宮頸鱗狀細胞癌組織中NDRG-1、COX-2、VEGF的表達及其臨床意義

袁冬蘭，錢華*，王華，姜家寶，朱小蔚，焦霞，蔣小芹，肖蔚，于鴻

（泰州市人民醫(yī)院1.婦產(chǎn)科，2.普外科，3.病理科，江蘇泰州225300）

宮頸鱗狀細胞癌組織中NDRG-1、COX-2、VEGF的表達及其臨床意義

袁冬蘭1，錢華1*，王華1，姜家寶2，朱小蔚3，焦霞3，蔣小芹3，肖蔚3，于鴻3

（泰州市人民醫(yī)院1.婦產(chǎn)科，2.普外科，3.病理科，江蘇泰州225300）

目的：觀察N-myc下游調(diào)節(jié)基因-1（N-myc downstream regulated gene-1，NDRG-1）、環(huán)氧合酶-2（cyclooxygenase-2，COX-2）及血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）在宮頸鱗狀細胞癌組織中的表達，分析其在宮頸鱗狀細胞癌發(fā)生發(fā)展中的作用及意義。方法：采用免疫組織化學(xué)法檢測80例宮頸鱗狀細胞癌患者癌組織和15例正常宮頸組織中NDRG-1、COX-2及VEGF蛋白表達情況；分析宮頸鱗狀細胞癌組織中3種蛋白表達的相關(guān)性，并分析其表達與臨床病理因素及患者預(yù)后的關(guān)系。結(jié)果：與正常宮頸組織比較，宮頸鱗狀細胞癌組織中NDRG-1陽性表達率明顯降低（P＜0.01）；COX-2與VEGF陽性表達率明顯升高（P＜0.01）。NDRG-1、COX-2及VEGF蛋白的陽性表達與宮頸鱗狀細胞癌患者的年齡及腫瘤大小無關(guān)（P＞0.05），而與腫瘤組織病理學(xué)分級、FIGO分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)（P＜0.01）。Kaplan-Meier生存分析顯示，宮頸鱗狀細胞癌組織中NDRG-1表達陽性者生存期較長，COX-2及VEGF表達陽性者生存期較短。結(jié)論：宮頸鱗狀細胞癌組織中NDRG-1表達降低，而COX-2及VEGF表達增加，三者表達的聯(lián)合檢測可能對判斷宮頸鱗狀細胞癌的預(yù)后具有重要價值。

N-myc下游調(diào)節(jié)基因-1；環(huán)氧合酶-2；血管內(nèi)皮生長因子；免疫組織化學(xué)；宮頸鱗狀細胞癌

N-myc下游調(diào)節(jié)基因-1（N-myc downstream regulated gene-1，NDRG-1）是NDRG基因家族重要成員，目前已知的人源NDRG基因包括NDRG-1、NDRG-2、NDRG-3和NDRG-4，廣泛分布于人體組織［1］。NDRG-1不僅與細胞增殖和分化密切相關(guān)，而且參與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移和血管形成過程，同時其表達受多種病理生理因素誘導(dǎo)調(diào)控。研究表明，多種腫瘤組織內(nèi)NDRG-1表達降低或缺失，NDRG-1有望成為腫瘤基因治療的新候選基因［2］。盡管NDRG-1的抑癌作用及機制已引起越來越多研究者的關(guān)注，但迄今為止，關(guān)于其與宮頸鱗狀細胞癌關(guān)系的研究甚少。本研究采用免疫組織化學(xué)法，觀察近4年部分宮頸鱗狀細胞癌手術(shù)切除標本中NDRG-1、基質(zhì)環(huán)氧合酶-2（cyclooxygenase-2，COX-2）及血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）的表達情況，并分析其相關(guān)性和臨床意義。

1 材料和方法

1.1 臨床資料

選取2009年1月至2013年1月在泰州市人民醫(yī)院手術(shù)切除的宮頸癌石蠟包埋標本80例，由2名高級職稱病理醫(yī)師閱片，證實為宮頸鱗狀細胞癌。其中，高分化31例，中分化28例，低分化21例，所有標本臨床資料齊備?；颊吣挲g29～76歲，平均（49.52±8.37）歲。根據(jù)2009年FIGO標準進行臨床分期，Ⅰ期32例，Ⅱ期29例，Ⅲ期15例，Ⅳ期4例。80例病例中有75例獲得隨訪資料，隨訪時間為6個月至4年，平均（25.28±5.37）月。所有患者術(shù)前均未接受任何化療、放療和免疫治療。另取同期經(jīng)病理證實的15例正常宮頸組織作為對照，來自因子宮肌瘤或子宮腺肌癥行全子宮切除術(shù)標本。

