人巨細胞病毒體外感染對外周血單個核細胞的趨化功能

韋葦，顧紹慶，李文靜，馬曉蒙，趙媛

（1.江蘇大學臨床醫(yī)學院，江蘇鎮(zhèn)江212001；2.江蘇大學附屬人民醫(yī)院兒科，江蘇鎮(zhèn)江212002）

人巨細胞病毒體外感染對外周血單個核細胞的趨化功能

韋葦1，顧紹慶2，李文靜1，馬曉蒙1，趙媛1

（1.江蘇大學臨床醫(yī)學院，江蘇鎮(zhèn)江212001；2.江蘇大學附屬人民醫(yī)院兒科，江蘇鎮(zhèn)江212002）

目的：探討人巨細胞病毒（human cytomegalovirus，HCMV）體外感染對人外周血單個核細胞（peripheral blood mononuclear cells，PBMC）的趨化功能，及地塞米松對病毒趨化作用的影響。方法：將HCMV AD169株稀釋成梯度半數(shù)組織培養(yǎng)感染量（tissue culture infective dose，TCID50），即5、10、20、40、60、80、100、1 000 TCID50，分別感染人胚肺成纖維細胞（human embryonic lung fibroblast，HELF），培養(yǎng)24，48，72，96 h后提取上清液，趨化PBMC，于倒置顯微鏡高倍鏡下觀察并計數(shù)被趨化的PBMC，比較趨化作用的強弱；同時用不同質量濃度的地塞米松（0.125，1.25，12.5，25，50，100μg／m L）感染HELF，觀察其對HCMV感染上清介導的PBMC趨化作用的影響，0μg／mL作為對照。結果：5 TCID50與10 TCID50之間，80 TCID50與1 00 TCID50之間，1 00 TCID50與1 000 TCID50之間，培養(yǎng)24，48，72，96 h時趨化作用差異均無統(tǒng)計學意義（P均＞0.05）。10 TCID50與20 TCID50之間，20 TCID50與40 TCID50之間，培養(yǎng)24，48，72 h時趨化作用差異均無統(tǒng)計學意義（P均＞0.05）。同一濃度病毒，培養(yǎng)24 h與48 h之間趨化作用差異均無統(tǒng)計學意義（P均＞0.05），培養(yǎng)48 h與96 h之間，72 h與96 h之間趨化作用差異均有統(tǒng)計學意義（P均＜0.05）。與對照組（0μg／mL）比較，1.25μg／mL和12.5μg／mL地塞米松對HCMV感染上清介導的PBMC趨化作用無明顯影響（P均＞0.05），其余質量濃度差異均有統(tǒng)計學意義（P均＜0.01）。結論：HCMV感染HELF后的培養(yǎng)上清具有趨化PBMC的功能，在一定質量濃度范圍內，隨著時間的延長趨化作用增強。地塞米松體外能夠抑制病毒的趨化作用，且對PBMC的趨化抑制作用隨著質量濃度的增加而增強。

人巨細胞病毒；炎癥；地塞米松；趨化作用

人巨細胞病毒（human cytomegalovirus，HCMV）屬β皰疹病毒亞科，為雙鏈線狀DNA病毒，?？梢鹪袐D宮內感染或圍生期感染，導致胎兒或新生兒各種畸形和疾病。在免疫低下狀態(tài)人群（如艾滋病、器官移植等患者）中，HCMV可引起致死性感染，危及生命［1］。HCMV可直接攻擊和損傷宿主細胞。隨著對病毒與細胞趨化性研究的深入［2］，HCMV趨化因子作用引起學者的廣泛重視。我們前期小鼠體內研究也表明，HCMV感染可引發(fā)大量單核細胞和淋巴細胞浸潤［3］。

