MSCs旁分泌對(duì)多柔比星誘導(dǎo)的H9C2細(xì)胞凋亡的影響

劉玲玲，趙龍，李曉麗，張贏予，王好，周艷芳，張國(guó)輝

（江蘇大學(xué)附屬人民醫(yī)院心內(nèi)科，江蘇鎮(zhèn)江212002）

MSCs旁分泌對(duì)多柔比星誘導(dǎo)的H9C2細(xì)胞凋亡的影響

劉玲玲，趙龍，李曉麗，張贏予，王好，周艷芳，張國(guó)輝

（江蘇大學(xué)附屬人民醫(yī)院心內(nèi)科，江蘇鎮(zhèn)江212002）

目的：探討骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cells，MSCs）旁分泌因子肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子（hepatocyte growth factor，HGF）對(duì)多柔比星誘導(dǎo)的H9C2細(xì)胞凋亡的影響及其機(jī)制。方法：將SD大鼠MSCs傳代至第3代后分為未轉(zhuǎn)染組、轉(zhuǎn)染HGF-siRNA組及轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照（NC）-siRNA組，分別進(jìn)行相應(yīng)處理。通過(guò)ELISA、蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)各組MSCs細(xì)胞上清中及細(xì)胞中HGF、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1（transforming growth factorβ1，TGF-β1）含量和蛋白表達(dá)量。用濃度為1μmol／L的多柔比星處理H9C2細(xì)胞4 h后分為4組：?jiǎn)为?dú)培養(yǎng)組、MSCs共培養(yǎng)組、與HGF-siRNA-MSCs共培養(yǎng)組及與NC-siRNA-MSCs共培養(yǎng)組。培養(yǎng)24 h后通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)AnnexinⅤ／PI雙染法檢測(cè)H9C2細(xì)胞凋亡率。結(jié)果：HGF-siRNA組MSCs上清中TGF-β1濃度為（519.23±24.34）pg／mL，明顯高于未轉(zhuǎn)染組［（459.65±11.78）pg／mL］及NC-siRNA組［（459.33±11.78）pg／mL］（P均＜0.05）；轉(zhuǎn)染HGF-siRNA組MSCs中TGF-β1表達(dá)量亦明顯高于其他兩組。HGF-siRNA-MSCs與H9C2細(xì)胞共培養(yǎng)組中H9C2細(xì)胞凋亡率為（18.54±0.64）%，較MSCs共培養(yǎng)組［（6.65± 0.49）%］及NC-siRNA-MSCs共培養(yǎng)組［（9.70±1.62）%］明顯增加（P均＜0.05）。結(jié)論：MSCs旁分泌因子HGF通過(guò)抑制TGF-β1的表達(dá)對(duì)多柔比星誘導(dǎo)的H9C2細(xì)胞凋亡起保護(hù)作用。

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞；旁分泌；肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子；轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1；細(xì)胞凋亡；多柔比星

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cells， MSCs）是一種來(lái)源于骨髓間質(zhì)的多功能干細(xì)胞，具有向多種細(xì)胞分化的潛能。最初對(duì)其在心臟疾病方面的研究側(cè)重于MSCs向心肌細(xì)胞的分化，但越來(lái)越多的文獻(xiàn)報(bào)道，MSCs向心肌細(xì)胞分化的數(shù)量極少［1］，不足以解釋其對(duì)心臟功能的恢復(fù)作用，且發(fā)現(xiàn)MSCs可分泌較多的細(xì)胞因子［2］。目前已被確認(rèn)的細(xì)胞因子包括肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子（hepatocyte growth factor，HGF），胰島素樣生長(zhǎng)因子，基質(zhì)細(xì)胞衍生因子，血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子，堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子，轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）等近40種。HGF具有抗心肌細(xì)胞凋亡、促進(jìn)血管再生的作用。TGF-β1在心臟損傷、修復(fù)以及心臟重構(gòu)中起著關(guān)鍵作用。TGF-β1除了促進(jìn)心肌肥大和纖維化，還能導(dǎo)致心肌細(xì)胞凋亡［3］。

