電穿孔療法效應及治療腫瘤的研究進展

丁文金  羅松  蘇勝發(fā)  歐陽偉煒▲+

[摘要] 用電穿孔方法結合化療藥物治療腫瘤，給予相對較少劑量的化療藥物就能殺死腫瘤細胞，這兩者的結合稱為電化學療法（ECT），其優(yōu)勢是療效提高、同時毒性降低。ECT在細胞實驗、動物實驗和臨床試驗中取得了顯著成效，電穿孔治療儀的研發(fā)和應用加快了這種治療方法的進步。研究者們還探索高強度電場的陡脈沖使腫瘤細胞發(fā)生不可逆的穿孔從而導致腫瘤細胞死亡的現(xiàn)象，并展現(xiàn)出廣闊的應用前景。

[關鍵詞] 電穿孔；電化療；腫瘤治療；不可逆電擊穿

[中圖分類號] R730.5???[文獻標識碼] A???[文章編號] 2095-0616（2014）09-48-05

Effect of electroporation therapy in treatment of tumor: A research progress

DING?Wenjin??LUO?Song??SU?Shengfa??OUYANG?Weiwei

Department of Tumor, Affiliated Hospital of Guiyang Medical College, Tumor Hospital of Guizhou Province, Guiyang 550004, China

[Abstract] The combination of electroporation treatment of cancer chemotherapy drugs, given the relatively small doses of chemotherapy drugs can kill tumor cells, called electrochemical combination of the two treatments (Eletrochemotherapy, ECT), its advantage is to improve the efficacy, while reduced toxicity. ECT has achieved remarkable success in the experiment, the cells of animal experiments and clinical trials, the development and application of electroporation therapy device to speed up the progress of this treatment. The researchers also explore the steep high-intensity pulsed electric field causes the tumor cells leading to irreversible phenomenon perforation death of tumor cells and show a broad application prospects.

[Key words] Electroporation; Electric chemotherapy; Cancer treatment; Iirreversible breakdown

惡性腫瘤近年來在人群的發(fā)病逐年升高，嚴重影響患者的健康和生命，成為當之無愧的“死亡殺手”。醫(yī)學界對腫瘤治療的研究正不斷深入，目前臨床治療腫瘤的方法有手術、化學藥物治療、放射治療、分子靶向治療、生物治療以及他們的聯(lián)合應用等。其中化療藥物的毒副作用嚴重制約著化療藥物的應用，主要與劑量的大小有關，所以如何用低劑量化療藥物既減輕副作用又達到最佳的治療效果，將細胞膜電穿孔來提高化療的療效就是一種很好的降低用藥劑量治療腫瘤的方法。電穿孔療法（electroporation therapy，EPT）是一種治療惡性腫瘤的新技術，其特點是能夠提高化療藥物向腫瘤細胞的擴散，并且對腫瘤細胞具有選擇性，避免了正常組織的損害，具有成功微創(chuàng)治療腫瘤的應用前景。以下就介紹電穿孔效應機制、實驗研究以及電穿孔療法研究現(xiàn)狀和展望。

