(xì)胞后，在熒光顯微鏡下可以觀察自噬體的形成。單純巨噬細(xì)胞組中GFP-LC3融合蛋白彌散在胞漿中，很少形成代表自噬體的熒光斑點(diǎn)；Earle’s平衡鹽溶液中巨噬細(xì)胞處于自噬激活狀態(tài)，可見自噬體形成；LPS組雖然有自噬體形成，單熒光強(qiáng)度低于Earle’s平衡鹽溶液組；另外2組均可看到較多自噬體的形成，LPS+雷帕霉素組最明顯。除了LPS組與對(duì)照組之間沒有明顯差異外，其它各組熒光強(qiáng)度與對(duì)照組之間存在明顯差異。

2.3利用Western blotting檢測(cè)LC3-II、p-Akt(Ser473)和p-mTOR(Ser2448)的變化 如圖4所示，p-Akt(Ser473)在Earle’s平衡鹽組、LPS組和LPS+雷帕霉素組中表達(dá)明顯升高；p-mTOR(Ser2448)在Earle’s平衡鹽組、LPS+hVps34組和LPS+雷帕霉素組表達(dá)明顯下降；LC3-II的表達(dá)在Earle’s平衡鹽組、LPS+hVps34組和LPS+雷帕霉素組中表達(dá)要高于對(duì)照組和LPS組。阻斷mTOR后，巨噬細(xì)胞自噬增強(qiáng)，這與文獻(xiàn)報(bào)道相同，mTOR對(duì)細(xì)胞自噬起到負(fù)調(diào)節(jié)作用。阻斷PI3K后，在LPS共同作用下，Akt磷酸化水平下降明顯，但是巨噬細(xì)胞自噬水平并沒有下降，這與文獻(xiàn)報(bào)道不符，應(yīng)該存在其它相關(guān)通路對(duì)自噬進(jìn)行調(diào)控。

討 論

在免疫網(wǎng)絡(luò)中巨噬細(xì)胞既是免疫效應(yīng)細(xì)胞，又是免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞[3-4]。(1)正相調(diào)節(jié)作用：體內(nèi)的巨噬細(xì)胞一般處于靜止?fàn)顟B(tài)，當(dāng)受到某些因素如病原體等異物或細(xì)胞因子等刺激后活化，活化的巨噬細(xì)胞功能明顯增強(qiáng)，不但吞噬各種病原體，殺傷腫瘤細(xì)胞，而且還向 T 細(xì)胞提呈抗原，分泌細(xì)胞因子參與免疫應(yīng)答，該作用稱為免疫正相調(diào)節(jié)作用。(2)負(fù)相調(diào)節(jié)作用：巨噬細(xì)胞中還存在一種抑制性巨噬細(xì)胞，分泌多種可溶性抑制物如前列腺素、活性氧分子等抑制淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)或直接損傷淋巴細(xì)胞，該作用稱為免疫負(fù)相調(diào)節(jié)作用。抑制性巨噬細(xì)胞經(jīng) LPS 刺激后發(fā)生免疫調(diào)節(jié)成為新型巨噬細(xì)胞，分泌 IL-1、IL-2、PGE 增加，能夠增強(qiáng) T、B 淋巴細(xì)胞及 NK細(xì)胞活性，并保持或增強(qiáng)抗腫瘤效應(yīng)[5]。(3)體內(nèi)各種因素通過調(diào)控巨噬細(xì)胞功能狀態(tài)而發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用。多種神經(jīng)肽及激素樣物質(zhì)如 P 物質(zhì)、皮質(zhì)激素、性激素等均可通過相應(yīng)受體而調(diào)控巨噬細(xì)胞的功能狀態(tài)；另外，某些神經(jīng)肽與細(xì)胞因子(如 IL-1、TNF-α、IFN-γ)可誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞 MHC-Ⅱ類抗原的表達(dá)，從而調(diào)控其抗原呈遞功能[6]。

巨噬細(xì)胞是調(diào)控母體免疫狀況產(chǎn)生免疫耐受的重要細(xì)胞，從而決定胚胎是否可以免受免疫打擊而流產(chǎn)[7-9]。巨噬細(xì)胞是天然性免疫和獲得性免疫的橋梁，通過識(shí)別并耐受胚胎抗原直接影響妊娠結(jié)局，巨噬細(xì)胞的功能異常是導(dǎo)致母胎耐受異常、流產(chǎn)發(fā)生的重要原因[10-12]，研究已經(jīng)證明在流產(chǎn)的動(dòng)物模型及臨床標(biāo)本中巨噬細(xì)胞均處于活化狀態(tài)。因此明確巨噬細(xì)胞功能狀態(tài)對(duì)了解流產(chǎn)有重要意義。

Figure 4. Expression of LC3-II, p-Akt and p-mTOR tested by Western blotting.Lane 1: control group; Lane 2: starvation group; Lane 3: LPS group; Lane 4: LPS+PI3K inhibitor (hVps34) group; Lane 5: LPS+mTOR inhibitor (rapamycin) group. Mean±SD. n=3. **P<0.01 vs control; ##P<0.01 vs LPS.

