HPLC法測定苯扎貝特?；镏械挠嘘P物質

黃東  吳保祥  王昉

[摘要] 目的 建立苯扎貝特?；镏杏嘘P物質的測定方法。 方法 NUCLEOSIL 100-5 C18（5μm）0.125m×4mm；流動相為磷酸二氫鉀溶液（2.72g/L，用磷酸調節(jié)pH2.3）︰甲醇=4︰6；檢測波長：228nm；流速：1.0mL/min。 結果 苯扎貝特?；锱c主要雜質能得到有效分離，各雜質在0.2~3.5μg/mL范圍內呈良好線性關系。 結論 本測定方法靈敏度高，準確可靠，可以控制苯扎貝特?；镏杏嘘P物質的含量。

[關鍵詞] 苯扎貝特?；铮挥嘘P物質；系統(tǒng)適用性

[中圖分類號] R927.2???[文獻標識碼] B???[文章編號] 2095-0616（2014）09-118-04

Related substances determination of bezafibrate acylate by HPLC

HUANG?Dong1??WU?Baoxiang1??WANG?Fang2

1.Jiangsu Tasly Diyi Pharmaceutical CO., Ltd.， Huaian 223002, China; 2.Analytical＆Testing Center of Nanjing Normal University, Nanjing 210046, China

[Abstract] Objective To establish an HPLC method for detection of the related substances. Methods The analytical column was NUCLEOSIL 100-5 C18 column (4.0mm×12.5cm, 5μm). The mobile phase was potassium dihydrogen phosphate (2.72g/L, adjust to pH 2.3 with phosphoric acid): methanol = 4:6 The flow rate was 1.0mL/min. The wavelenth was 228nm. Results A satisfactory separation condition for the five related impurities, the impurities standard curve was good linear over the range of 0.2-3.5μg/mL. Conclusion The method is sensitive and accurate and it can be used to determine the relateted substances of bezafibrate acylate.

[Key words] Bezafibrate acylate; Related substances; System suitability

苯扎貝特?；锘瘜W名N-對羥基苯乙基-4-氯苯甲酰胺，是合成降脂藥苯扎貝特的重要中間體，目前它的合成主要以酪氨（對羥基苯乙胺)鹽酸鹽為原料，與對氯苯甲酰氯發(fā)生?；磻笙壬芍虚g體，不經分離與甲醇發(fā)生酯交換反應而得，再經縮合反應制得苯扎貝特，所以苯扎貝特?；锏馁|量優(yōu)劣直接關系到苯扎貝特產品的質量，在苯扎貝特酰化物的生產過程中，實際存在和可能產生的雜質有對羥基苯乙胺、4-氯-苯甲酸及一些未知雜質等。本文通過對苯扎貝特?；锷a過程的監(jiān)控，來確定其質量的優(yōu)劣，為下一步苯扎貝特的生產提供有力的保證。

苯扎貝特?；镌械馁|量標準中只有性狀、熔點、干燥失重、含量等項目，不能完全反應出其真正的質量，本文通過建立高效液相色譜法來測定其有關物質，來更好地控制苯扎貝特?；锏馁|量，參考文獻方法，本文采用高效液相色譜法建立了苯扎貝特?；镏杏嘘P物質的分析方法，并對該方法的專屬性、精密度、線性、回收率、檢測限和定量限等進行了驗證，均滿足要求，方法可行。

1?儀器設備與試劑試藥

高效液相色譜儀HPLC系統(tǒng)：沃特斯高效液相色譜儀2489檢測器，2695分離單元（四元泵、717自動進樣器、柱溫箱）；軟件：Empower3.工作站；HP1020打印機。

苯扎貝特酰化物標準品（lot：101169-201001）；甲醇（色譜純201308066，江蘇漢邦科技)；雜質對羥基苯乙胺lot：20131016，含量：99.8%)；雜質4-氯-苯甲酸（lot：130112，含量：100%阿拉丁化學試劑有限公司）。

2?方法與結果

2.1?色譜條件

色譜柱：十八烷基硅烷鍵合硅膠色譜柱 C18（5μm）12.5cm×4mm。流速為1.0mL/min ；檢測波長為228nm。流動相：磷酸二氫鉀溶液（2.72g/L，用磷酸調節(jié)pH2.3）︰甲醇=400︰600； 進樣量：20.0μL。