1?電穿孔效應

1.1?可逆性電穿孔

細胞膜電穿孔是一個極其復雜且瞬變的過程，

目前人們通過現(xiàn)有的檢測手段還沒有徹底研究明白細胞電穿孔發(fā)生的具體機制。研究表明，細胞膜電穿孔的瞬時改變是一個動力學過程，一般分為三個階段：（1）初級階段，指在施加電場后大量微孔形成階段，此階段在幾ms內(nèi)瞬間形成；（2）繼發(fā)次級階段指膜上微孔直徑迅速擴大與細胞骨架網(wǎng)孔為邊界的大小基本一致，一般發(fā)生在幾個ms內(nèi)，此時微孔狀態(tài)基本穩(wěn)定；（3）脈沖后效應階段，細胞膜上的電致穿孔不斷縮小，直至復原。不同電脈沖作用的結果還可使微孔不斷擴大，細胞的內(nèi)環(huán)境遭到破壞，出現(xiàn)細胞破裂甚至死亡。人們長期對細胞膜電穿孔機制的研究提出了各種模型，這些模型大都有個共同點，即都是一個球形細胞模型，并且為細胞膜設置一個臨界電位。在正常生理情況下，細胞膜形成了一道屏障，可保持細胞內(nèi)環(huán)境的相對穩(wěn)定，既參與同外界環(huán)境進行物質(zhì)交換，又對某些物質(zhì)的交換有阻礙作用。當施加電壓刺激超過膜上臨界電位時細胞膜的通透性增加，使細胞膜上出現(xiàn)暫時的微孔現(xiàn)象，從而為親水性大分子順利通過細胞膜提供了路徑。作用于細胞的脈沖停止后，基本上細胞膜通過自身復原，從而在結構與功能上不發(fā)生改變[1]，這種在短時電脈沖作用下細胞膜出現(xiàn)暫時微孔并可復原的物理過程稱為電穿孔[2]即可逆性電穿孔。當細胞膜發(fā)生電穿孔時，細胞膜的電阻會瞬時減小，正常情況下不能通過細胞膜的分子（DNA、蛋白質(zhì)、病毒、藥物等）得以進入細胞，Hofmann由此提出了腫瘤的電穿孔療法[3]。比如用電脈沖作用于腫瘤細胞結合博萊酶素（BLM）、順鉑（DDP）等治療腫瘤，出現(xiàn)陽性區(qū)超極化，陰極區(qū)發(fā)生去極化[4]，其需要條件是脈寬為us~ms、強度達kV/cm，在這種電脈沖（EP）作用下細胞膜的靜息電位發(fā)生改變。邵林等[5]指出通過控制電場在腫瘤組織中的強度和場分布，可引起細胞膜通透性增大，該電場可使細胞膜在數(shù)秒內(nèi)形成直徑20~40nm的電致微孔，細胞內(nèi)物質(zhì)瞬時從微孔中噴射而出，整個過程發(fā)生于20ms內(nèi)，并伴隨孔洞直徑擴大20~100nm。當膜上微孔直徑迅速擴大與細胞骨架網(wǎng)孔為邊界的大小基本一致，之后趨于穩(wěn)定，接著由于細胞膜類脂雙分子層的重新排列以及膜內(nèi)外滲透壓的作用，微孔可不斷縮小直到復原，表明電穿孔是可逆的。

1.2?不可逆性電穿孔

隨著對細胞施加電脈沖的增加達到閾值時，細胞的破壞使其內(nèi)環(huán)境無法維持，出現(xiàn)不可逆的電穿孔甚至死亡，這種現(xiàn)象稱作不可逆性電擊穿（irrecversible electroporation，IRE），且目前已用于醫(yī)學領域的研究中。不可逆的電穿孔是一種非熱、微創(chuàng)、局部消融的技術，利用電脈沖使細胞膜出現(xiàn)不可逆的納米級孔隙從而殺死組織細胞。姚陳果等[6]認為細胞在很強的電場應力作用下，產(chǎn)生細胞膜和核膜的電穿孔，打破了細胞內(nèi)外的離子平衡，引起細胞破裂；單個脈沖作用結束后細胞會發(fā)生愈合，而增加陡脈沖的頻率和脈沖劑量，通過電脈沖作用的疊加，微孔則難以愈合。猜想這種結果是通過脈沖對細胞膜和核膜微孔量及孔徑的大小穿孔作用的累積而導致不可逆的電穿孔，借助于光鏡、電鏡對作用后細胞膜的觀察充分證實了這種真實性。

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1.3?局部血管改變

腫瘤的生長、轉(zhuǎn)移和復發(fā)都需要新生血管的生成，脈沖作用下的兩個極區(qū)中，陽極區(qū)的反應為血管的收縮反應，伴有微血栓形成；陰極區(qū)則發(fā)生明顯的間質(zhì)水腫，組織間液對血管的壓迫作用；不管陽極區(qū)還是陰極區(qū)的反應，最終結果是使腫瘤區(qū)域的血供減少或者切斷腫瘤的營養(yǎng)供給[7-8]。研究結果表明[1]電化療法能顯著抑制血管內(nèi)皮生長因子的表達，抑制腫瘤微血管的生成，同時可使腫瘤血管內(nèi)皮細胞破壞，部分血管栓塞；另外，毛細血管及淋巴管通透性增加，局部充血水腫，導致靜脈回流受阻，腫瘤組織供血減少，最終抑制腫瘤生長或者治愈腫瘤。