本課題組在近幾年的研究中初步探討了HGF對(duì)多柔比星誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡有明顯的保護(hù)作用［4］。相反，TGF-β1能促進(jìn)心肌細(xì)胞的凋亡［5］，而通過(guò)抑制MSCs中TGF-β1的表達(dá)，能顯著降低多柔比星誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡率。在前期研究結(jié)果的基礎(chǔ)上，我們?cè)O(shè)想HGF對(duì)心肌細(xì)胞的保護(hù)作用除了直接抑制細(xì)胞凋亡外，是否會(huì)抑制MSCs分泌TGF-β1呢？

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)轉(zhuǎn)染siRNA，從后轉(zhuǎn)錄水平抑制MSCs中HGF的表達(dá)，觀察MSCs旁分泌因子對(duì)多柔比星誘導(dǎo)的H9C2細(xì)胞凋亡的影響并探討其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

4～6周齡SD大鼠，由江蘇大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供［實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)：SYXK（蘇）2008－0024］。H9C2細(xì)胞株購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)。

鹽酸多柔比星購(gòu)自美國(guó)Enzo公司；HGF-siRNA由上海吉瑪公司設(shè)計(jì)并合成；大鼠HGF、TGF-β1ELISA試劑盒購(gòu)自上海奇康生物科技公司；兔抗大鼠HGF-IgG購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司，兔抗大鼠TGF-β1-IgG、GAPDH-IgG、山羊抗兔IgG購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司；eECL高靈敏度化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒購(gòu)自北京康為世紀(jì)生物技術(shù)有限公司；AnnexinⅤ／PI雙染凋亡試劑盒購(gòu)自南京厚載生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 SD大鼠原代MSCs的分離和培養(yǎng) 頸椎脫臼法處死大鼠，取出雙側(cè)股骨和腓骨并顯露骨髓腔。用5 mL注射器抽取無(wú)血清DMEM-F12沖洗骨髓腔。將收集的細(xì)胞懸液過(guò)濾、離心，棄上清，用含10%胎牛血清的DMEF-F12重懸細(xì)胞，以107／mL密度接種于10 cm培養(yǎng)皿，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞融合達(dá)80%～90%時(shí)進(jìn)行首次傳代培養(yǎng)。取培養(yǎng)至第3代的MSCs用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 H9C2細(xì)胞的培養(yǎng) 將H9C2細(xì)胞株以107／mL細(xì)胞密度接種于10 cm培養(yǎng)皿后置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞達(dá)80%～90%融合時(shí)以1∶2傳代培養(yǎng)。

1.2.3 MSCs siRNA轉(zhuǎn)染方法 轉(zhuǎn)染前1天將第3代MSCs以2×104／mL的密度接種到6孔板中繼續(xù)培養(yǎng)。次日，待細(xì)胞融合達(dá)70%～80%，取HGF-siRNA稀釋液2μL于EP管中，加入200μL無(wú)血清的DMEM-F12混勻。取Lipofectamine 2000脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑5μL，加入250μL DMEM-F12培養(yǎng)基混勻后室溫下孵育5 min。將以上兩種液體混勻后室溫下孵育20 min，再重新接種到6孔板中，加入1 550μL無(wú)血清的DMEM-F12培養(yǎng)基，混勻后置于CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。12 h后換為含10%血清的DMEM-F12培養(yǎng)，24 h后熒光電子顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染效率，并收集上清及細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

1.2.4 MSCs與H9C2細(xì)胞共培養(yǎng)

1.2.4.1 H9C2細(xì)胞多柔比星損傷模型的建立取H9C2細(xì)胞懸液，每孔2 mL加入到30 mm共培養(yǎng)插件Millicell裝置中，置于培養(yǎng)箱中預(yù)培養(yǎng)48 h。用終濃度為1μmol／L的多柔比星處理4 h，建立多柔比星損傷模型，更換為含 10%血清的DMEM-F12。

1.2.4.2 轉(zhuǎn)染MSCs 將第3代MSCs按2×105／mL接種于6孔板中，24 h后分為未轉(zhuǎn)染組，轉(zhuǎn)染HGF-siRNA組及轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照（NC）-siRNA組，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。

