循環(huán)miRNA檢測(cè)在診斷急性冠脈綜合征中的意義

許浩軍，顧明，于宗良，谷惠敏，王炳芳

（江蘇大學(xué)附屬昆山醫(yī)院心內(nèi)科，江蘇昆山215300）

循環(huán)miRNA檢測(cè)在診斷急性冠脈綜合征中的意義

許浩軍，顧明，于宗良，谷惠敏，王炳芳

（江蘇大學(xué)附屬昆山醫(yī)院心內(nèi)科，江蘇昆山215300）

目的：探討循環(huán)miRNA檢測(cè)在診斷急性冠脈綜合征（ACS）中的意義。方法：選擇100例ACS患者為研究組，匹配冠脈造影正常者100例為對(duì)照組，研究組再分為不穩(wěn)定性心絞痛（UAP）組（n＝32）和急性心肌梗死（AMI）組（n＝68）。采用qRT-PCR方法檢測(cè)血清miR-1，miR-133a，miR-208b，miR-499。結(jié)果：AMI患者的血清miR-1，miR-133a，miR-208b，miR-499水平較對(duì)照組顯著增高，分別上調(diào)了4.15，4.46，7.95，6.62倍，UAP組較對(duì)照組也顯著上升，分別上調(diào)了1.62，1.98，2.32，2.98倍，P均＜0.05。4種miRNA在AMI患者中的變化曲線均表現(xiàn)為發(fā)病時(shí)顯著升高，發(fā)病后6 h最高，發(fā)病后24 h，72 h顯著下降，并接近正常水平。miR-1，miR-133a，miR-208b，miR-499對(duì)AMI患者診斷的ROC曲線下面積分別為0.68，0.75，0.80，0.73，介于肌酸激酶同工酶和肌鈣蛋白T之間。結(jié)論：循環(huán)特異性miRNA的水平升高可用于輔助診斷ACS。

急性冠脈綜合征；miRNA；診斷

心血管疾病是威脅人類(lèi)健康的重要疾病之一，其中急性冠脈綜合征（ACS）是導(dǎo)致人類(lèi)死亡的主要疾病。因此，早期、及時(shí)、準(zhǔn)確的診斷及估計(jì)病情是積極采取有效的治療措施并減少死亡率的必要條件［1］。生物標(biāo)志物是輔助診斷ACS的重要工具。美國(guó)心臟病學(xué)會(huì)（ACC）與美國(guó)心臟病協(xié)會(huì)（AHA）在相關(guān)治療指南［2］中推薦ACS患者在癥狀出現(xiàn)后6 h內(nèi)檢查心肌生化標(biāo)志物，如肌酸激酶同工酶（CK-MB）、肌紅蛋白和肌鈣蛋白（cTn）等。上述標(biāo)志物雖已在ACS患者早期診斷的敏感性及特異性上達(dá)到一定水平，但研究者們對(duì)高敏感性及特異性的新血清標(biāo)志物的研究仍在繼續(xù)，尤其是針對(duì)能反應(yīng)ACS患者預(yù)后的良好血清標(biāo)志物。近10年來(lái)新發(fā)現(xiàn)的非編碼RNA——MicroRNA（miRNA）與各種疾病的發(fā)生和發(fā)展及預(yù)后有緊密聯(lián)系。miRNA的表達(dá)不僅具有較好的組織特異性，且在血液中具有較高的穩(wěn)定性，并已發(fā)現(xiàn)miRNA與心肌梗死的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)，例如miR-1、miR-133、miR-208、miR-499等［3］，因此心肌特異性miRNA可能成為一種理想的生物學(xué)標(biāo)志物用于ACS的早期診斷及判斷預(yù)后。因此，本研究將分析ACS相關(guān)的循環(huán)miRNA，探討其與不同類(lèi)型ACS患者的關(guān)系，為ACS的診斷治療提供幫助。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象