1.4?高選擇性

癌細胞的體積平均比正常細胞大，所以要求穿過癌細胞的磁通量也比正常細胞大；作用在惡性腫瘤細胞膜上的電場應力的數(shù)量級比正常細胞大1個數(shù)量級[6]。因此，通過利用這種原理使陡脈沖電場作用于惡性腫瘤細胞，其敏感性比正常細胞大，同樣的電場應力勢必對腫瘤細胞造成更大的損傷，所以通過實驗證實了電穿孔方法具有一定選擇性。

1.5?免疫增強效應

研究表明，機體免疫功能低下者更容易患惡性腫瘤，而且腫瘤患者體內(nèi)可產(chǎn)生免疫抑制因子，使機體的免疫功能大大降低。Miyazakis等[9]研究Balb/c小鼠皮下接種結腸癌26細胞，用低電壓-電穿孔結合化療藥物BLM處理，指出在低電壓-電化學過程中伴有T細胞依賴性腫瘤特異性保護性免疫的產(chǎn)生。米彥等[10]研究結果表明，電脈沖治療腫瘤能明顯增強大鼠脾淋巴細胞的增殖反應（P＜0.05）、顯著提高大鼠NK細胞的活性（P＜0.05）和大鼠腹腔巨噬細胞產(chǎn)生TNF-α的能力（P＜0.05），誘發(fā)機體抗癌免疫反應，從而導致荷瘤鼠機體細胞免疫功能增強。

2?腫瘤的電穿孔療法及其研究

通過電穿孔結合化療藥物治療腫瘤，展現(xiàn)出以下優(yōu)點：（1）抗癌藥物的劑量遠遠低于常規(guī)化學治療，故減小了不良反應；（2）對于某些不可切除的腫瘤可以給予一定的治療；（3）對于某些靠近重要器官的腫瘤，如果用外科手術或放療將帶來永久性損害，可用EPT來彌補；（4）可用單一藥物進行治療，克服了多種藥物帶來相互抵消及毒性增加的副作用。

化療藥物BLM不能有效通過細胞脂質(zhì)雙分子層膜，因此傳統(tǒng)的用藥劑量往往比較高，但與電穿孔結合可以增強其細胞毒性。Kitamura[11]在小鼠背側移植NR-S1癌，將博萊霉素注射到腫瘤周邊，同時該腫瘤被固定用電脈沖（40V/cm）作用，3次/d，每周4d，持續(xù)2周。療程為8周，結果發(fā)現(xiàn)10只荷瘤鼠中有4只腫瘤完全消失，低電壓-電化學通過使細胞壞死與凋亡的方式驗證了其細胞殺傷作用。Cemazar等[12]的一項A/J鼠SA-1腫瘤實驗中發(fā)現(xiàn)ECT能提高腫瘤細胞內(nèi)的DDP含量以及增加DDP與核內(nèi)DNA的結合數(shù)量，得出EPT結合DDP治療腫瘤時DDP的細胞毒性比單用DDP時增加20倍。Jaroszeski等[13]建立大鼠肝臟腫瘤模型，腫瘤周邊注射BLM然后施用電脈沖，根據(jù)對腫瘤體積及組織學標本的兩組對比，發(fā)現(xiàn)電化療組的有效率為26.67%~93.33%，而且小鼠完全能耐受。Horiuchi等[14]用人子宮平滑肌肉瘤細胞（SK-LMS-1）皮下植入裸鼠，低量電脈沖（100V/cm） 結合腫瘤周圍注射BLM，結果發(fā)現(xiàn)電化療組腫瘤明顯消退，病灶處BLM的濃度比那些只有BLM腫瘤高10倍，從而證明了ECT可能治療人子宮平滑肌肉瘤的價值。

王保義等[15]采用低于常規(guī)劑量的化療藥物鹽酸阿霉素及BLM，利用ECT技術治療植入昆明鼠體內(nèi)的S180肉瘤，觀察腫瘤生長情況，并解剖腫瘤組織進行組化分析，結果顯示：電化療法作用最強，腫瘤細胞的生長明顯抑制，抑瘤率為95%，抑瘤效果均明顯高于藥物組和電場組；組織切片發(fā)現(xiàn)電化學治療組腫瘤內(nèi)部血管密度減小，腫瘤細胞數(shù)量減少，說明電化療作用可抑制腫瘤血管生成；通過細胞超微結構的觀察發(fā)現(xiàn)電化學協(xié)同作用比電脈沖或者藥物對腫瘤細胞的毒性更大。通過藥效對比，鹽酸阿霉素的效果強于博萊霉素。