2.2?溶液制備

試驗溶液：取本品50.0mg加流動相溶解稀釋至100.0mL。

對照溶液（1）：吸取試驗溶液10.0mL加流動相稀釋至100.0mL，再吸上述溶液10.0mL加流動相稀釋至100.0mL。

對照溶液（2）：吸取對照溶液（1）5.0mL加流動相稀釋至50.0mL。

對照溶液（3）：取4-氯苯甲酸（雜質B）對照品2mg加流動相適量使溶解，加入2mL試驗溶液用流動相稀釋至50mL。

2.3?進樣操作與系統(tǒng)適應性試驗

系統(tǒng)平衡后，按照以上的色譜條件，在記錄對照溶液（3）的色譜圖中，兩主峰分離度在1.5以上，在記錄對照溶液（2）的色譜圖中采用信噪比至少為5。

空白測試：取稀釋溶劑進樣，作為空白，表明稀釋溶劑對雜質測定無干擾，在樣品測定中出現(xiàn)溶劑峰的應忽略。

分別取20μL試驗溶液和20μL對照溶液（1）、（2）、（3）注入液相色譜儀，記錄色譜圖至主峰保留時間的2倍。

2.4?計算公式

總雜質含量（%)＝

式中：WS→配制對照液（a)的樣品的重量，mg；

Wi→樣品的重量，mg；

As→對照液（a)中主峰的峰面積。

→供試液色譜圖中總雜質的峰面積。

2.5?結果判定

記錄試驗溶液的色譜圖中，除主峰外，其他峰面積不得大于對照溶液（1）的主峰面積（1.0%）。除主峰外，所有峰面積的總和，不得大于對照溶液（1）的主峰面積的2倍（2.0%），小于對照溶液（1）的主峰面積的0.05倍的峰不記錄。

2.6?方法的專屬性

2.6.1?雜質及苯扎貝特?；锏姆肿咏Y構確認（委托南京師范大學分析中心檢測)?通過紫外分光光度計、液相色譜-質譜、紅外分光光度計等方法進行結構解析確證各雜質的分子結構[1-6]。

2.6.2?單個雜質的定性?依次取雜質對羥基苯乙胺（lot：20131016，含量：99.8%)10mg，至一個25mL容量瓶中，用稀釋溶劑稀釋至刻度，混合均勻。進樣，記錄色譜圖，用保留時間對對羥基苯乙胺進行定性，雜質4-氯-苯甲酸（lot：130112，含量：100%阿拉丁化學試劑有限公司）10mg，至一個50mL容量瓶中，用溶劑稀釋至刻度，混合均勻，進樣，記錄色譜圖，用保留時間對4-氯-苯甲酸進行定性，取苯扎貝特?；飳φ掌罚╨ot：101169-201001）10mg至一個25mL容量瓶中，用稀釋溶劑稀釋至刻度，混合均勻。進樣，記錄色譜圖，用保留時間對苯扎貝特?；镞M行定性。然后分別取上述三種溶液各5mL至50mL容量瓶中，用溶劑稀釋至刻度，進樣記錄色譜圖，各雜質的分離度和理論板數(shù)都符合規(guī)定，見圖1。

2.6.3?高溫破壞性試驗?精密稱取樣品細粉10.0mg置于10.0mL容量瓶中，共4份，分別進行80℃高溫烘箱中加熱1、3、5、10d進行破壞性試驗，用溶劑溶解稀釋至制成1.0mg/mL的溶液。

2.6.4?光照破壞性試驗?精密稱取樣品細粉10.0mg置于10.0mL容量瓶中，共4份，在4500L X光照下照射1、3、5、10d用溶劑溶解稀釋至制成1.0mg/mL的溶液。

2.6.5?酸破壞性試驗?精密稱取樣品細粉10.0mg置于10.0mL容量瓶中，共4份，分別加入1.0mol/L鹽酸的1mL在100℃水浴中加熱1、2、3、5h進行破壞性試驗，再用1.0mol/L的氫氧化鈉中和，再用溶劑稀釋至制成1.0mg/mL的溶液。

2.6.6?堿破壞性試驗?精密稱取樣品細粉10.0mg置于10.0mL容量瓶中，共4份，分別加入1.0mol/L的氫氧化鈉1mL在100℃水浴中加熱1、2、3、5h進行破壞性試驗，再用1.0mol/L的鹽酸中和，再用溶劑稀釋至制成1.0mg/mL的溶液。

2.6.7?氧化破壞性試驗?精密稱取樣品細粉10.0mg置于10.0mL容量瓶中，共4份，分別加入30%雙氧水1mL在100℃水浴中加熱1、2、3、5h進

圖1??分離度色譜圖

行破壞性試驗，再用溶劑稀釋至制成1.0mg/mL的溶液。

分別取上述溶液進樣，記錄色譜圖，結果表明苯扎貝特?；锝洠邷?、光照、酸、堿、氧化等破壞性試驗所降解產生的雜質與主成分份均能有效分離，經對主成分峰的峰純度分析，峰純度均符合要求，表明該方法具有良好的專屬性。

