壬基酚對(duì)大鼠5-羥色胺分解代謝通路的影響

賴玉婷,歐陽(yáng)俊彥,郭佑廷,楊童旺,林 媛,呂寶怡,柳春紅,2*(.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院,廣東 廣州50642；2.廣東省食品質(zhì)量安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣東 廣州 50642)

壬基酚對(duì)大鼠5-羥色胺分解代謝通路的影響

賴玉婷1,歐陽(yáng)俊彥1,郭佑廷1,楊童旺1,林 媛1,呂寶怡1,柳春紅1,2*(1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院,廣東 廣州510642；2.廣東省食品質(zhì)量安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣東 廣州 510642)

為探討壬基酚對(duì)5-羥色胺(5-HT)代謝網(wǎng)絡(luò)分解代謝通路的毒性作用機(jī)制,將24只SD雄性大鼠分為陰性對(duì)照組和壬基酚低、中、高劑量組[30,90,270mg/(kg·bw)],隔日玉米油灌胃染毒28d后檢測(cè)大鼠血漿及肝勻漿中單胺氧化酶(MAO)活性和血漿中5-HT含量,并稱量肝、腎和睪丸重量.結(jié)果顯示,壬基酚暴露高劑量組大鼠體質(zhì)量增量極顯著低于對(duì)照組(P<0.01);染毒至第 3周起,各組大鼠平均食物利用率有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);與對(duì)照組相比,高劑量組肝臟、腎臟臟器系數(shù)均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01),中、高劑量組睪丸臟器系數(shù)均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);中、高劑量組血漿MAO酶活性極顯著低于對(duì)照組(P<0.01),中、高劑量組肝勻漿MAO酶活性顯著低于對(duì)照組(P<0.05);中、高劑量組血漿5-HT含量極顯著高于對(duì)照組(P<0.01).壬基酚暴露劑量與大鼠體內(nèi)MAO酶活性及5-HT水平均呈劑量-效應(yīng)關(guān)系,壬基酚可通過(guò)分解代謝通路影響5-HT的代謝網(wǎng)絡(luò).

壬基酚；單胺氧化酶；5-羥色胺；毒性作用

壬基酚(NP)是烷基酚類化合物中最有代表性的環(huán)境雌激素,現(xiàn)已列入聯(lián)合國(guó)環(huán)境保護(hù)署優(yōu)先控制的27種持久性有毒污染物[1-3],NP廣泛用于化學(xué)工業(yè),制備合成洗滌劑、增濕劑、潤(rùn)滑油添加劑、增塑劑等[4],通過(guò)生活和工業(yè)污水排放到環(huán)境中,對(duì)生物體產(chǎn)生危害.目前研究顯示,NP 可對(duì)生物體產(chǎn)生廣泛的不良作用:包括影響內(nèi)分泌、生殖和發(fā)育、心血管系統(tǒng)及神經(jīng)系統(tǒng)、影響免疫及促癌作用等[5-9].對(duì)NP的尿液代謝組學(xué)及代謝輪廓研究發(fā)現(xiàn),5-羥色胺(5-HT)可能是 NP暴露的尿液生物標(biāo)志物之一[10-11];基于此,本課題組又通過(guò)動(dòng)物NP染毒試驗(yàn)、尿液5-HT檢測(cè)及劑量-效應(yīng)關(guān)系研究鑒定了5-HT作為NP暴露的尿液生物標(biāo)志物的有效性[12].5-HT 由Ersparmer和Vialli于1937年首次分離,其在機(jī)體內(nèi)的代謝網(wǎng)絡(luò)已有清晰的研究[13].但目前關(guān)于NP對(duì)于5-HT代謝網(wǎng)絡(luò)的毒性作用途徑及其機(jī)制尚未見報(bào)道.本研究通過(guò)觀察NP對(duì)大鼠體內(nèi)單胺氧化酶(MAO)活性及5-HT水平的影響,初步探討NP對(duì)5-HT代謝網(wǎng)絡(luò)分解代謝通路的毒性作用機(jī)制,為合理、準(zhǔn)確應(yīng)用5-HT這一尿液生物標(biāo)志物以監(jiān)測(cè) NP暴露情況提供基礎(chǔ)研究依據(jù).