1.2 免疫組織化學(xué)染色

所有標本均經(jīng)10%甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋，2～4μm連續(xù)切片。免疫組織化學(xué)采用鏈霉素親和素過氧化酶復(fù)合物法（S-P法），抗原修復(fù)采用高壓鍋煮5 min，DAB顯色。鼠抗人NDRG-1、COX-2、VEGF單克隆抗體為丹麥Dako公司產(chǎn)品，工作濃度為1∶100，具體操作流程參照文獻［3］，以PBS替代一抗作陰性對照。結(jié)果判斷：NDRG-1與COX-2蛋白陽性信號呈黃色、棕黃色及棕褐色顆粒，定位于細胞質(zhì)或細胞膜，VEGF陽性信號為細胞質(zhì)內(nèi)均勻黃色、棕黃色或棕褐色顆粒。根據(jù)陽性細胞數(shù)和著色強度采用半定量積分法判斷結(jié)果，每張切片陽性細胞數(shù)＜5%為0分，6%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，＞75%為4分；著色強度：黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。兩者積分相乘，0～4分為陰性，5～12分為陽性［4］。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 17.0軟件進行統(tǒng)計分析，采用χ2檢驗分析宮頸癌組織與正常宮頸組織中NDRG-1、COX-2、VEGF表達的差異及宮頸癌組織中這3種蛋白表達與臨床病理特征之間的關(guān)系。采用Spearman相關(guān)系數(shù)計算宮頸癌組織中三者之間的相關(guān)性。生存分析采用Kaplan-Meier方法統(tǒng)計描述生存資料，用Logrank檢驗方法分析生存率差異。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 宮頸鱗狀細胞癌組織中NDRG-1、COX-2及VEGF的表達

正常宮頸組織中鱗狀上皮NDRG-1蛋白呈陽性表達，陽性表達率為100%（15／15）；宮頸鱗狀細胞癌組織中NDRG-1蛋白陽性表達率（42／80，52.5%）及染色強度顯著低于正常宮頸組織（χ2＝14.251，P＜0.01）。正常宮頸組織中鱗狀上皮COX-2陽性表達率為26.6%（4／15），宮頸鱗狀細胞癌組織中COX-2蛋白陽性表達率（73／80，91.2%）及染色強度均明顯增加（χ2＝12.867，P＜0.01）。正常宮頸組織中鱗狀上皮VEGF陽性表達率為20.0%（3／15），宮頸鱗狀細胞癌組織中VEGF蛋白陽性表達率（63／80，78.7%）及染色強度均顯著增加（χ2＝18.336，P＜0.01）。見圖1。

圖1 免疫組織化學(xué)檢測NDRG-1、COX-2及VEGF的表達（S-P法×200）

2.2 NDRG-1、COX-2及VEGF的表達與患者臨床病理特征之間的關(guān)系

宮頸鱗狀細胞癌組織中NDRG-1、COX-2及 VEGF的表達與患者的年齡、腫瘤大小無關(guān)（P＞0.05），而與腫瘤的組織病理分級、FIGO分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)（P＜0.01）。見表1。

表1 宮頸鱗狀細胞癌組織中NDRG-1、COX-2及VEGF的表達與臨床病理參數(shù)間的關(guān)系

2.3 NDRG-1、COX-2及VEGF在宮頸鱗狀細胞癌組織中表達的相關(guān)性分析

80例宮頸鱗狀細胞組織中，6例NDRG-1和COX-2同時呈陽性表達，9例同時呈陰性表達，15例NDRG-1呈陽性而COX-2呈陰性，12例NDRG-1呈陰性而COX-2呈陽性；8例NDRG-1和VEGF同時呈陽性表達，5例同時呈陰性表達，11例NDRG-1呈陽性而VEGF呈陰性，18例NDRG-1呈陰性而VEGF呈陽性；36例COX-2和VEGF同時呈陽性表達，6例同時呈陰性表達。Spearman等級相關(guān)分析顯示，NDRG-1與COX-2蛋白陽性表達呈明顯負相關(guān)（r＝－0.347，P＜0.01），NDRG-1與VEGF蛋白陽性表達呈明顯負相關(guān)（r＝－0.157，P＜0.01），COX-2與VEGF蛋白陽性表達呈明顯正相關(guān)（r＝0.254，P＜0.01）。