Rodriguez等[16]研究ECT治療15例皮膚癌38處皮損參加的Ⅱ期前瞻性臨床試驗，平均隨訪時間為8.6個月。結果顯示整體客觀反應分別為98％，而49％獲得完全緩解，49％部分緩解，并且在2％沒有反應。Soden等[17]報道了ECT中的陣列電極的研究，指出電穿孔療法與化療藥物聯(lián)合使用比只給化療藥物或只給EP的療效都更為顯著。

Nanda等[18]將人類胰腺腫瘤（Pan4-JCK）皮下植入到裸鼠體內(nèi)，用EPT使用博來霉素、絲裂霉素C或卡鉑單藥治療，監(jiān)測它們對腫瘤生長的影響。結果顯示：無論是藥物或脈沖單獨治療的腫瘤表現(xiàn)為腫瘤的生長增加。但是，在使用三種藥物中的任何一個與EPT治療的腫瘤表現(xiàn)出腫瘤顯著的消退。藥效的順序是：BLM＞MMC＞卡鉑。

張弘等[19]通過實驗研究了ECT治療異種移植人卵巢癌SKOV3裸鼠，結合使用的化療藥物為DDP。研究表明：腫瘤生長統(tǒng)計結果為電化療組腫瘤體積和瘤重都最小，相對生長速率最低；血清CA125結果為電化療組和電場組的裸鼠均明顯低于藥物組和對照組，說明高電場電脈沖還可降低腫瘤標志物的表達；對血管內(nèi)皮生長因子的檢測結果為受體KDR的表達明顯減少，說明EP可減少腫瘤血管的生長。

電穿孔療法結合化療藥物治療腫瘤有其獨特優(yōu)勢，但ECT的研究大多處于動物實驗和臨床試驗階段，且ECT治療腫瘤的適用范圍還較窄，并且缺乏臨床大宗病例的支持。因此，為發(fā)展ECT對腫瘤的臨床治療，應該做到：（1）擴大ECT治療不同腫瘤的研究，比較療效；（2） 針對不同部位的腫瘤（特別是深部腫瘤），適當調(diào)整陣列電極的結構并便于操作；（3）制定合理的電化學療法指南，包括不同部位腫瘤治療的最佳電脈沖參數(shù)、最小的化療藥物劑量和療程等；（4）提高患者的順應性，促進臨床應用。

3?電穿孔治療儀研究現(xiàn)狀

電穿孔治療儀的研制，目前以美國的MedFulser系統(tǒng)最著名。Medpulser系統(tǒng)主要由電脈沖發(fā)生器和經(jīng)消毒處理的電極陣列針組成。治療時的操作過程十分簡單，針對不同的臨床治療需要，可以進行多項參數(shù)指標調(diào)節(jié)和選擇，同時配備針對特定腫瘤尺寸和CD成像位置的最佳電極陣列。MedFulser系統(tǒng)中每對電極間產(chǎn)生的電壓幅度和脈沖發(fā)生周期都經(jīng)過了嚴格的理論電場計算和實驗研究，目前這套系統(tǒng)已應用于臨床腫瘤治療中。

根據(jù)高壓脈沖引起細胞IRE而使組織消融的機制，應用現(xiàn)代電子電力技術、高電壓技術及嵌入式技術，周平等[20]研制出獨立可調(diào)輸出脈沖頻率、脈寬和峰值參數(shù)的高壓方波脈沖的腫瘤消融裝置。高壓方波腫瘤消融裝置結合細胞電穿孔原理，參數(shù)設置為輸出脈沖峰值為0~3000V，寬度為10~100ps，頻率為10~100Hz，指標符合產(chǎn)生最佳熱效應的脈沖電場所需的波形要求，脈沖輸出功率可達150kW。當輸出方波脈沖峰值參數(shù)為3000V時，可確保40cm3范圍的組織場強在800V/cm以上，有將近50~70cm3范圍的組織細胞出現(xiàn)IRE效應。方法是使用直徑為1mm的六針環(huán)形陣列電極，插入體表皮膚進行腫瘤消融，其優(yōu)點為最大限度地減少治療對患者的影響和開放式手術的弊端。在實驗室連接電阻負載調(diào)試，裝置運行良好，輸出的方波脈沖波形符合IRE研究需要，同時也為將來針對離體細胞和動物荷瘤的IRE實驗打下基礎。