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

NP(純度>99.9%),美國(guó) Sigma公司(CAS: 84852-15-3);大鼠 MAO ELISA試劑盒、大鼠5-HT ELISA試劑盒,上海江萊生物科技有限公司;考馬斯亮藍(lán)試劑盒,南京建成生物工程研究所;手動(dòng)勻漿器,廣州精科化玻儀器公司;5417R冷凍高速離心機(jī),德國(guó)Eppendorf公司;Multiskan Mk3型酶標(biāo)儀,美國(guó)Thermo Fisher公司;U3010紫外分光光度儀,日本日立公司;EL204-IC電子天平,瑞士METTLER TOLEDO公司;DK-600電熱恒溫水浴箱,上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司.

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及染毒 SPF級(jí)SD雄性大鼠24只[許可證編號(hào):SCXK(粵)2008-0002],體質(zhì)量170～210g.動(dòng)物及其飼料均購(gòu)自廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心.放置于動(dòng)物房代謝籠中適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后,按體重采用隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)分組法分為 4組:陰性對(duì)照組和壬基酚低、中、高劑量組,每組6只.低劑量組(NPL):30mg/(kg·d);中劑量組(NPM):90mg/(kg·d);高 劑 量 組 (NPH):270mg/ (kg·d);陰性對(duì)照組(C):等體積玉米油.于上午09:00灌胃,隔日灌胃染毒 28d,期間大鼠自由飲水、攝食,光/暗周期為 12h/12h,室內(nèi)溫度為(22± 0.5)℃,濕度為45%～55%.每周于同一時(shí)間點(diǎn)稱量大鼠體質(zhì)量及飼料消耗量,每日觀察大鼠的精神狀態(tài)、活動(dòng)情況、被毛潤(rùn)澤度等.

1.2.2 MAO酶活性及5-HT水平的測(cè)定 28d染毒完畢后,各組大鼠采用眼眶取血法取血,斷頸椎處死,處死前大鼠禁食 12h,處死后解剖取肝臟、腎臟及睪丸,并稱重.用預(yù)冷的PBS溶液沖洗肝臟去除血跡,濾紙拭干,取適量肝臟用PBS溶液在冰浴中制成 10%的肝勻漿,在 2000r/min、4℃下離心 20min,取上清液待測(cè).用加入 EDTA-K2抗凝劑的采血管采血,在 3600r/min、4℃下離心10min,取上清液待測(cè).MAO酶活性的檢測(cè)采用大鼠MAO ELISA試劑盒,5-HT水平的檢測(cè)采用大鼠5-HT ELISA試劑盒,肝勻漿的蛋白濃度采用考馬斯亮藍(lán)法.

1.3 觀察指標(biāo)

1.3.1 毒性指標(biāo) 中毒癥狀:食欲、活動(dòng)、被毛、分泌物、精神狀態(tài)等;大鼠體質(zhì)量:每周稱量大鼠體質(zhì)量,于上午同一時(shí)間稱量;食物利用率:大鼠每食入100g飼料所增加的體質(zhì)量克數(shù);臟器系數(shù):某臟器濕重在每100g體質(zhì)量中所在的質(zhì)量,觀察肝臟、腎臟及睪丸系數(shù).

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析.多組間比較采用單因素方差分析.進(jìn)一步進(jìn)行組間兩兩比較,若方差齊時(shí),采用LSD檢驗(yàn);若方差不齊,采用Tamhane’s檢驗(yàn),差異顯著水平為P<0.05,極顯著水平為P<0.01.

2 結(jié)果與討論

2.1 大鼠外觀

對(duì)照組大鼠在染毒期間未見異常表現(xiàn).染毒組大鼠則活動(dòng)減少,眼睛分泌物增多,出現(xiàn)不同程度的脫毛,被毛不順滑、黯啞無(wú)光澤,飲食量減少,體型相對(duì)偏小;染毒初期,染毒組大鼠普遍表現(xiàn)出亢奮、焦躁,灌胃后期表現(xiàn)出精神萎靡,對(duì)聲音反應(yīng)遲鈍.

2.2 體質(zhì)量變化

各組大鼠NP暴露前后平均體質(zhì)量及其增量結(jié)果見表 1.各組大鼠體質(zhì)量在染毒結(jié)束后均有增長(zhǎng),對(duì)照組大鼠體質(zhì)量增量較各染毒組高;隨染毒劑量增加,大鼠體質(zhì)量增量減少,NP暴露高劑量組大鼠的體質(zhì)量增量極顯著低于對(duì)照組(P<0.01).

