血清microRNA表達(dá)譜對(duì)原發(fā)性膽汁性肝硬化的診斷價(jià)值

潘騰莉，孫莉，周興蓓，陳麗，於學(xué)軍，譚友文

（1.江蘇大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院，江蘇鎮(zhèn)江212001；2.鎮(zhèn)江市第三人民醫(yī)院肝病科，江蘇鎮(zhèn)江212005）

血清microRNA表達(dá)譜對(duì)原發(fā)性膽汁性肝硬化的診斷價(jià)值

潘騰莉1，2，孫莉2，周興蓓2，陳麗2，於學(xué)軍2，譚友文2

（1.江蘇大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院，江蘇鎮(zhèn)江212001；2.鎮(zhèn)江市第三人民醫(yī)院肝病科，江蘇鎮(zhèn)江212005）

目的：尋找原發(fā)性膽汁性肝硬化（primary biliary cirrhosis，PBC）患者血清中差異表達(dá)的microRNAs。方法：首先，將PBC組和健康對(duì)照組血清標(biāo)本各3例各自混合，采用Illumina GAⅡx高通量測(cè)序技術(shù)分析上述2組樣本，篩選出PBC患者與健康對(duì)照者表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的miRNAs；其次，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）對(duì)差異表達(dá)的miRNAs在擴(kuò)大標(biāo)本中進(jìn)行驗(yàn)證。最后，預(yù)測(cè)miRNAs的靶基因并進(jìn)一步分析其作用。結(jié)果：高通量測(cè)序技術(shù)篩選出143條miRNAs表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，其中，22條差異倍數(shù)＞2倍。經(jīng)過(guò)qRT-PCR驗(yàn)證，miR-122，miR-141，miR-34a在PBC組中的表達(dá)水平明顯高于對(duì)照組，與測(cè)序結(jié)果表達(dá)趨勢(shì)一致。靶基因預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，在細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中，miRNAs主要通過(guò)與蛋白質(zhì)結(jié)合發(fā)揮信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的作用。結(jié)論：PBC患者存在差異表達(dá)的miRNAs，且其對(duì)PBC的診斷有一定的參考價(jià)值。

原發(fā)性膽汁性肝硬化；miRNA；高通量測(cè)序

MicroRNA（miRNA）是長(zhǎng)度18～22 bp的核苷酸序列，通過(guò)3′UTR區(qū)域與宿主mRNA結(jié)合，降解或抑制其表達(dá)。研究表明，miRNA在機(jī)體發(fā)育、腫瘤形成和轉(zhuǎn)移、細(xì)胞凋亡和壞死等眾多病理生理過(guò)程中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。其中，研究最多的是miRNA對(duì)腫瘤發(fā)生發(fā)展及預(yù)后的調(diào)控作用［1－4］。近年來(lái)，miRNA與免疫調(diào)節(jié)機(jī)制的作用受到越來(lái)越多的關(guān)注［5－7］。原發(fā)性膽汁性肝硬化（primary biliary cirrhosis，PBC）是一種原因不明的，以肝內(nèi)中小膽管淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)、小膽管炎性破壞、血清特征性抗線粒體抗體（antimitochondrial antibody，AMA）陽(yáng)性為特征的進(jìn)行性非化膿性破壞，主要臨床表現(xiàn)為肝內(nèi)膽汁淤積，是一種以女性發(fā)病為主的慢性自身免疫?。?，8］。研究表明，在環(huán)境或遺傳因素的作用下，免疫細(xì)胞分化、發(fā)育與活化過(guò)程中固有的精細(xì)調(diào)節(jié)機(jī)制被破壞，導(dǎo)致免疫系統(tǒng)對(duì)自身組織產(chǎn)生免疫應(yīng)答，這是PBC發(fā)生與發(fā)展的根本原因［9］。但是，具體的發(fā)病機(jī)制有待于進(jìn)一步闡明。本研究旨在尋找PBC患者中存在差異表達(dá)的miRNA，評(píng)估其對(duì)PBC的診斷價(jià)值，并對(duì)其作用機(jī)制進(jìn)行初步闡述。

1 對(duì)象和方法

1.1 病例

23例PBC患者和23例健康對(duì)照者血清標(biāo)本均來(lái)自于2012年6月至2013年11月鎮(zhèn)江市第三人民醫(yī)院的門診與住院患者。對(duì)照組為在本院體檢的健康志愿者。其中，隨機(jī)選取PBC組和對(duì)照組血清標(biāo)本各3例分別進(jìn)行混合測(cè)序，其余標(biāo)本用于實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）驗(yàn)證。

