晚期糖基化終產物誘導人主動脈內皮細胞氧化應激損傷及線粒體功能紊亂

丁銀慧，孫競，錢元霞，李蕓子，高靜，陳赟

（1.江蘇大學藥學院，江蘇鎮(zhèn)江212013；2.南京大學醫(yī)學院附屬鼓樓醫(yī)院泌尿外科，江蘇南京210008）

晚期糖基化終產物誘導人主動脈內皮細胞氧化應激損傷及線粒體功能紊亂

丁銀慧1，孫競1，錢元霞1，李蕓子1，高靜1，陳赟2

（1.江蘇大學藥學院，江蘇鎮(zhèn)江212013；2.南京大學醫(yī)學院附屬鼓樓醫(yī)院泌尿外科，江蘇南京210008）

目的：觀察晚期糖基化終產物（advanced glycation end products，AGEs）對內皮細胞氧化應激水平和線粒體功能的影響，以探討糖尿病血管內皮細胞功能障礙可能的發(fā)生機制。方法：以不同質量濃度（50，100μg／mL）的AGE修飾的牛血清白蛋白（AGE-bovine serum albumin，AGE-BSA）作用于人主動脈內皮細胞（human aortic endothelial cells，HAECs）48 h，CCK-8法測定HAECs的增殖能力，黃嘌呤氧化酶法測定超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活力，應用DCFH-DA探針檢測細胞內活性氧（reactive oxygen species，ROS）的水平；JC-1法檢測線粒體膜電位（mitochondrialmembrane potential，MMP），熒光素熒光素酶法和Clark氧電極法測定細胞中ATP含量及細胞耗氧率。結果：AGE-BSA能顯著性地抑制HAECs增殖，增加細胞內ROS水平，降低SOD活力，且高質量濃度作用更加明顯。同時，AGE-BSA還能使MMP下降、ATP生成及耗氧減少。結論：AGE-BSA誘導HAECs產生氧化應激損傷，其機制與其造成線粒體功能紊亂相關。

晚期糖基化終產物；氧化應激；線粒體；人主動脈內皮細胞

糖尿病是威脅人類健康的主要疾病之一，其慢性并發(fā)癥可涉及全身所有組織和器官，其中血管（包括大血管和微血管）病變和神經(jīng)病變表現(xiàn)最為明顯和突出。研究顯示，糖尿病患者體內存在的氧化應激狀態(tài)使其發(fā)生血管病變的概率大大提高，高血糖可促使內皮細胞內活性氧（reactive oxygen species，ROS）產生增加而導致最后的功能障礙，而內皮功能障礙是糖尿病血管病變發(fā)生的始動環(huán)節(jié)。近來晚期糖基化終產物（advanced glycation end products，AGEs）在多種糖尿病并發(fā)癥中的病理生物學作用已成為研究的熱點，AGEs的蓄積被認為是糖尿病患者發(fā)生內皮功能障礙的原因之一。研究表明，糖尿病患者血漿中AGEs蓄積水平明顯增高，且隨著病程的延長AGEs濃度也逐漸增加［1］，其通過促進ROS的生成、基底膜與胞質交流及通過與AGEs受體（RAGE）的作用調節(jié)各種細胞信號傳導，加快糖尿病患者微血管和大血管的損傷［2－4］。線粒體是真核細胞中重要的細胞器之一，是細胞的“能量工廠”。此外，線粒體也是內源性ROS的主要來源，電子傳遞過程中有2%的O2和漏電子相結合，形成氧自由基，而線粒體又對氧化應激有高敏感性，可造成線粒體DNA的不穩(wěn)定和突變，最終造成能量調節(jié)過程受損［5］。在糖尿病進程中，線粒體產生了過多的ROS，使細胞處于氧化應激狀態(tài)。

本研究以人主動脈內皮細胞（human aortic endothelial cells，HAECs）為研究對象，觀察AGEs對血管內皮細胞氧化應激水平和線粒體功能的影響，探討糖尿病血管內皮功能障礙可能的機制。