2.4 NDRG-1、COX-2及VEGF在宮頸鱗狀細胞癌組織中的表達與患者預(yù)后關(guān)系

80例宮頸癌病例中有75例獲得隨訪資料，隨訪時間為6個月至4年，平均（25.28±5.37）個月。Kaplan-Meier生存分析結(jié)果顯示，宮頸癌組織中NDRG-1表達陽性者較陰性者生存期長，而COX-2及VEGF表達陽性者較陰性者生存期縮短。見圖2。

圖2 NDRG-1、COX-2、VEGF表達與宮頸癌患者生存期之間的關(guān)系（Kap lan-Meier生存分析）

3 討論

研究發(fā)現(xiàn)，多種惡性腫瘤組織（如肝癌、胰腺癌、乳腺癌、膀胱癌、肺癌等）和多種腫瘤細胞株（如人結(jié)腸癌SW62細胞、人宮頸癌SiHa細胞、人乳腺癌MCF-7細胞、人前列腺癌ALVA細胞等）內(nèi)NDRG-1表達明顯降低或缺失［5］。Fotovati等［6］報道，與正常乳腺組織比較，乳腺癌組織內(nèi)NDRG-1表達顯著減少，高表達者生存時間較低表達者長，且其表達水平與乳腺癌的轉(zhuǎn)移呈負相關(guān)，提示NDRG-1有望成為乳腺癌早期轉(zhuǎn)移的分子標志。Sun等［7］觀察168例膠質(zhì)瘤患者術(shù)后生存率，結(jié)果顯示，NDRG-1高表達者的平均生存期為23個月，低表達者為13個月，而NDRG-1陰性表達者僅為8個月，表明膠質(zhì)瘤中NDRG-1表達缺失是一個預(yù)后差的獨立生物學(xué)指標。

本實驗結(jié)果顯示，NDRG-1在宮頸鱗狀細胞癌組織中的表達率顯著低于正常宮頸組織，證實宮頸鱗狀細胞癌組織內(nèi)NDRG-1異常低表達。同時，低分化宮頸鱗狀細胞癌組織中NDRG-1的表達率顯著低于中分化和高分化宮頸鱗狀細胞癌，F(xiàn)IGO分期Ⅲ、Ⅳ期宮頸鱗狀細胞癌組織中的NDRG-1表達率顯著低于Ⅰ、Ⅱ期，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組的NDRG-1表達率顯著低于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組，提示NDRG-1的表達與宮頸癌的分化、進展及轉(zhuǎn)移有關(guān)。

COX-2作為一種誘導(dǎo)性即刻反應(yīng)基因，是前列腺素合成的重要限速酶，在大多數(shù)正常組織中不表達，但在炎性介質(zhì)、促癌因素、生長因子、癌基因的作用下表達迅速增加，促進腫瘤的形成、細胞增殖、血管生成、侵襲轉(zhuǎn)移等［8］。VEGF是目前已知的最強促血管生成因子，以旁分泌或自分泌的形式與血管內(nèi)皮細胞上的受體結(jié)合，促進內(nèi)皮細胞分裂增殖、新生血管形成、血管通透性增高，促進腫瘤的生長與轉(zhuǎn)移［9］。對宮頸癌、肺癌、結(jié)腸癌、胃癌、乳腺癌、腎癌、肝癌等多種腫瘤的研究表明，VEGF高表達患者的生存期顯著縮短［10］。研究顯示，上調(diào)乳腺癌、膀胱癌、前列腺癌細胞內(nèi)NDRG-1基因的表達，瘤細胞的增殖與侵襲能力顯著降低，其機制可能與NDRG-1基因抑制腫瘤細胞COX-2和VEGF的合成有關(guān)［11］。我們前期采用脂質(zhì)體介導(dǎo)將NDRG-1基因轉(zhuǎn)染宮頸癌SiHa細胞，也發(fā)現(xiàn)該轉(zhuǎn)基因細胞增殖水平與COX-2、VEGF的表達均顯著降低［12］。本實驗結(jié)果顯示，NDRG-1、COX-2及VEGF的表達與宮頸鱗狀細胞癌組織學(xué)分級、FIGO臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。Kaplan-Meier生存分析結(jié)果顯示，宮頸鱗狀細胞癌組織中NDRG-1表達陽性者較陰性者生存期長，而COX-2及VEGF表達陽性者較陰性者生存期縮短。同時，本實驗結(jié)果表明宮頸鱗狀細胞癌組織中存在NDRG-1、COX-2及VEGF的異常表達，并且三者之間的表達具有相關(guān)性，也間接提示NDRG-1可能通過參與COX-2和VEGF的合成代謝過程，進而影響宮頸鱗狀細胞癌的分化、增殖及轉(zhuǎn)移。因此，聯(lián)合檢測宮頸鱗狀細胞癌組織中NDRG-1、COX-2及VEGF的表達，對于判斷宮頸鱗狀細胞癌患者的預(yù)后可能具有一定臨床應(yīng)用價值。