PBC的診斷標(biāo)準(zhǔn)參照國(guó)際診斷指南［9］：肝臟的組織學(xué)診斷與PBC一致；膽汁淤積的肝功能試驗(yàn)；間接免疫熒光法測(cè)得抗線粒體抗體（AMA）陽(yáng)性。

本研究所有標(biāo)本的收集均通過(guò)鎮(zhèn)江市第三人民醫(yī)院倫理委員會(huì)的同意。所有受試者均簽署知情同意書(shū)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 樣品采集 患者在初次門診或住院時(shí)采集全血5 mL于醫(yī)用血清管中（無(wú)肝素抗凝），上下輕輕顛倒混勻，立即4℃保存，于2 h內(nèi)4 000×g，離心10 min。取上層血清至1.5 mL離心管中（無(wú)RNA酶），13 000×g，離心2 min。最后將上清液轉(zhuǎn)移至2 mL離心管中（無(wú)RNA酶），每管吸入250μL血清進(jìn)行分裝，棄血細(xì)胞沉淀。置于－80℃長(zhǎng)期保存。

1.2.2 總RNA提取與文庫(kù)構(gòu)建 血清RNA的提取按照LCSTRK1001試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。小RNA文庫(kù)構(gòu)建采用Illumina Truseq Small RNA Preparation kit試劑盒（LC Sciences）。總RNA鏈接5′接頭和3′接頭后經(jīng)RT-PCR擴(kuò)增形成小分子RNA的cDNA文庫(kù)，經(jīng)6%電泳緩沖液變性膠電泳分離，將長(zhǎng)度為47 bp的小分子RNA切膠回收。

1.2.3 高通量測(cè)序 cDNA純化后經(jīng)Illumina′s Cluster Station生成DNA簇，然后行Illumina GAⅡx測(cè)序。通過(guò)SCS v2.8軟件實(shí)時(shí)分析測(cè)序圖片，并使用RTA v1.8.70提取堿基信息。提取的原始序列利用ACGT101-miR v4.2（LC Sciences）軟件分析，生成原始數(shù)據(jù)庫(kù)。為保證篩選到高質(zhì)量的基因結(jié)果，剔除可比對(duì)離列數(shù)＜10的基因。最后分析PBC組和對(duì)照組之間差異表達(dá)的miRNA。

1.2.4 miRNA的靶基因預(yù)測(cè) 采用軟件Miranda和Target Scan在線服務(wù)站點(diǎn)輸入共同表達(dá)的miRNA進(jìn)行靶基因預(yù)測(cè)。

1.3 差異表達(dá)miRNA的qRT-PCR驗(yàn)證

隨機(jī)挑選差異表達(dá)的miRNA進(jìn)行驗(yàn)證，根據(jù)經(jīng)驗(yàn)以miR-24為內(nèi)參照［10］。取3μL總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，然后取1.5μL cDNA加入20μL的反應(yīng)體系中。qRT-PCR反應(yīng)中樣本均重復(fù)3次，然后于Rotor-gene 3000儀器中完成相應(yīng)的循環(huán)。55℃30 s預(yù)變性，95℃2 min變性，經(jīng)過(guò)40個(gè)95℃15 s、60℃30 s循環(huán)后在65℃溶解。miRNA的表達(dá)量用Ct值表示。2組差異表達(dá)基因的相對(duì)表達(dá)量用2－△△Ct表示。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差±s）表示，兩組間均數(shù)比較采用配對(duì)t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 基本臨床參數(shù)

測(cè)序標(biāo)本中PBC組與對(duì)照組的臨床參數(shù)見(jiàn)表1。結(jié)果顯示，PBC組患者的血清總膽紅素（TBIL）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）、谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、堿性磷酸酶（ALP）、谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶（GGT）的表達(dá)水平明顯高于對(duì)照組（P均＜0.05）。兩組患者的年齡差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

表1 兩組血清相關(guān)指標(biāo)的比較 n＝3，±s

表1 兩組血清相關(guān)指標(biāo)的比較 n＝3，±s

組別 平均年齡（歲） TBIL（μmol／L） AST（U／L） ALT（U／L） ALP（U／L） GGT（U／L）對(duì)照組 31.67±8.02 12.50±1.08 29.00±6.00 27.00±3.61 54.67±13.05 33.67±7.77 PBC組 56.33±9.61 128.87±21.27 162.00±46.00 124.00±12.17 711.33±47.72 751.67±58.53 t值 －2.425 －9.563 －4.675 －10.778 －20.447 －19.403 P值 ＞0.05 ＜0.05 ＜0.05 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01