1 材料與方法

1.1 主要儀器及試劑

Heraeus CO2孵箱；Nikon eclipse TS100倒置式顯微鏡；Nikon Ti-E活細胞熒光工作站；SpectraMax 190酶標儀；Spectra MaxGemini熒光酶標儀；化學發(fā)光酶標儀；Oxygrtherm Clark氧電極。

AGE修飾的牛血清白蛋白（AGE-BSA）（美國Biovision公司）；F12培養(yǎng)基、胎牛血清（美國Gibco公司）；0.25%胰酶（美國Amresco公司）；CCK-8試劑及ATP檢測試劑盒、DCFH-DA活性氧檢測試劑盒（南通碧云天生物技術有限公司）；JC-1（美國Molecular Probes公司）；總超氧化物歧化酶（T-SOD）測試盒及考馬斯亮藍蛋白定量試劑盒（南京建成生物工程研究所）；其余未特殊注明的試劑均為國產分析純。

1.2 細胞株及培養(yǎng)

HAECs（由南京鼓樓醫(yī)院周六化老師惠贈）用含10%胎牛血清F12培養(yǎng)基在37℃、5%CO2及飽和濕度的孵箱中培養(yǎng)。

1.3 CCK-8法檢測細胞活力

取對數(shù)生長期HAECs，消化、計數(shù)，以3×104個／mL的密度接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔100μL。培養(yǎng)24 h后加入不同質量濃度的AGE-BSA（50，100 μg／mL），對照組加入等體積的含10%胎牛血清DMEM，作用48 h后，每孔加入10μL CCK-8，繼續(xù)培養(yǎng)2 h，用酶標儀在450 nm處測定光密度（D）值。

1.4 細胞中SOD活力的測定

細胞中SOD活力的測定，嚴格按照SOD測定試劑盒說明書進行。

1.5 DCFH-DA熒光探針檢測細胞內ROS水平

各組按要求處理結束后吸去培養(yǎng)基，PBS洗1次，加入無血清培養(yǎng)基稀釋的DCFH-DA溶液，使其終濃度為10μmol／L，37℃孵育30 min，然后PBS洗2次，在熒光顯微鏡下觀察或使用熒光酶標儀檢測熒光強度。

1.6 JC-1染色檢測線粒體膜電位

各組按要求處理結束后吸去培養(yǎng)基，加入5μg／mL的JC-1，37℃孵育30 min，然后PBS洗2次，在熒光顯微鏡下觀察或使用熒光酶標儀檢測熒光強度。

1.7 熒光素熒光素酶法檢測ATP的生成

用6孔板接種HAECs，各組按要求處理結束后吸去培養(yǎng)基，用PBS洗2次，經(jīng)ATP裂解液裂解，4℃12 000×g離心10 min，取上清。取96孔化學發(fā)光專用培養(yǎng)板，每孔加入100μL ATP檢測試劑，反應2 min，扣除本底后每孔加入相同體積的樣本，用化學發(fā)光酶標儀檢測熒光強度，計算樣本中ATP的濃度。將樣本進行蛋白含量測定，計算每毫克蛋白ATP的量。

1.8 Clark氧電極法檢測細胞耗氧率

用6孔板接種HAECs，各組按要求處理結束后吸去培養(yǎng)基，收集細胞于離心管中，用氧電極檢測每組細胞的耗氧率［nmol／（min·mL）］。最后對每組細胞計數(shù)，根據(jù)耗氧率及細胞密度計算每組細胞的耗氧率［nmol O2／（min·104細胞）］。

1.9 統(tǒng)計方法

2 結果

2.1 AGE-BSA對HAECs細胞增殖活性的影響

與對照組相比，50μg／mL和100μg／mL的AGE-BSA能顯著降低細胞活性（P＜0.05），且AGE-BSA高濃度組較低濃度組細胞活性也有顯著下降（P＜0.05），隨著AGE-BSA濃度增加細胞增殖活性不斷下降（圖1）。形態(tài)學觀察結果顯示，隨著AGE-BSA濃度的增加，AGE-BSA處理組細胞數(shù)目減少，胞體形態(tài)不如對照組飽滿，且變圓脫壁的細胞也有所增加（圖2）。