1.2.4.3 建立MSCs與H9C2細(xì)胞共培養(yǎng)體系 將接種有H9C2細(xì)胞的Millicell裝置插入預(yù)先接種有MSCs的6孔板中，建立兩種細(xì)胞非直接接觸式的共培養(yǎng)體系。共分為4組：?jiǎn)为?dú)H9C2細(xì)胞培養(yǎng)組、與MSCs共培養(yǎng)組、與HGF-siRNA-MSCs共培養(yǎng)組及與NC-siRNA-MSCs共培養(yǎng)組。

1.2.5 ELISA法檢測(cè)細(xì)胞上清HGF及TGF-β1含量

轉(zhuǎn)染成功后收集各組細(xì)胞上清液，按ELISA試劑盒操作說(shuō)明加入適量標(biāo)準(zhǔn)品及樣品、檢測(cè)抗體、底物及終止液。酶標(biāo)儀檢測(cè)各孔光密度值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算各組細(xì)胞上清中HGF及TGF-β1的質(zhì)量濃度。

1.2.6 蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)HGF及TGF-β1的相對(duì)表達(dá)量 MSCs轉(zhuǎn)染siRNA 24 h后加入細(xì)胞裂解液與PMSF的混合液體，40 min后吸取裂解液，4℃12 000 r／min離心20 min，吸取上清。取等蛋白含量的樣品上樣。恒壓80 V電泳約30min后提高電壓至110 V。80 V恒壓下4℃轉(zhuǎn)膜2 h。室溫下5%脫脂牛奶封閉2 h，分別加入相應(yīng)的一抗（HGF稀釋濃度為1∶800，TGF-β1、GADPH稀釋濃度為1∶1 000），4℃過(guò)夜孵育。次日用HRP標(biāo)記的二抗（稀釋濃度均為1∶10 000）室溫下孵育1 h。洗膜后加入eECL顯色液，用Bio-Rad凝膠成像儀掃描拍攝蛋白條帶，測(cè)定各條帶灰度值，并以GAPDH為參照，計(jì)算和分析結(jié)果。

1.2.7 流式細(xì)胞術(shù)AnnexinⅤ／PI雙染法檢測(cè)H9C2細(xì)胞凋亡率 吹打各組Millcell膜上的H9C2細(xì)胞，離心后收集細(xì)胞至Ep管中，用PBS洗滌細(xì)胞2次。各組分別加入結(jié)合緩沖液500μL混勻懸浮細(xì)胞，加入Annexin V-FITC 5μL避光反應(yīng)，再加入PI 10μL避光4℃孵育5 min，流式細(xì)胞儀檢測(cè)分析。以AnnexinⅤ（＋）／PI（－）、AnnexinⅤ（＋）／PI（＋）兩個(gè)象限的細(xì)胞比例之和作為凋亡率。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

使用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，重復(fù)測(cè)量資料采用一般線性模型方差分析，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 SD大鼠MSCs的形態(tài)

MSCs懸液接種24 h后在電子顯微鏡下觀察，細(xì)胞開(kāi)始貼壁生長(zhǎng)。換液后可見(jiàn)貼壁的MSCs呈梭形或不規(guī)則形，單個(gè)或片狀生長(zhǎng)。繼續(xù)培養(yǎng)3～5 d后，貼壁細(xì)胞呈明顯的細(xì)胞集落，呈漩渦狀分布。傳代后，細(xì)胞形態(tài)較均一，呈長(zhǎng)梭形，為纖維樣細(xì)胞外觀。傳至第3代時(shí)，細(xì)胞形態(tài)較穩(wěn)定。見(jiàn)圖1。

2.2 H9C2細(xì)胞形態(tài)

培養(yǎng)3 d的H9C2細(xì)胞呈長(zhǎng)梭形，胞質(zhì)豐富，折光度好。見(jiàn)圖2。

2.3 HGF-siRNA轉(zhuǎn)染MSCs的效率

HGF-siRNA轉(zhuǎn)染24 h后，熒光電子顯微鏡下計(jì)算綠色熒光細(xì)胞所占比例，顯示MSCs的轉(zhuǎn)染效率可達(dá)（75.46±3.36）%。見(jiàn)圖3。