2.2 第2代測(cè)序結(jié)果分析

經(jīng)過(guò)初級(jí)分析后，對(duì)照組得到4 691 800條原始序列，去除冗余后剩余881 742條，占總序列18.79%；PBC組測(cè)得944 362條原始序列，462 263條可比對(duì)序列，占總序列48.95%。對(duì)兩組可比對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行長(zhǎng)度分析，顯示序列長(zhǎng)度主要集中在19 bp，占總數(shù)量的38.85%，符合miRNA的長(zhǎng)度分布范圍。見(jiàn)圖1。

2.3 差異表達(dá)和新發(fā)現(xiàn)miRNA

結(jié)果顯示，共143條miRNA表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，其中PBC組表達(dá)上調(diào)105條，表達(dá)下調(diào)38條。已知的有137條，新發(fā)現(xiàn)6條，分別為hsa-miR-3665-p5，hsa-miR-3960-p3，hsa-miR-4508-p5，hsamiR-7641-2-p5，hsa-miR-7641-2-p3，PC-3p-755＿3750。比

圖1 可比對(duì)RNA序列長(zhǎng)度分布圖

較上述差異序列，差異倍數(shù)＞2倍的miRNA有22條，其中，miR-122差異倍數(shù)最大，在PBC組中比對(duì)照組高8.76倍；其次，miR-34a比對(duì)照組高7.26倍，miR-141比對(duì)照組高4.98倍；miR-26b是PBC組唯一下調(diào)的miRNA，比對(duì)照組下調(diào)2.49倍。見(jiàn)表2。

表2 兩組差異倍數(shù)＞2倍的22條m iRNA序列

2.4 miRNA的qRT-PCR驗(yàn)證

選取差異倍數(shù)較大的3條miRNA（miR-122，miR-34a，miR-141），分別在20、12、18例PBC患者和20名健康對(duì)照標(biāo)本中進(jìn)行初步驗(yàn)證。結(jié)果顯示，miR-122在PBC患者中的表達(dá)量明顯升高，升高21.24倍（t＝18.06，P＜0.000 1），明顯高于測(cè)序結(jié)果的差異倍數(shù)。而miR-141和miR-34a的差異倍數(shù)與測(cè)序相符，分別為5.51和5.43倍（t＝4.54，P＝ 0.000 8；t＝7.03，P＜0.000 1）。見(jiàn)圖2。

圖2 m iR-122，m iR-141和m iR-34a表達(dá)水平的驗(yàn)證

2.5 靶基因預(yù)測(cè)

Target Scan human 6.2軟件預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，hasmiR-34a共有655個(gè)可能的靶基因；Miranda軟件預(yù)測(cè)has-miR-34a共有1 100個(gè)可能的靶基因；Bingo分析顯示，靶基因功能涵蓋生物過(guò)程、細(xì)胞組分和分子功能三大類生物功能，部分功能預(yù)測(cè)見(jiàn)圖3。

圖3 m iR-34a靶基因生物過(guò)程部分預(yù)測(cè)結(jié)果

3 討論

高通量測(cè)序已廣泛應(yīng)用于小RNA或非編碼RNA（non-coding RNA）研究領(lǐng)域。相對(duì)于miRNA基因芯片而言，miRNA測(cè)序有更高的數(shù)據(jù)通量、更豐富的生物信息學(xué)分析，同時(shí)，不受數(shù)據(jù)庫(kù)和物種的限制，并可檢測(cè)到多種未知的miRNA。本研究中，首先對(duì)PBC組和對(duì)照組血清標(biāo)本進(jìn)行混合后采取Illumina GAⅡx高通量測(cè)序的方法，經(jīng)過(guò)軟件分析后發(fā)現(xiàn)，PBC組和對(duì)照組血清中143條miRNA的表達(dá)存在差異。該結(jié)果提示外周血清miRNA可作為PBC診斷的分子生物標(biāo)志物。以往對(duì)PBC的診斷主要集中在自身免疫抗體AMA陽(yáng)性以及肝穿刺病理檢查結(jié)果陽(yáng)性。近年來(lái)，研究發(fā)現(xiàn)miRNA在疾病的診斷方面起著重要作用，尤其在腫瘤的早期診斷［11］、靶向性治療以及判斷預(yù)后方面有很大進(jìn)展［12］。