圖1 AGE-BSA對HAECs增殖活性的影響

圖2 AGE-BSA對HAECs形態(tài)的影響（200×）

2.2 AGE-BSA對HAECs中SOD活力的影響

SOD活力測定結果表明，與對照組相比，AGEBSA處理組的SOD活力顯著下降（P＜0.05），且AGE-BSA高濃度組較低濃度組SOD活力也有顯著下降（P＜0.05）（圖3）。

圖3 AGE-BSA誘導HAECs中SOD活力下降

2.3 AGE-BSA對HAECs中ROS水平的影響

DCFH-DA熒光探針檢測結果表明，與對照組相比，AGE-BSA（50，100μg／mL）作用于HAECs時，細胞中ROS含量顯著增加（P＜0.05）（圖4）；如圖5所示，與對照組相比，AGE-BSA處理組的細胞中綠色熒光明顯較強，與定量結果相一致。

圖4 AGE-BSA對HAECs中ROS含量的影響

圖5 DCFH-DA染色后拍攝熒光照片（400×）

2.4 AGE-BSA對HAECs線粒體功能的影響

2.4.1 AGE-BSA對線粒體膜電位的影響 JC-1染色檢測線粒體膜電位結果表明，與對照組相比，50 μg／mL和100μg／mL AGE-BSA能顯著降低細胞中線粒體膜電位（P＜0.05）（圖6）；如圖7所示，AGE-BSA組的線粒體膜電位明顯低于對照組，表明AGE-BSA作用后線粒體膜電位降低，與定量結果相一致。

圖6 AGE-BSA誘導HAECs中JC-1的紅／綠熒光比值下降

圖7 JC-1染色后拍攝熒光照片（200×）

2.4.2 AGE-BSA對ATP含量及耗氧率的影響 熒光素 熒光素酶法檢測ATP含量結果顯示，與對照組相比，AGE-BSA能顯著降低細胞ATP水平（P＜0.05），且100μg／mL AGE-BSA組較50μg／mL AGE-BSA組ATP水平有顯著下降（P＜0.05）（圖8）。測定耗氧率結果表明，與對照組相比，50μg／mL和100μg／mL AGE-BSA均顯著降低細胞的耗氧率（P＜0.05），且隨著AGE-BSA質量濃度的增高，細胞耗氧率呈不斷下降的趨勢（P＜0.05）（圖9）。