圖1 第3代骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（倒置顯微鏡×200）

圖2 H9C2細(xì)胞形態(tài)（倒置顯微鏡×200）

圖3 轉(zhuǎn)染HGF-siRNA的MSCs形態(tài)（熒光電子顯微鏡×200）

2.4 各組MSCs上清中HGF及TGF-β1含量

與未轉(zhuǎn)染組比較，轉(zhuǎn)染HGF-siRNA后的MSCs上清中的HGF含量明顯下降，而TGF-β1含量卻明顯增加，見(jiàn)表1。

表1 各組M SCs上清中HGF、TGF-β1的含量

2.5 各組MSCs中HGF及TGF-β1的表達(dá)量

提取各組細(xì)胞蛋白，用蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)HGF及TGF-β1的表達(dá)量。轉(zhuǎn)染HGF-siRNA后的MSCs兩種旁分泌因子的表達(dá)量與細(xì)胞上清中檢測(cè)結(jié)果一致。見(jiàn)圖4－圖6。

圖4 蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)各組MSCs旁分泌因子的表達(dá)

2.6 各組H9C2細(xì)胞的凋亡率

流式細(xì)胞術(shù)分析結(jié)果顯示，單獨(dú)培養(yǎng)的H9C2細(xì)胞凋亡率為（19.39±0.17）%，與MSCs共培養(yǎng)組為（6.65±0.4）%，與HGF-siRNA-MSCs共培養(yǎng)組為（18.54±0.64）%，與NC-siRNA-MSCs共培養(yǎng)組為（9.70±1.62）%。與HGF-siRNA-MSCs共培養(yǎng)24 h后的H9C2細(xì)胞凋亡率較與未轉(zhuǎn)染的MSCs共培養(yǎng)組及NC-siRNA-MSCs共培養(yǎng)組H9C2細(xì)胞凋亡率均明顯增加（P均＜0.05），但較H9C2單獨(dú)培養(yǎng)組細(xì)胞凋亡率下降（P＜0.05）。見(jiàn)圖7。

圖5 各組MSCs中HGF的表達(dá)

圖6 各組MSCs中TGF-β1的表達(dá)

圖7 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組H9C2細(xì)胞的凋亡率

3 討論

MSCs作為一種多功能分化的干細(xì)胞，已被廣泛應(yīng)用于心臟疾病的治療。近年來(lái)，旁分泌機(jī)制在其中的作用越來(lái)越受到重視。已發(fā)現(xiàn)的MSCs旁分泌細(xì)胞因子有40余種，其可能作用機(jī)制包括血管生成、抑制心肌細(xì)胞的凋亡、抑制炎性反應(yīng)等［6］。

然而，大多研究都是針對(duì)單個(gè)因子的作用機(jī)制，在旁分泌細(xì)胞因子的微環(huán)境中，各因子間是否存在著相互作用呢？Kelly等［7］研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤壞死因子受體1（tumor necrosis factor receptor type 1，TNFR1）通過(guò)減少M(fèi)SCs的旁分泌途徑而削弱MSCs對(duì)心肌細(xì)胞的保護(hù)作用。Jayasankar等［8］研究表明，HGF可通過(guò)促進(jìn)新生血管的生成和抑制心肌細(xì)胞的凋亡對(duì)心肌梗死后的心臟起修復(fù)作用。

我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染HGF-siRNA的MSCs中HGF的表達(dá)量較未轉(zhuǎn)染組及陰性對(duì)照組均明顯下降，表明轉(zhuǎn)染模型構(gòu)建成功。在HGF表達(dá)量減少的同時(shí)，發(fā)現(xiàn)TGF-β1的表達(dá)量與HGF呈相反趨勢(shì)。這一結(jié)果表明，MSCs旁分泌因子HGF對(duì)TGF-β1有抑制作用。