HCMV具有編碼趨化因子及其受體類似物的基因，其感染后所編碼的趨化因子及其受體類似物，干擾機體正常的細胞因子及其受體的生理功能，參與某些巨細胞病毒疾病的病理改變，導致病毒在體內擴散、增殖和潛伏［4］；HCMV感染還可導致機體其他多種炎癥因子的產(chǎn)生，如TNF-α、IL-6、IL-8、粒細胞集落刺激因子（GSF）等［5］；IL-6和GSF參與HCMV感染相關的血管性疾病的形成。從致病機制而言，病毒除直接攻擊宿主細胞致宿主損傷外，其編碼的趨化因子及其受體類似物可通過促進機體相關炎癥因子的釋放，趨化活化炎癥細胞至損害部位，加重宿主損傷。

炎癥抑制因子通過抑制細胞合成和分泌炎癥相關細胞因子、促炎因子等途徑，抑制炎性細胞的浸潤，從而抑制炎癥的發(fā)生。地塞米松屬于長效的糖皮質激素類藥物，具有廣泛的抗炎作用。那么，地塞米松是否能夠影響HCMV感染所致的炎癥反應？在HCMV感染后，應用地塞米松是否能抑制炎癥細胞的趨化，進而減輕宿主的損害？因此，本實驗在研究HCMV體外趨化PBMC功能的同時，設不同質量濃度的地塞米松研究其對HCMV趨化作用的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞 人胚肺成纖維細胞（human embryonic lung fibroblast，HELF）由美國菌種保藏中心ATCC提供，按常規(guī)方法培養(yǎng)、傳代，本實驗采用第10～20代。PBMC按常規(guī)方法從健康志愿者外周血中提取、培養(yǎng)。

1.1.2 病毒 HCMV AD169株由安徽醫(yī)科大學微生物教研室提供，按常規(guī)方法接種、傳代、滴定，并測定半數(shù)組織培養(yǎng)感染量（tissue culture infective dose，TCID50）為10－4.6。

1.1.3 主要試劑 高糖DMEM、RPMI 1640均為Gibco公司產(chǎn)品，新生小牛血清、胎牛血清均為杭州四季青公司產(chǎn)品，人外周血淋巴細胞分離液為天津灝洋生物制品科技有限責任公司產(chǎn)品，PBS、胰蛋白酶均為Amresco公司產(chǎn)品，二甲基亞砜（DMSO）、四甲基偶氮唑鹽（MTT）為Sigma公司產(chǎn)品，地塞米松注射液（5 mg／mL）為華中藥業(yè)股份有限公司產(chǎn)品。

1.1.4 主要儀器 CO2細胞培養(yǎng)箱（Heraeus公司），倒置顯微鏡（德國Leica公司），酶標儀（Anthos公司），高速冷凍離心機（Eppendorf公司）。

1.2 方法

1.2.1 檢測地塞米松對HELF的毒性 收集對數(shù)期HELF，計數(shù)并調整細胞懸液濃度，加入96孔細胞培養(yǎng)板中，每孔100μL，此時細胞密度約103～104／孔，邊緣孔用無菌PBS填充，以防邊緣效應。于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至孔底鋪滿單層細胞，此時細胞密度約105／孔。將地塞米松注射液與含3%小牛血清的高糖DMEM（不加雙抗）以不同比例混勻，配制成0.125，1.25，12.5，25，50，100，200μg／mL質量濃度的地塞米松溶液。將上述不同質量濃度梯度的地塞米松依次加入96孔板中，每孔200 μL。設不加地塞米松的HELF組為正常對照組，加不同質量濃度地塞米松的HELF為實驗組，每組各設5個復孔。調零孔則加入200μL培養(yǎng)液。于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每天顯微鏡下觀察細胞毒性變化。約4 d后，棄培養(yǎng)液，加MTT染色液，20 μL／孔（質量濃度為5 mg／mL）。于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4 h，肉眼可見細胞中有藍紫色甲贅結晶形成，棄染色液，加DMSO，100μL／孔。避光低速振蕩10 min，使藍紫色甲贅結晶充分溶解，室溫下靜置5 min，于酶標儀490 nm處測各孔光密度（D）值，計算細胞存活率。細胞存活率（%）＝實驗組平均D值／對照組平均D值×100%。換算出地塞米松對HELF的半數(shù)中毒濃度（TC50），推算出最大無毒濃度（TC0），實驗重復3次［6－7］。