圖8 AGE-BSA誘導HAECs中ATP水平下降

圖9 AGE-BSA誘導HAECs耗氧率下降

3 討論

糖尿病血管內皮功能障礙是糖尿病血管病變發(fā)生的始動環(huán)節(jié)，大量研究表明，AGEs與RAGE的相互作用在糖尿病血管內皮功能障礙中發(fā)揮著重要作用。但AGEs引起血管內皮細胞功能紊亂的機制仍不甚完善。有文獻報道AGEs能引起胰島β細胞氧化應激損傷，同時能降低細胞抗氧化能力［6－7］；另有文獻報道AGEs也能導致內皮細胞中ROS的升高從而導致功能障礙［8－10］；本實驗室前期研究也發(fā)現(xiàn)，動脈粥樣硬化大鼠血管發(fā)生重構，總SOD和Mn-SOD活力下降［11］。本實驗結果表明AGE-BSA可以引起HAECs增殖活性下降，并且使得SOD活力下降及ROS水平的升高，與既往研究結果相一致。研究發(fā)現(xiàn)氧化應激已成為糖尿病并發(fā)癥發(fā)生和發(fā)展的一個重要的致病因子［12－13］。大量動物實驗表明通過添加抗氧化劑或過表達SOD或過氧化氫酶能夠預防組織細胞的病變，間接證明了ROS在糖尿病并發(fā)癥的發(fā)生中起著重要作用［14－16］。而線粒體是ROS的主要來源，當內皮細胞線粒體電子傳遞鏈被中斷時，高糖誘導內皮細胞ROS增加受阻［17］。Giacco等［13］研究認為高糖誘導超氧化物產生，隨后刺激其他途徑產生更多超氧化物發(fā)揮更強的損傷作用，同時線粒體功能也不斷受損，使機體陷入氧化損傷的漩渦中，在這整個過程中線粒體都是必不可少的。本實驗結果表明AGE-BSA能夠使HAECs線粒體的膜電位及細胞耗氧能力下降，也使得ATP產生明顯減少，說明AGE-BSA作用能夠使線粒體功能發(fā)生紊亂。由于線粒體膜電位的降低是細胞發(fā)生凋亡的標志事件［18］，一旦線粒體跨膜電位崩潰，則細胞凋亡不可逆轉，因此，推斷AGE-BSA可能通過線粒體途徑引起內皮細胞凋亡，具體機制還需要作進一步研究。有文獻提出，氧化損傷、ATP合成缺陷和鈣離子失調往往一起發(fā)生，并且其中某一種情況的出現(xiàn)都會導致其他兩種情況的發(fā)生，然后形成一個惡性循環(huán)，最后通過誘導線粒體通透性孔道的開放，導致線粒體的失能［19］。本實驗的結果說明AGE-BSA使HAECs發(fā)生氧化應激損傷，導致線粒體功能紊亂，最終導致內皮功能障礙。綜上所述，AGE-BSA能夠使HAECs產生氧化應激損傷，并使得HAECs線粒體功能受損，說明AGE-BSA損傷細胞過程中線粒體起著重要作用，提示通過保護線粒體對抗高血糖引起的內皮細胞損傷可能是治療糖尿病血管內皮細胞功能障礙的有效手段。

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Advanced glycation end products induce oxidative stress and m itochondrial dysfunction in human aortic endothelial cells

DING Yin-hui1，SUN Jing1，QIAN Yuan-xia1，LIYun-zi1，GAO Jing1，CHEN Yun2
（1.School of Pharmacy，Jiangsu University，Zhenjiang Jiangsu 212013；2.Department of Urology，Affiliated Drum Tower Hospital，School of Medicine，Nanjing University，Nanjing Jiangsu 210008，China）

Objective：To investigate whether advanced glycation end products（AGEs）can induce cell injury and mitochondrial dysfunction in human aortic endothelial cells（HAECs）.M ethods：HAECs were treated with increasing concentrations（50，100μg／mL）of AGE-bovine serum albumin（AGE-BSA）for 48 h.The proliferative inhibition of HAECswasmeasured by CCK-8 method.Contents of ATP and activity of superoxide dismutase（SOD）were determined by the luciferase assay and SOD kits.Reactive oxygen species（ROS）were determined by DCFH-DA staining.Mitochondrial membrane potential（MMP）was observed with JC-1 staining.Oxygen utilization wasmeasured polarographically with a Clark oxygen electrode.Results：Compared with control group，AGE-BSA（50，100μg／mL）significantly reduced HAECs proliferation.AGE-BSA significantly increased the levels of ROS，while decreased the activity of SOD compared to the control group.Importantly，AGE-BSA-mediated oxidative stresswas followed by a collapse ofmitochondrialmembrane potential（MMP），the inhibition of ATP generation，and the down-regulation of oxygen utilization.Conclusion：AGE-BSA induced oxidative stress in HAECs.Moreover，AGE-BSA-induced HAECs injury was related tomitochondrial dysfunction.

advanced glycation end products（AGEs）；oxidative stress；mitochondria；human aortic endothelial cells

丁銀慧（1989—），女，碩士研究生；孫競（共同第一作者），男，博士，E-mail：sjyancheng＠aliyun.com；陳赟（通訊作者），主任醫(yī)師，博士，E-mail：chenyunnju＠hotmail.com；高靜（共同通訊作者），教授，博士生導師，E-mail：jinggao＠ujs.edu.cn

R365.587

A

1671－7783（2014）03－0185－05

10.13312／j.issn.1671-7783.y140004

國家自然科學基金資助項目（81270694）

2014－01－16 ［編輯］ 何承志