表1 NP對(duì)大鼠體質(zhì)量的影響(±s)Table 1 Body weight changes of rats by exposure to different doses of NP(±s)

表1 NP對(duì)大鼠體質(zhì)量的影響(±s)Table 1 Body weight changes of rats by exposure to different doses of NP(±s)

注:與對(duì)照組相比,**P<0.01

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體質(zhì)量是毒理學(xué)安全性評(píng)價(jià)和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生長(zhǎng)評(píng)價(jià)重要的且易于判斷的指標(biāo)[14].實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的體質(zhì)量受到多種因素影響,如藥物作用、糧食適口性、能量消耗變化等.本研究各組大鼠所處環(huán)境相同,均自由飲食,而對(duì)照組大鼠體質(zhì)量增量較染毒組高,隨染毒劑量增加,大鼠體質(zhì)量增量減少,這與以往關(guān)于NP對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物體質(zhì)量影響的研究結(jié)果一致[15].

2.3 食物利用率變化

由表 2可見,各染毒組大鼠食物利用率隨染毒時(shí)間增長(zhǎng)而降低;同一時(shí)期內(nèi),隨染毒劑量增加,大鼠食物利用率降低.染毒至第 3周起,NP暴露低劑量組大鼠平均食物利用率顯著低于對(duì)照組(P<0.05),且隨暴露量增加,食物利用率降低(P<0.05).

表2 NP對(duì)大鼠食物利用率的影響(%)Table 2 Food utilization rate changes of rats by exposure to different doses of NP(%)

食物利用率也是動(dòng)物毒理學(xué)評(píng)價(jià)的重要指標(biāo)之一,食物利用率的變化受多種因素影響.本研究各組大鼠所處環(huán)境相同,均自由飲食,而各染毒組大鼠食物利用率有遞減的劑量-效應(yīng)關(guān)系及時(shí)間-效應(yīng)關(guān)系,說(shuō)明這是由NP引起的毒效應(yīng)作用體現(xiàn),與以往的研究結(jié)果相符[15].

2.4 臟器系數(shù)

由表3可見,隨染毒劑量增加,大鼠肝臟及腎臟臟器系數(shù)均呈現(xiàn)遞增的劑量-效應(yīng)趨勢(shì),睪丸臟器系數(shù)呈現(xiàn)遞減的劑量-效應(yīng)趨勢(shì).與對(duì)照組相比,NP暴露高劑量組大鼠肝臟及腎臟臟器系數(shù)均有極顯著性差異(P<0.01),中、高劑量組大鼠睪丸臟器系數(shù)均有顯著性差異(P<0.05).

表3 NP對(duì)大鼠臟器系數(shù)的影響 (%)Table 3 Organ coefficient changes of rats after exposure to different doses of NP (%)

若受試物使某個(gè)臟器受到損害,如增生、充血、水腫、萎縮等,則臟/體比值會(huì)發(fā)生改變,可增大或減小,因此,臟器系數(shù)是一個(gè)判別動(dòng)物臟器受損的有效指標(biāo)[16].本研究結(jié)果顯示,隨染毒劑量增加,大鼠肝臟及腎臟臟器系數(shù)均呈現(xiàn)遞增的劑量-效應(yīng)趨勢(shì),睪丸臟器系數(shù)呈現(xiàn)遞減的劑量-效應(yīng)趨勢(shì),且其變化有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,表明NP短期重復(fù)染毒對(duì)大鼠的肝臟、腎臟和睪丸均產(chǎn)生亞慢性毒性損傷作用,與以往研究結(jié)果一致[17-18].

2.5 MAO酶活性及5-HT含量變化

表4 NP對(duì)大鼠MAO酶活性的影響(±s)Table 4 MAO activity changes of rats by exposure to different doses of NP(±s)

表4 NP對(duì)大鼠MAO酶活性的影響(±s)Table 4 MAO activity changes of rats by exposure to different doses of NP(±s)

注:與對(duì)照組相比,*P<0.05,**P<0.01

?

由表4可見,隨染毒劑量增加,大鼠血漿及肝勻漿MAO酶活性均下降,與對(duì)照組相比,NP暴露中、高劑量組大鼠血漿及肝勻漿MAO酶活性均有顯著性差異(P<0.05).由表 5可見,隨染毒劑量增加,大鼠血漿5-HT水平呈現(xiàn)遞增的劑量-效應(yīng)趨勢(shì),NP暴露中、高劑量組大鼠血漿5-HT水平均極顯著高于對(duì)照組(P<0.01).