1.2.2 PBMC的提取與培養(yǎng) 取新鮮肝素抗凝人外周全血30 mL，與PBS等體積混勻。取15 mL離心管數(shù)個，每管加入6 mL淋巴細胞分離液，小心地沿管側壁注入6 mL經(jīng)PBS稀釋后的外周血，使其處于分離液液面之上。以2 000 r／min離心20 min，此時離心管內由上而下細胞分4層：血漿層、環(huán)狀乳白色淋巴細胞層、透明的淋巴細胞分離液層、紅細胞層。輕輕吸取第2層約1～2 mL，移至另一離心管中。加入5 mL PBS，充分混勻，以2 000 r／min離心20 min，棄上清，反復清洗沉淀2次，以去除淋巴細胞分離液、血小板等雜質，得到所需細胞。用1 mL含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液重懸細胞，取10μL于細胞計數(shù)板，顯微鏡下計數(shù)，每1 mL外周全血可得到106～107個PBMC。將細胞懸液加入培養(yǎng)瓶中，加入5 mL含10%胎牛血清的RPMI 1640完全培養(yǎng)液，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1 d備用。

1.2.3 HCMV體外感染HELF 取數(shù)塊已鋪有單層HELF的24孔板，每塊板分別加入5、10、20、40、60、80、100、1 000 TCID50的HCMV AD169毒株，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中吸附1.5 h，更換等量細胞維持液（含3%小牛血清的高糖DMEM）。分別于24、48、72、96 h終止培養(yǎng)。每次終止培養(yǎng)時，每板各取3孔感染上清，4℃，12 000×g離心30 min，以去除上清液中的病毒及細胞碎片［8］。

1.2.4 趨化性實驗 將上述離心后上清分別加入24孔5μm Transwell趨化板的下室。將“1.2.2”中獲得的PBMC，用不含血清的RPMI 1640培養(yǎng)液配置成約106／mL的細胞懸液，加入Transwell趨化板的上室，每孔100μL。將趨化板置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1.5 h。于顯微鏡下計數(shù)落入下室中的PBMC；每孔隨機選取5個高倍視野，計算細胞總數(shù)。每組均設3個復孔［5］。選出趨化作用最強時的病毒濃度及培養(yǎng)時間。

1.2.5 地塞米松對HCMV感染上清趨化作用的影響 在呈單層貼壁生長的HELF 24孔細胞培養(yǎng)板中，接種“1.2.4”中選出的HCMV，吸附1.5 h后，更換含不同質量濃度地塞米松的DMEM，每個實驗小組均各設3個復孔。于37℃、含5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)數(shù)天后，收集各培養(yǎng)上清，4℃12 000×g，離心30 min，重復“1.2.4”的方法檢測各組對PBMC的趨化實驗。

1.2.6 滅活病毒感染上清的趨化作用 在鋪有單層HELF的24孔板中，分別接種滅活HCMV（經(jīng)紫外線照射10 min）、“1.2.4”選出的HCMV，吸附1.5 h后，更換DMEM細胞維持液。同時設正常HELF細胞為對照組。每組均各設3個復孔。于37℃、含5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)數(shù)天后，收集各培養(yǎng)上清，離心后重復“1.2.4”的趨化實驗。

1.3 統(tǒng)計學處理

2 結果

2.1 地塞米松對HELF細胞的毒性作用

結果如圖1所示，地塞米松在100μg／mL以下時對HELF細胞無明顯的毒性作用，而大于100μg／mL時，細胞毒性作用明顯，鏡下表現(xiàn)為細胞數(shù)量減少，形態(tài)不一，甚至壞死脫落。根據(jù)細胞存活率得出地塞米松的TC0為100μg／mL；根據(jù)Probit回歸法計算出地塞米松的TC50為92.05μg／mL。