2.7?精密度和重復性

分別精密稱取苯扎貝特?；?0mg、對羥基苯乙胺10mg、4-氯苯甲酸10mg，與同一50mL容量瓶中，用溶劑稀釋溶解并定容至刻度，在上述色譜條件下連續(xù)進樣6次，記錄色譜圖，苯扎貝特酰化物的峰面積的RSD為1.1%，對羥基苯乙胺峰面積的RSD為0.9%，4-氯苯甲酸峰面積的RSD為1.3%，均小于2.0%。重復性和中間精密度符合規(guī)定。

2.8?雜質線性回歸試驗

標準貯備液：分別精密稱取以下標準品：雜質對羥基苯乙胺、雜質4-氯-苯甲酸10.0mg，各至一個500mL容量瓶中，各加入流動相超聲溶解并稀釋至刻度，混合均勻，得到每個雜質的標準貯備液。每個雜質的濃度均約為20.0μg/mL。

分別取標準貯備溶液0.5，1.0，2.5，4，5，6，10mL分別至7個50.0mL容量瓶，用流動相稀釋至刻度，制成濃度分別為0.2、0.4、1、1.6、2、2.4、4μg/mL的一系列溶液，搖勻，各精密量取20μL注入液相色譜儀，記錄色譜圖。以各組分峰面積平均值對其濃度（μg/mL），進行線性回歸分析，得到各組分的標準曲線。對羥基苯乙胺、4-氯-苯甲酸線性回歸相關系數(shù)r分別為0.9995、0.9998均大于0.999，結果表明對羥基苯乙胺、4-氯-苯甲酸在濃度0.2~0.32ug/mL范圍內與峰面積呈良好的線性關系。

2.9?加樣回收試驗

精密稱取已測定有關物質含量的樣品適量，共3份，分別置50mL容量瓶中，加適量溶劑溶解，然后各精密加入已知濃度的對羥基苯乙胺，4-氯苯甲酸對照品的貯備液，制成相當于雜質80%、100%、120%的溶液并稀釋至刻度，搖勻，按2.1項下色譜條件，進樣，記錄色譜圖，計算對羥基苯乙胺、4-氯苯甲酸的含量，減去樣品本底具有的含量，計算回收率，結果對羥基苯乙胺的平均回收率為： 99.2%，RSD=0.69%（n=9）；4-氯苯甲酸為100.1%， RSD=0.92% （n=9)。

2.10?雜質檢測限的測定

在2.1色譜系統(tǒng)下進樣，記錄色譜圖。當對羥基苯乙胺進樣濃度為0.01μg/mL時，其色譜峰高約為基線噪音的3倍，當4-氯苯甲酸進樣濃度為0.02μg/mL時，其色譜峰高約為基線噪音的3倍，當苯扎貝特酰化物進樣濃度為0.005μg/mL時，其色譜峰高約為基線噪音的3倍，根據(jù)進樣量20μL計算，對應的對羥基苯乙胺檢測限為1ng，4-氯苯甲酸檢測限為2ng，苯扎貝特?；餀z測限為0.5ng。

2.11?樣品的穩(wěn)定性

取同一供試品溶液分別于配制后0、2、4、8h內按“ 2.1”項下的色譜條件進行測定，記錄峰面積，結果苯扎貝特?；锏姆迕娣eRSD為0.8%，對羥基苯乙胺的峰面積RSD為1.1%，4-氯苯甲酸的峰面積RSD為1.0%，表明溶液在8h內穩(wěn)定。

2.12?樣品有關物質測定

樣品中有關物質測定結果見表1。

表1??樣品中有關物質測定結果（%）

名稱 批號

BZ1306001a BZ1306002a BZ1306003a

對羥基苯乙胺 0.05 0.08 0.10

4-氯苯甲酸 0.21 0.30 0.28

單個最大未知雜質 0.02 0.01 0.02

總雜質 0.50 0.56 0.53

取樣品溶液，按“2.1”項下的色譜條件進樣測定，記錄色譜圖至主成分保留時間的2.5倍。按面積歸一化法計算單一雜質及總雜質的含量，苯扎貝特?；飿悠冯s質含量測定結果均符合標準規(guī)定[7]。

3?討論

本實驗考慮到后期成品的質量檢測，且這幾種物質在228nm處均有較大吸收，所以采用苯扎貝特成品的有關物質色譜條件來進行[8]。

溶劑的選用，考慮到苯扎貝特?；镌诹鲃酉嘀幸簿哂幸欢ǖ娜芙舛?，對于有關物質檢查樣品的濃度可以滿足要求，所以選擇流動相做為溶劑，也避免了其他溶劑對雜質的干擾[9-10]。

本實驗采用高效液相色譜法法來檢查苯扎貝特?；锏挠嘘P物質，通過實驗可以看到，本方法對雜質與主成分苯扎貝特酰化物能較好的分離，該方法簡單易行并且具有良好的專屬性[11-12]。

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（收稿日期：2014-03-12）