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［3］ 肖蔚，焦霞，趙燕，等.胰腺癌組織中Smad4、上皮型鈣粘蛋白及β-連環(huán)蛋白的表達及臨床意義［J］.江蘇大學(xué)學(xué)報：醫(yī)學(xué)版，2011，21（5）：423－427.

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Expression of NDRG-1，COX-2 and VEGF in cervical squamous cell carcinoma tissue and its clinical significance

YUAN Dong-lan1，QIAN Hua1，WANG Hua1，JIANG Jia-bao2，ZHU Xiao-wei3，JIAO Xia3，JIANG Xiao-qin3，XIAOWei3，YU Hong3
（1.Department of Gynaecology，2.Department of General Surgery，3.Department of Pathology，Taizhou People′s Hospital，Taizhou Jiangsu 225300，China）

Objective：To observe the expression of N-myc downstream regulated gene-1（NDRG-1），cyclooxygenase-2（COX-2）and vascular endothelial growth factor（VEGF）in cervical squamous cell carcinoma tissue and to elucidate the mechanism of cervical squamous cell carcinoma invasion and metastasis.M ethods：Expressions of NDRG-1，COX-2 and VEGF in tissue samples from 80 cervical squamous cell carcinoma cases and 15 healthy control caseswere detected by immunohistochemistry；and their correlation with characteristics of clinicalmaterials and prognosis in cervical squamous cell carcinoma were evaluated.Results：Compared with the normal cervical tissue，the positive expression rate of NDRG-1 in cervical squamous cell carcinoma tissuewas significantly lower（P＜0.01），while the positive rate of COX-2，VEGF was higher（both P＜0.01）.There was no significant difference between positive rate of NDRG-1，COX-2，VEGF expressions and clinicopathologic data of cervical squamous cell carcinoma patients including age and tumor size（P＞0.05）.Positive expression rate of NDRG-1，COX-2 and VEGF were significant correlated with tumor histopathological grade，clinical FIGO stages and lymph nodemetastasis（P＜0.01）.There wasstatistically significant positive correlation among NDRG-1，COX-2 and VEGF expressions in cervical squamous cell carcinoma tissue（P＜0.01）.Therewas statistically correlation between positive rate of NDRG-1，COX-2 and VEGF expression with survival time by Kaplan-Meier analysis.Conclusion：The abnormal expressions of NDRG-1，COX-2，VEGFmight participate in the invasion and metastasis of cervical squamous cell carcinoma.The joint detection of NDRG-1，COX-2，VEGFmight provide some guiding significance to judge the prognosis of cervical squamous cell carcinoma.

N-myc downstream regulated gene-1；cyclooxygenase-2；vascular endothelial growth factor；immunohistochemistry；cervical squamous cell carcinoma

R737.33

A

1671－7783（2014）03－0250－05

10.13312／j.issn.1671-7783.y140036

江蘇省六大人才基金資助項目（2011－WS－023）；泰州市人民醫(yī)院重大科研資助項目（201008）

袁冬蘭（1973—），女，江蘇泰州人，副主任醫(yī)師，碩士，主要從事婦科腫瘤研究；于鴻（通訊作者），碩士生導(dǎo)師，副教授，E-mail：yuhongjianglin＠163.com

*：共同第一作者

2014－02－22 ［編輯］劉星星