表5 NP對(duì)大鼠血漿5-HT水平的影響(±s)Table 5 5-HT level changes of rats by exposure to different doses of NP(±s)

表5 NP對(duì)大鼠血漿5-HT水平的影響(±s)Table 5 5-HT level changes of rats by exposure to different doses of NP(±s)

注:與對(duì)照組相比,**P<0.01

組別 5 -H T水平( p g / m L )對(duì)照 1 3 . 0 5 5 ± 1 . 2 5低劑量 1 4 . 2 4 2 ± 0 . 5 5中劑量 1 5 . 7 5 8 ± 1 . 0 1 * *高劑量 1 6 . 7 2 7 ± 0 . 9 0 * *

5-HT又稱血清素(Serotonin),是人體重要的活性物質(zhì),也是神經(jīng)遞質(zhì)的重要組成部分,廣泛存在于哺乳動(dòng)物組織中[19].5-HT 以色氨酸(Tryptophan,Trp)為原料,在色氨酸羥化酶(Tryptophan hydroxylase, TPH)及5-羥色胺酸脫羧 酶 (5-Hydrotryptophen decarboxylase, 5-HTPDC)的作用下被合成,之后經(jīng)單胺氧化酶MAO催化成 5-羥吲哚乙酸(5-Hydroxyindole acetic acid,5-HIAA)而隨尿液排出體外[20]. MAO是一種能夠催化單胺類物質(zhì)氧化脫氨反應(yīng)的酶,于1928年由Hare在肝細(xì)胞中發(fā)現(xiàn),在人體內(nèi)分布極廣,MAO的酶活性極大地影響著單胺系統(tǒng)(多巴胺,去甲腎上腺素和 5-HT)的代謝,MAO功能障礙被認(rèn)為與神經(jīng)系統(tǒng)疾病有關(guān)[21].調(diào)查研究表明,NP化學(xué)結(jié)構(gòu)與 17β-雌二醇(17β-estradiol, E2)相似,可競(jìng)爭(zhēng)性抑制 E2與靶器官的雌激素受體(Estrogen receptor,ER)結(jié)合,形成配體-受體復(fù)合物與DNA結(jié)合區(qū)的DNA反應(yīng)元件結(jié)合,誘導(dǎo)或抑制靶基因的轉(zhuǎn)錄,啟動(dòng)一系列雌激素依賴性生理生化過(guò)程,因此,NP在機(jī)體內(nèi)常模擬E2對(duì)多種系統(tǒng)發(fā)揮作用[22].國(guó)內(nèi)外有研究顯示,E2可通過(guò)激活TPH酶活性及抑制MAO酶活性從而提高神經(jīng)系統(tǒng)的5-HT水平,且抑制MAO酶活性的作用大于對(duì)TPH酶活性的激活[23];以 E2干預(yù)大鼠3周,下丘腦MAO活性較對(duì)照組下降28%,E2干預(yù)恒河猴 28d,外側(cè)丘腦、丘腦室旁核、丘腦腹內(nèi)側(cè)核的MAO活性顯著下降,證明在不同種屬動(dòng)物中,雌激素可以抑制MAO的酶活性[24-25].但 Gagné等[26]給淡水貽貝分別一次性注射 E2和 NP,觀察 48h后發(fā)現(xiàn)兩者對(duì)淡水貽貝的神經(jīng)節(jié)和性腺的MAO酶水平并無(wú)顯著影響,原因可能是E2及NP的注射劑量相對(duì)其他研究的染毒劑量較低,且為一次性注射,并無(wú)重復(fù)染毒,相對(duì)染毒作用時(shí)間較短,未能觀測(cè)出E2和NP對(duì)機(jī)體MAO酶活性的抑制作用.本研究顯示,隨NP染毒劑量增加,大鼠血漿 MAO酶活性及肝勻漿MAO酶活性均下降,而 5-HT含量則出現(xiàn)遞增的劑量-效應(yīng)關(guān)系,表明 NP可通過(guò)抑制機(jī)體內(nèi)MAO酶活性,從而使機(jī)體內(nèi)5-HT水平升高,提示NP可通過(guò)作用于分解代謝通路而影響5-HT的代謝網(wǎng)絡(luò),其機(jī)制可能是NP作為一種環(huán)境雌激素,在大鼠體內(nèi)模擬 E2發(fā)揮作用,抑制 MAO酶活性,使得 5-HT分解代謝受阻,在體內(nèi)積累,導(dǎo)致5-HT水平升高,從而對(duì)5-HT在機(jī)體內(nèi)的代謝網(wǎng)絡(luò)產(chǎn)生毒性作用,但其更為深入的機(jī)制還需作進(jìn)一步的研究.