圖1 地塞米松對HELF細胞的毒性作用

2.2 HCMV感染HELF后的上清趨化PBMC的作用

比較不同濃度的病毒培養(yǎng)上清在不同培養(yǎng)時間下對PBMC的趨化作用，結果顯示，5 TCID50與10 TCID50之間，80 TCID50與1 00 TCID50之間，1 00 TCID50與1 000 TCID50之間，培養(yǎng)24，48，72，96 h時趨化作用差異均無統(tǒng)計學意義（P均＞0.05）。10 TCID50與20 TCID50相比，20 TCID50與40 TCID50相比，培養(yǎng)24，48，72 h時趨化作用差異均無統(tǒng)計學意義（P均＞0.05）。同一濃度病毒，培養(yǎng)24 h與48 h之間趨化作用差異均無統(tǒng)計學意義（P均＞0.05），培養(yǎng)48 h與96 h之間，72 h與96 h之間趨化作用差異均有統(tǒng)計學意義（P均＜0.05），除10 TCID50外，培養(yǎng)48 h與72 h之間趨化作用均有統(tǒng)計學意義（P均＜0.05）。

由圖2可見，HCMV感染HELF后的上清具有趨化PBMC的作用，且在一定范圍內（5 TCID50～80 TCID50），隨著病毒濃度的增加，趨化作用增強；當濃度超過80 TCID50時，趨化強度增加則不明顯；隨著培養(yǎng)時間的延長，尤其是在72，96 h，趨化作用也不斷增強。所以，我們選擇80 TCID50濃度的病毒，培養(yǎng)時間為96 h，進一步實驗。

圖2 不同培養(yǎng)時間下細胞遷移數(shù)與病毒濃度的關系

2.3 地塞米松抑制病毒上清對PBMC的趨化作用

如圖3所示，與對照組（0μg／mL）比較，1.25 μg／mL和12.5μg／mL地塞米松對HCMV感染上清介導的PBMC趨化作用無明顯影響（t1.25＝－0.09，t12.5＝－1.80，P均＞0.05），其余質量濃度地塞米松與對照組相比，差異均有統(tǒng)計學意義（t25＝－5.23，t50＝－8.66，t100＝－12.7，P均＜0.01），提示地塞米松對HCMV感染上清介導的PBMC趨化作用具有一定的抑制作用，且隨著地塞米松質量濃度的增加，趨化作用減弱（F值＝52.75，P＜0.01）。

圖3 地塞米松質量濃度與HCM V上清趨化作用的關系

2.4 滅活病毒感染上清介導的PBMC趨化作用弱于正常病毒感染上清

與正常病毒感染上清介導的PBMC趨化作用比較，滅活病毒感染上清介導的趨化作用明顯減弱，正常細胞＋滅活HCMV組中遷移細胞數(shù)約為正常細胞＋80 TCID50HCMV組的1／3。正常細胞＋80 TCID50HCMV組中遷移細胞數(shù)約為正常細胞組的4.5倍。

3 討論

近來研究表明，炎癥反應在HCMV感染的發(fā)病機制及病情進展的過程中發(fā)揮重要作用。本實驗旨在從整個病毒培養(yǎng)上清的角度，研究其趨化作用。

HCMV具有編碼趨化因子及其受體類似物的基因，包括UL128、UL146和UL147等趨化因子類似物基因，US27、US28、UL33和UL78等趨化因子受體類似物基因［9］。研究顯示，HCMV編碼的趨化因子類似物屬于分泌性、親水性蛋白［10］。本實驗可推測，病毒感染上清中可能存在HCMV編碼的趨化因子或其受體類似物。在對UL146的研究中發(fā)現(xiàn)，從HCMV Toledo株感染后72 h開始，病毒基因轉錄編碼的UL146基因產(chǎn)物顯著增多［8］。本實驗結果顯示，HCMV介導的趨化作用在72 h和96 h顯著增加（圖2），據(jù)此可推測，病毒編碼的趨化蛋白主要為病毒晚期基因產(chǎn)物。