本研究中檢測(cè)到一些在肝臟疾病方面有特殊意義的已知miRNA。miR-122是肝臟特異性表達(dá)的miRNA，在慢性乙型肝炎［10］、慢性丙型肝炎［13］和原發(fā)性肝癌［14］等疾病中均存在差異表達(dá)。本研究證實(shí)了miR-122在PBC患者外周血中表達(dá)明顯升高。升高倍數(shù)的不同可能是由于研究前后采用的方法不同，測(cè)序采用的是混合標(biāo)本，對(duì)年齡、病情相似的患者血清混合后進(jìn)行高通量檢測(cè)；而RT-PCR驗(yàn)證是來(lái)自于單獨(dú)擴(kuò)大血清樣本的單一序列檢測(cè)。因此，我們推測(cè)，miR-122的表達(dá)量可能受肝臟損傷嚴(yán)重程度的影響，而與引起肝臟損傷致病因素的影響不明顯。miR-141屬于miR-200家族，在引起器官纖維化方面研究較多。本研究中PBC患者外周血清中miR-141的表達(dá)變化也可能與其影響膽管細(xì)胞上皮間質(zhì)表型轉(zhuǎn)變（epithelial-mesenchymal transition，EMT）的作用有關(guān)。另有研究顯示，在低氧致腎小管上皮細(xì)胞EMT模型中miR-34a表達(dá)下降，予以轉(zhuǎn)染miR-34a可有效預(yù)防低氧導(dǎo)致的EMT，而抑制miR-34a的表達(dá)可促進(jìn)EMT，同時(shí)證實(shí)這一作用通過(guò)Notch信號(hào)通路完成［15］。

本研究綜合2種miRNA作用靶基因的結(jié)果，推測(cè)miRNA在細(xì)胞內(nèi)通過(guò)與編碼蛋白質(zhì)的靶基因結(jié)合發(fā)揮分子生物功能，包括生物過(guò)程、細(xì)胞組分、分子功能等。但本研究在原始數(shù)據(jù)方面尚存在一定的不足，如miRNA靶基因預(yù)測(cè)軟件數(shù)據(jù)有較高的假陽(yáng)性率、相關(guān)生物學(xué)知識(shí)和基因數(shù)據(jù)尚不全面等，可能影響分析結(jié)果，有待進(jìn)一步研究。

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A pilot study of serum m icroRNA profiles as a novel biomarker for primary biliary cirrhosis

PAN Teng-li1，2，SUN Li2，ZHOU Xing-bei2，CHEN Li2，YU Xue-jun2，TAN You-wen2
（1.School ofClinicalMedicine，Jiangsu University，Zhenjiang Jiangsu 212001；2.Departmentof Liver Diseases，the Third People′s Hospital of Zhenjiang，Zhenjiang Jiangsu 212005，China）

Objective：To screen serum microRNA profiles by high throughput sequencing technology method as diagnostic markers for primary biliary cirrhosis（PBC）.M ethods：First，we employed Illumina GA IIx deep sequencing for the initial screening to indicate the read numbers ofmicroRNAs expression in serum pool of 3 PBC and 3 healthy controls，respectively.Second，qRT-PCR validation study was conducted in more samples.Finally，computer analysiswas conducted to predict target genes and biological functions.Results：Twenty-two miRNAs，whose fold change were greater than 2，were filtered out by high throughput sequencing technology.After qRT-PCR validation，the serum expression levels of miR-122，miR-34a and miR-141 were significantly higher in PBC，consistent with the sequencing results.Target genes of prediction results showed thatmicroRNAs played a role in signal transduction，in the nucleus and cytoplasm，through combined with protein.Conclusion：The distinguishing expressed microRNAs had certain reference value on the diagnosis of PBC.

primary biliary cirrhosis；microRNAs；high-throughput sequencing

R575.22

A

1671－7783（2014）03－0230－05

10.13312／j.issn.1671-7783.y140045

江蘇省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（BK2011515）

潘騰莉（1988—），女，碩士研究生；譚友文（通訊作者），主任醫(yī)師，碩士生導(dǎo)師E-mail：tyw915＠sina.com

2014－03－05 ［編輯］劉星星