3 結(jié)論

3.1 NP對(duì)大鼠有一定毒性作用,使大鼠日?；顒?dòng)表現(xiàn)異常,精神萎靡;隨NP暴露劑量增加,大鼠體質(zhì)量增量及食物利用率均下降,呈現(xiàn)出劑量-效應(yīng)關(guān)系及時(shí)間-效應(yīng)關(guān)系;經(jīng)過(guò)NP暴露,大鼠肝臟及腎臟臟器系數(shù)均呈現(xiàn)遞增的劑量-效應(yīng)趨勢(shì),睪丸臟器系數(shù)呈現(xiàn)遞減的劑量-效應(yīng)趨勢(shì),NP短期重復(fù)染毒可對(duì)大鼠的肝臟、腎臟和睪丸產(chǎn)生亞慢性毒性損傷作用.

3.2 NP可通過(guò)作用于分解代謝通路而影響5-HT的代謝網(wǎng)絡(luò).隨NP暴露劑量增加,大鼠血漿及肝臟MAO酶活性均下降,而5-HT水平則出現(xiàn)遞增的劑量-效應(yīng)關(guān)系. NP可通過(guò)抑制機(jī)體內(nèi)MAO酶活性,使5-HT分解代謝受阻,在體內(nèi)積累,導(dǎo)致5-HT水平升高,從而對(duì)5-HT在機(jī)體內(nèi)的代謝網(wǎng)絡(luò)產(chǎn)生毒性作用.由此可見,從毒效應(yīng)機(jī)制來(lái)看,尿液中5-HT作為反映NP暴露情況的生物標(biāo)志物是可行的.

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5-Hydroxytryptamine catabolic changes of rats by short-term exposure to nonylphenol

LAI Yu-ting1, OUYANG Jun-yan1, GUO You-ting1, YANG Tong-wang1, LIN Yuan1, Lü Bao-yi1, LIU Chun-hong1,2*(1.Food College, South China Agricultural University, Guangzhou 510624, China；2.Guangdong Provincial Key Laboratory of Food Quality and Safety, Guangzhou 510642, China). China Environmental Science, 2014,34(9)：2408～2412

Effects of nonylphenol (NP) on monoamine oxidase (MAO) activity and 5-hydroxytryptamine (5-HT) level of rats were investigated. The toxic mechanisms of NP on catabolism of 5-HT were also analyzed. 24 male SD rats were randomly divided into 4groups, namely NP low-dose group 30mg/(kg·bw), NP medium-dose group 90mg/(kg·bw), NP high-dose group 270mg/(kg·bw) and control group (equal volume of the solvent). NP in corn oil was administrated orally to rats once every other day for 28days, and rats in control group was only given corn oil. The increment of rat body weight in NP high-dose group was lower than that of control group (P<0.01). From the third week of exposure, significant differences were found for the food utilization rates, the liver, kidney and testis coefficients between treatment groups and control group (P<0.05, P<0.01, P<0.01, P<0.05). Compared with control group, significantly lower MAO activities of plasma and liver homogenate and higher 5-HT levels were observed in treatment groups (P<0.01, P<0.05, P<0.01). NP exposure has a dose-dependent effect on MAO activity and 5-HT level of rats, suggesting that NP may affect the metabolic network of 5-HT by inhibiting its catabolism.

nonylphenol；monoamine oxidase；5-hydroxytryptamine；toxic effect

X171.5

A

1000-6923(2014)09-2408-05

賴玉婷(1988-),女,廣東韶關(guān)人,華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院碩士研究生,主要從事營(yíng)養(yǎng)與食品安全研究.

2014-01-20

廣東省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(S2011010001045);廣東省科技計(jì)劃項(xiàng)目(2012B090600005,2012B091400001)

* 責(zé)任作者, 教授, liuch@scau.edu.cn