Transwell趨化板分上、下室，中間以一層薄膜分隔，巧妙地模擬了體內環(huán)境血管壁分隔的組織細胞與血細胞。本實驗證實了HCMV感染后的上清具有趨化PBMC的功能。結果顯示，并不是病毒濃度越高，趨化作用越強，80、1 000 TCID50病毒趨化作用差異無統(tǒng)計學意義?？赡艿脑蛉缦拢翰《緷舛冗^高，抑制正常細胞的生長，甚至破壞細胞結構，使其裂解，進而病毒復制表達的能力受到抑制，產(chǎn)物蛋白的量也受到影響；Transwell上室PBMC的量是一定的，所以相應的趨化因子受體的量也是有限的，在一定范圍內，病毒濃度越高，蛋白產(chǎn)物也越多，但是受體飽和時，趨化作用的差異就無統(tǒng)計學意義了。

地塞米松是一種臨床常用的長效糖皮質激素類藥物，具有廣泛的抗炎作用，除了對骨關節(jié)炎、創(chuàng)傷性中耳炎、急性肝損傷等引起的相關炎癥反應具有抑制作用，對病毒所致的炎癥反應也有影響，如病毒性腦炎、病毒性角膜炎等。本實驗證實地塞米松對HCMV感染后的上清趨化PBMC的功能具有一定的抑制作用，因此提示，當病毒感染時，使用激素要特別注意，否則會抑制機體單核細胞的免疫功能，加重病情；但其具體抑制機制不明，可能與其對病毒編碼的趨化分泌蛋白功能的影響、抑制HELF細胞增殖、促凋亡、影響細胞鈉通道［11］等有關，有待進一步研究。

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Chemotactic effect of human cytomegalovirus to peripheral blood mononuclear cells in vitro

WEIWei1，GU Shao-qing2，LIWen-jing1，MA Xiao-meng1，ZHAO Yuan1
（1.School of ClinicalMedicine，Jiangsu University，Zhenjiang Jiangsu 212001；2.Departmentof Pediatrics，the Affiliated People′s Hospital of Jiangsu University，Zhenjiang Jiangsu 212002，China）

Objective：To explore the chemotactic effectof human cytomegalovirus（HCMV）on peripheral blood mononuclear cells（PBMC）in vitro，and the influence of dexamethasone on chemotaxis.M ethods：We took different concentrations（5，10，20，40，60，80，100，1 000 TCID50）of HCMV AD169 to vaccinate human embryonic lung fibroblast cells（HELF），and extracted culturemedia supernatant，which was used to attract PBMC at 24，48，72，96 h.Then we observed and counted themigratory PBMC under high power lens of themicroscope，and compared the strength of chemotaxis.We also added dexamethasone at different concentrations（0.125，1.25，12.5，25，50，100μg／mL）to infect HELF as control.Results：Therewere no difference in chemotaxis among different concentration of HCMV between 5 TCID50and 10 TCID50，80 TCID50and 1 000 TCID50，1 00 TCID50and 1 000 TCID50among 24，48，72，96 h（both P＞0.05）.The chemotactic effect of HCMV between 10 TCID50and 20 TCID50，20 TCID50and 40 TCID50，among 24，48，72 h had no statistical difference（both P＞0.05）.Compared with the control goup（0μg／mL），the chemotaxis of culturemedia supernatant of the dexamethasone at 12.5μg／mL and 12.5μg／mLhad no statistical difference（both P＞0.05），while dexamethasone at 25，50，100μg／mL had statistical difference（both P＜0.01）.Conclusion：The supernatant of HCMV infected HELF had chemotaxis to PBMC，which was increased with the culture time increasing.Dexamethasone could restrain inhibitory effect on chemotaxis，which was increased with the drug concentration increasing.

human cytomegalovirus；inflammatory response；dexamethasone；chemotactic effect

R373.11

A

1671－7783（2014）03－0226－04

10.13312／j.issn.1671-7783.y140028

韋葦（1988—），女，碩士研究生；顧紹慶（通訊作者），主任醫(yī)師，碩士生導師，E-mail：gsqcc＠sohu.com

2014－01－15 ［編輯］ 劉星星