活性污泥中微生物群落多樣性及其研究方法進展

余小玉

（廣東環(huán)境保護工程職業(yè)學院，廣東 佛山 528216）

目前，基于活性污泥法的污水處理工藝在污水處理系統(tǒng)中得到了廣泛應用?；钚晕勰喾▽嵸|(zhì)上是利用微生物新陳代謝降解有機污染物的生物處理技術(shù)，其處理效率以及出水水質(zhì)主要取決于組成活性污泥的微生物種類、數(shù)量、特性等。因此，對進一步提高活性污泥法的處理效果、污泥減量化的機理等課題的深入研究都離不開對活性污泥中微生物群落多樣性的研究。本文圍繞活性污泥中微生物種群多樣性展開討論，并重點描述目前微生物多樣性的研究方法。

1 活性污泥中主要微生物菌群及其特性

作為活性污泥法的核心部分，其主要成分為微生物群體以及吸附的污水中的有機和無機物質(zhì)，是具有一定的活性和良好的凈水功能的褐色絮狀污泥。里面的微生物主要有細菌、真菌、原生動物和后生動物等。其中起主要凈水作用的是細菌。經(jīng)研究，里面細菌的優(yōu)勢菌群有假單胞菌屬、螺菌屬、叢毛單胞菌屬、產(chǎn)堿桿菌屬、短桿菌屬、不動桿菌屬、黃桿菌屬和動膠桿菌屬等。

2 微生物群落多樣性及其研究方法

在活性污泥水處理工藝中，深入了解活性污泥微生物多樣性，有助于提高污水處理系統(tǒng)的整體效果，降低處理成本。利用先進的檢測手段，對活性污泥微生物多樣性進行研究，已經(jīng)成為當今研究的熱點問題。本文將對幾種成熟先進的微生物檢測技術(shù)進行介紹。

2.1 Biolog方法

1989年，美國 BIOLOG公司成功開發(fā)了Biolog法，它是一種新型微生物鑒定方法。它的原理如下：在利用碳源過程中，微生物會產(chǎn)生自由電子。這些自由電子與四唑鹽染料發(fā)生還原反應產(chǎn)生顏色。顏色越深，表明微生物對碳源的利用程度就越高。微生物的種類和固有性質(zhì)不同，那么它們對不同碳源的利用能力就不一樣。該技術(shù)擺脫傳統(tǒng)微生物鑒定方法的局限性，能定性定量分析微生物群落結(jié)構(gòu)差異。

2.2 流式細胞術(shù)（FCM）

流式細胞術(shù)是運用流式細胞儀，使細胞或微粒在液流中流動，逐個通過一束入射光束，并用高靈敏度檢測器記錄下散射光及各種熒光信號，對液流中的細胞或其他微粒進行快速測量。此技術(shù)具有方法靈活、測量速度快、采集數(shù)據(jù)量大、靈敏度高、特異性好、測量參數(shù)多等優(yōu)點。局限性主要是需要制備單細胞懸液、需專業(yè)操作人員、標本需前處理以及設(shè)備昂貴等。

2.3 熒光原位雜交技術(shù)（FISH）

熒光原位雜交技術(shù)最早是由Gall和Pardue提出來的，自提出后，又先后經(jīng)歷了放射性標記探針和熒光標記探針兩個階段。該技術(shù)將細胞原位雜交技術(shù)和熒光技術(shù)有機結(jié)合，檢測靈敏度高、安全便捷，而且能快速獲得結(jié)果。一般的核酸抽提和PCR擴增會產(chǎn)生一定程度的偏差，而FISH卻恰好可以避免此偏差，并且能同時檢測幾種微生物。

2.4 生物標記物法（Biomaker）

微生物的細胞均有其特有的脂肪酸、呼吸醌等環(huán)境樣品信號，而生物標記物法（biomarker）即是利用此特點，能夠在分類學上通過這類環(huán)境樣品信號來表征微生物種類，從而區(qū)分、鑒定細菌的屬、種甚至是株。生物標記法可以避免如形態(tài)觀察等傳統(tǒng)的監(jiān)測方法帶來的人為誤差，它能夠定性定量分析樣品中的微生物群落差異。典型的生物標記物法包括脂肪酸圖譜分析技術(shù)、醌類圖譜分析技術(shù)等。

2.5 變性/溫度地圖凝膠電泳（DGGE/ TGGE）

變性/溫度梯度凝膠電泳的原理如下：在電場中，在變性濃度差異或溫度差異的條件下，微生物的雙鏈DNA片斷的裂解是不一樣的， PCR產(chǎn)物中長度相同但序列不同的 DNA 標記片斷（rRNA或rDNA）將被分離。經(jīng)過顯色反應后，得出DGGE/TGGE 指紋圖譜。從理論上講，該指紋圖譜上的一個條帶就代表一個微生物類群，一般能鑒別到屬，有時候甚至到種。而指紋圖譜上的條帶數(shù)量的多寡以及條帶的亮度代表著該種微生物的多寡，因此，指紋圖譜不僅直觀地反映了微生物種群結(jié)構(gòu)的多樣性，還可判斷出優(yōu)勢菌或功能菌。筆者的《淺淡PCR－DGGE技術(shù)在剩余污泥減量機理研究中的應用》里有詳細描述。

2.6 擴增rDNA限制性酶切片段分析法（ARDRA）

擴增rDNA限制性酶切片段分析法的技術(shù)原理是基于PCR技術(shù)選擇性擴增rDNA片段（如16S rDNA、23S rDNA、16S-23SrDNA片段），再對擴增的rDNA片段進行RFLP。ARDRA技術(shù)一般都需要同其它的分子技術(shù)如DGGE、T-RFLP等相結(jié)合使用。

2.7 T-RFLP

末端限制性片段多態(tài)性T-RFLP法是由RFLP發(fā)展而來的，又稱為16S rRNA 基因的末端限制性片段， 是繼DGGE/TGGE、SSCP、FISH 技術(shù)、克隆文庫之后發(fā)展起來的，具有如下幾個明顯優(yōu)勢：1）結(jié)果可重復顯現(xiàn)，因而利用該技術(shù)對樣品中微生物的群落結(jié)構(gòu)進行定性定量分析的結(jié)果也是可靠的；2）結(jié)果數(shù)據(jù)化，數(shù)據(jù)具體化，從而更加科學和準確；3）跟其他分析方法相比，更容易實現(xiàn)自動化監(jiān)測，操作簡捷，靈敏高效；4）樣品的基因序列可構(gòu)建數(shù)據(jù)庫，可以推斷系統(tǒng)發(fā)育的程度，更具有直接參考意義。綜上所述，由于擁有這些無法比擬的優(yōu)勢，T-RFLP技術(shù)用來進行活性污泥中微生物群落多樣性的研究也是可行的。

3 展望

活性污泥中的微生物菌群隨著現(xiàn)代研究技術(shù)的發(fā)展逐漸被人們所認知。目前來說，單一的研究方法已經(jīng)基本趨于成熟，但是每一種方法都有其局限性，一些實驗誤差是不可避免的。而綜合運用多種層次上的技術(shù)可以從一定程度上解決單一方法所帶來的局限性，使實驗結(jié)果更加準確真實、有說服力。

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