此外，本實(shí)驗(yàn)采用Millicell裝置建立MSCs與多柔比星損傷的H9C2細(xì)胞的非直接接觸式共培養(yǎng)體系，保證MSCs旁分泌的各種細(xì)胞因子可以對(duì)H9C2細(xì)胞產(chǎn)生生物學(xué)影響。共培養(yǎng)24 h后采用流式細(xì)胞術(shù)AnnexinⅤ／PI雙染法檢測(cè)H9C2細(xì)胞凋亡率。結(jié)果顯示，與HGF-siRNA-MSCs共培養(yǎng)24 h后，H9C2細(xì)胞凋亡率較與未轉(zhuǎn)染的MSCs共培養(yǎng)組及NC-siRNA-MSCs共培養(yǎng)組H9C2細(xì)胞凋亡率明顯增加（P＜0.05），但較H9C2單獨(dú)培養(yǎng)組細(xì)胞凋亡率下降（P＜0.05）。這一結(jié)果證實(shí)了MSCs旁分泌HGF抑制多柔比星誘導(dǎo)的H9C2細(xì)胞凋亡作用的機(jī)制不僅與HGF本身對(duì)細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用有關(guān)，還與其對(duì)TGF-β1的抑制作用密切相關(guān)。

綜上所述，MSCs旁分泌作用對(duì)多柔比星誘導(dǎo)的H9C2細(xì)胞損傷的修復(fù)作用除了眾多對(duì)細(xì)胞有保護(hù)作用的旁分泌因子外，細(xì)胞因子間的相互作用在其中也起到了至關(guān)重要的作用。這一實(shí)驗(yàn)結(jié)果啟迪我們，在研究MSCs旁分泌機(jī)制時(shí)，應(yīng)將所形成的修復(fù)微環(huán)境看作一個(gè)整體，既研究各個(gè)旁分泌因子的單獨(dú)作用機(jī)制，也要注意發(fā)現(xiàn)因子間的相互作用，這樣才能更透徹地了解其機(jī)制，從而可通過(guò)抑制或促進(jìn)某些旁分泌因子的表達(dá)而減少副效應(yīng)、提高移植安全性，使旁分泌的微環(huán)境能極大地發(fā)揮對(duì)心肌細(xì)胞的修復(fù)作用。

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Effect of hepatocyte grow th factor on doxorubicin-induced H9C2 cells apoptosis

LIU Ling-ling，ZHAO Long，LIXiao-li，ZHANG Ying-yu，WANG Hao，ZHOU Yan-fang，ZHANGGuo-hui
（Department of Cardiology，the Affiliated People′s Hospital of Jiangsu University，Zhenjiang Jiangsu 212002，China）

Objective：To investigate the effect of hepatocyte growth factor（HGF）on doxorubicin（DOX）-induced H9C2 cells apoptosis.M ethods：The third generation ofmesenchymal stem cells（MSCs）were divided into three groups：cultured alone，HGF-siRNA-MSCs and NC-siRNA-MSCs.The concentration of HGF and transforming growth factorβ1（TGF-β1）weremeasured with both ELISA and Western-blot kit.H9C2 cellswere exposed to 1.0μmol／L doxorubicin for 4 hours.Then they were divided into four groups：cultured alone，co-cultured with MSCs，co-cultured with HGF-siRNA-MSCs and co-cultured with NC-siRNAMSCs.After 24 hours，the apoptosis rate was determined by flow cytometry（FCM）.Results：Compared with other groups，the concentration of TGF-β1in MSCs were significantly increased in the HGF-siRNAMSCs［（519.23±24.34）pg／mL］than cultured alone［（459.65±11.78）pg／mL］and NC-siRNA-MSCs［（459.33±11.78）pg／mL，P＜0.05］.The apoptosis rate of H9C2 cells was increased significantly in cocultured with HGF-siRNA-MSCs（18.54±0.64）%than co-cultured with MSCs（6.65±0.49）%and NC-siRNA-MSCs［（9.70±1.62）%，P＜0.05］.Conclusion：HGF prevented DOX-induced H9C2 cells apoptosis by inhibition of TGF-β1.

mesenchymal stem cells；paracrine；hepatocyte growth factor；transforming growth factor β1；apoptosis；doxorubicin

R329.2

A

1671－7783（2014）03－0221－05

10.13312／j.issn.1671-7783.y140033

劉玲玲（1988—），女，碩士研究生；張國(guó)輝（通訊作者），主任醫(yī)師，碩士生導(dǎo)師，E-mail：13338812776＠189.cn

2014－02－20 ［編輯］陳海林