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4?展望腫瘤治療新途徑

ECT發(fā)揮的最大作用是增加細胞毒性，但依然不能解決化療藥物帶來的毒副作用。隨著研究的深入，發(fā)現(xiàn)單用電脈沖逐漸增加劑量，可導致細胞出現(xiàn)不可恢復的破裂而死亡，發(fā)揮IRE作用。所以，人們逐步將脈沖電場IRE作為一種單獨治療手段進行研究。IRE原理是作為新型的腫瘤治療方法，其優(yōu)點包括能保護重要結構和器官不受損害，滅活時間短，最適用于對淺表腫瘤的治療，整個過程可以有效控制對腫瘤組織的殺傷范圍，達到微創(chuàng)治療的效果[21] ，還可以實時監(jiān)控。不可逆電穿孔特殊的滅活機制，引起學者們極大的興趣，并取得了巨大的進步，具有廣闊的臨床應用前景。

Beebe等[22] 研究發(fā)現(xiàn)單純使用場強26~300kV/cm、脈寬10~300ns的EP可并有效抑制腫瘤生長或?qū)е履[瘤細胞發(fā)生凋亡。姚陳果等[23]研究了脈沖上升時間＜160ns、場強100V/cm、脈寬2537us的指數(shù)衰減脈沖，直接利用細胞的IREB特性來殺傷腫瘤細胞，發(fā)現(xiàn)陡脈沖電場能明顯減小荷瘤BALB/c小鼠惡性腫瘤的體積、并抑制細胞增殖，表明陡脈沖電場能有效治療惡性腫瘤。

Joshi等[24]建立了細胞的動力學模型研究，得出細胞可以在陡脈沖電場中存活，并且細胞膜上的眾多微能夠修復，但如果陡脈沖電場達到一定程度，相鄰近的很多較小微孔融合之后，形成很多半徑較大的微孔，結果就可能導致細胞IRE。姚陳果等[25]以人卵巢腺癌SKOV3細胞為研究對象，逐漸增加陡脈沖劑量，癌細胞的死亡率和抑制效應更加顯著，在細胞水平上，表現(xiàn)為抑制腫瘤細胞的增殖；在染色體水平上，影響到細胞周期。

Neal等在體外實驗應用IRE治療MDA-MB-231人乳腺癌細胞，確定其基線電場閾值（1000v/cm），及引起IRE的脈沖參數(shù)，模擬IRE治療三維數(shù)字模型，指出此方法能夠治療較大范圍的不均質(zhì)靶區(qū)而不引起顯著熱損傷，使得IRE成為治療乳腺癌有效手段[26]。

楊曉燕等[27] 研究陡脈沖作用于新西蘭大白兔VX2肝臟腫瘤，結果表明：IRE可引起兔肝臟腫瘤凝固性壞死，壞死輪廓與電場仿真圖基本吻合，在IRE治療后4周左右，實驗組大白兔均良好地存活，經(jīng)超聲檢查證實腫瘤無增大及轉(zhuǎn)移征象，從而也證明IRE治療的有效性。

綜上所述，雖然國內(nèi)外對陡脈沖電場治療腫瘤的研究已取得一定進展，但IRE的病理生理機制也還尚未清楚。nsPEF（納秒級脈沖電場）技術為惡性腫瘤治療提供了一種獨特的、高能力、無能量依賴性的治療手段。其抗腫瘤機制比較復雜，除了直接破壞腫瘤細胞外還可誘導其凋亡，具體機制可能與線粒體跨膜電位下降關系最大。加強對其機制的深入研究，相信能為腫瘤的治療做出貢獻。

5?結語

電穿孔療法結合化療藥物能增加進入腫瘤細胞的藥物劑量，從而實現(xiàn)化療藥物對腫瘤細胞的殺傷作用，一定程度上降低化療藥物的毒性反應。還通過大量實驗探討陡脈沖電場作用于腫瘤細胞發(fā)生不可逆性電擊穿使其死亡，療效顯著。由于電穿孔療法取決于各種物理、化學以及生物學參數(shù)，橫跨多門學科，所以對細胞電穿孔研究應不斷的深入，人們才會更加清楚電穿孔現(xiàn)象及機制，從而更有效的用于腫瘤的治療。

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（收稿日期：2014-02-13）

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