細(xì)胞自噬是溶酶體對(duì)自身結(jié)構(gòu)的吞噬降解，它既是細(xì)胞內(nèi)的再循環(huán)系統(tǒng)，也是是機(jī)體一種重要的防御和保護(hù)機(jī)制。巨噬細(xì)胞自噬狀態(tài)可以影響其具體功能。巨噬細(xì)胞可以通過自噬與溶酶體結(jié)合，消除、降解和消化受損、變性、衰老和失去功能的細(xì)胞、細(xì)胞器以及變性蛋白質(zhì)與核酸等生物大分子。這種機(jī)能為細(xì)胞的重建、再生和修復(fù)提供必須原料，實(shí)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)資源的再循環(huán)和再利用。在生理狀態(tài)下，自噬作為機(jī)體的一種防御機(jī)制，在母體對(duì)胚胎免疫耐受的發(fā)病機(jī)制中具有十分重要作用。自噬在對(duì)中樞免疫耐受的誘導(dǎo)中起到關(guān)健作用。首先，自噬相關(guān)基因Atg5缺陷的胸腺移植可導(dǎo)致自身反應(yīng)性CD4+T細(xì)胞的產(chǎn)生[13]；其次，自身免疫性腸病——克羅恩氏病的發(fā)生部分歸因于自噬相關(guān)基因Atg16L1的多態(tài)性[14]。然而，自噬在外周免疫耐受中的作用，目前尚無直接可用的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)對(duì)其論證，但存在一些間接證據(jù)可以對(duì)其佐證。例如：來源于自噬相關(guān)基因Atg16L1缺陷的巨噬細(xì)胞經(jīng)內(nèi)毒素刺激后可產(chǎn)生更多的前炎癥細(xì)胞因子(IL-1β和IL-18)[15]。因此，自噬狀態(tài)關(guān)系到巨噬細(xì)胞的功能，在流產(chǎn)孕婦中間接關(guān)系到免疫狀態(tài)，從而對(duì)胎兒產(chǎn)生影響。

mTOR是調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖的重要因子，在與營(yíng)養(yǎng)分子有關(guān)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、蛋白質(zhì)翻譯調(diào)控、細(xì)胞周期進(jìn)展等過程中都占據(jù)重要地位；同時(shí)，它也是自噬啟動(dòng)階段的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，活化后可抑制自噬發(fā)生[16-17]。啟動(dòng)階段的靶點(diǎn)主要為mTOR相關(guān)靶點(diǎn)，包括TOR 復(fù)合體1 (TOR complex 1， TORC1)和Ⅰ型PI3K。(1) TORC1：mTOR由2個(gè)獨(dú)立的復(fù)合體-TORC1和TORC2構(gòu)成。細(xì)胞內(nèi)生長(zhǎng)因子的信號(hào)及能量水平和營(yíng)養(yǎng)狀態(tài)的信息會(huì)通過Ⅰ型PI3K和Akt/PKB通路傳遞給TORC1，并在達(dá)到適當(dāng)?shù)乃綍r(shí)導(dǎo)致TORC1活化，從而激活mTOR，使自噬受到抑制。故而，可通過調(diào)節(jié)TORC1 的活性來影響mTOR的活性，進(jìn)而調(diào)節(jié)細(xì)胞自噬的活性。最經(jīng)典的自噬相關(guān)藥物-雷帕霉素的作用靶點(diǎn)即為TORC1[18]。我們的實(shí)驗(yàn)證實(shí)，加入雷帕霉素后巨噬細(xì)胞中的自噬明顯增強(qiáng)。(2) Ⅰ型PI3K：活化的生長(zhǎng)因子受體可通過直接結(jié)合的方式來激活下游的Ⅰ型PI3K；也可通過生長(zhǎng)因子受體結(jié)合蛋白2 (growth factor receptor-bound protein 2, GRB2)和SOS (Son of sevenless) 介導(dǎo)激活Ras，再由Ras間接激活Ⅰ型PI3K。但無論采用哪種方式, 激活Ⅰ型PI3K從而觸發(fā)mTOR通路是必不可少的環(huán)節(jié)，因而通過對(duì)Ⅰ型PI3K的調(diào)控就可起到對(duì)自噬進(jìn)行調(diào)控的作用。我們加入經(jīng)典的自噬抑制藥物hVps34后，巨噬細(xì)胞的自噬并沒有明顯下降，這證明LPS對(duì)巨噬細(xì)胞的作用還存在其它的信號(hào)通路。LPS刺激巨噬細(xì)胞后，通過免疫熒光及Western blotting均可檢測(cè)到巨噬細(xì)胞的自噬有所增加，考慮是外界因素刺激巨噬細(xì)胞后，細(xì)胞本身產(chǎn)生的保護(hù)機(jī)制。而加入hVps34后，細(xì)胞內(nèi)自噬反而增加主要因?yàn)橐种屏藗鹘y(tǒng)自噬調(diào)控通路mTOR后，側(cè)枝通路調(diào)控加強(qiáng)所引起，同時(shí)協(xié)同LPS對(duì)細(xì)胞的Toll樣受體(Toll-like receptors, TLRs)的激活，各方效果疊加后巨噬細(xì)胞的自噬反而增強(qiáng)。因此，LPS可以調(diào)控巨噬細(xì)胞的自噬，其可能的調(diào)控通路為PI3K/Akt/mTOR通路，但這不是唯一通路。

[參 考 文 獻(xiàn)]

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