選擇2012年2月至2013年2月于本院就診的ACS患者100例為研究組，匹配冠脈造影正常者100例為對(duì)照組。研究組納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）年齡≥18歲且≤75歲。（2）ACS診斷符合2007年美國(guó)心臟病學(xué)會(huì)（ACC）和美國(guó)心臟協(xié)會(huì)（AHA）頒布的指南［2］，依據(jù)臨床表現(xiàn)（心絞痛發(fā)作表現(xiàn)、心電圖異常）及冠脈造影結(jié)果。（3）心肌梗死患者參照2007年心肌梗死診斷指南，心臟生物標(biāo)志物水平升高超過(guò)參考值上限99百分位值，同時(shí)至少伴有下述心肌缺血證據(jù)之一：①缺血癥狀；②心電圖提示新發(fā)缺血性改變；③影像學(xué)證據(jù)提示新發(fā)局部室壁運(yùn)動(dòng)異?；虼婊钚募G失。對(duì)照組納入標(biāo)準(zhǔn)：無(wú)心血管病史，心電圖、胸片、肝腎功能、生化常規(guī)檢查正常，排除合并感染、腫瘤等。排除標(biāo)準(zhǔn)：ACS患者并發(fā)其他臟器功能衰竭或嚴(yán)重病變（如肺癌、肝腎功能衰竭等）及過(guò)敏性疾病和自身免疫性疾病的患者除外。研究組男63例，女37例，平均年齡（46.43± 4.90）歲，對(duì)照組男62例，女38例，平均年齡（45.45 ±5.12）歲，兩組年齡、性別分布差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，具有可比性。根據(jù)上述診斷標(biāo)準(zhǔn)將ACS組分為2個(gè)亞組：不穩(wěn)定性心絞痛（UAP）組（n＝32）和急性心肌梗死（AMI）組（n＝68）。

1.2 樣本收集和處理

UAP患者，采集隨機(jī)靜脈全血5 mL；AMI患者，及時(shí)采集入院后即刻、心肌梗死后6，24，72 h靜脈全血5 mL，并記錄血清肌鈣蛋白T（cTnT）、CK-MB水平。抽取的外周靜脈血置于不含抗凝劑的試管中，靜置30min，室溫3 000 r／min離心10 min，提取上清分裝到去RNA酶的EP管中，再以12 000 r／min離心10 min，取上層血清每300μL分裝至去RNA酶的EP管中，最后放置到－80℃低溫冰箱中保存待用。

1.3 miRNA的檢測(cè)

1.3.1 RNA提取及質(zhì)檢 依照miRNA提取試劑盒（Tiangen公司）說(shuō)明，分別提取所有患者及對(duì)照血清樣本中RNA，用于檢測(cè)血清miR-1，miR-133a，miR-208b、miR-499水平，用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)樣品的純度和濃度，瓊脂糖凝膠電泳分析提取質(zhì)量。

1.3.2 反轉(zhuǎn)錄反應(yīng) 配置反應(yīng)液的過(guò)程在冰上進(jìn)行，嚴(yán)格依據(jù)TaqManmicroRNA Assays（美國(guó)Applied Biosystems公司）說(shuō)明書(shū)操作，將樣品RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA（其中引物及探針序列由Applied Biosystems提供）。反應(yīng)體系中試劑包括100 mmol／L dNTPs 0.15μL、MutiScribe逆轉(zhuǎn)錄酶（50 U／μL）1.0μL、10×反轉(zhuǎn)錄緩沖液1.5μL、RNA酶抑制劑（20 U／μL）0.19μL、無(wú)核酸酶水4.16μL、反轉(zhuǎn)錄引物3μL及RNA 5μL。

1.3.3 PCR反應(yīng) 以cDNA為模板，使用TaqMan microRNA Assays中的PCR引物探針混合液進(jìn)行PCR擴(kuò)增及熒光定量檢測(cè)，反應(yīng)體系包括TaqMan 2 ×通用的PCR擴(kuò)增預(yù)混試劑10μL、無(wú)核酸酶水7.67μL、PCR引物（20×）1.0μL及反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物（1∶15）1.33μL，共40個(gè)循環(huán)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。反應(yīng)結(jié)束后分析PCR反應(yīng)曲線，得到Ct值，即熒光達(dá)到閾值所需的PCR循環(huán)數(shù)。依據(jù)2－ΔΔCt法，計(jì)算每個(gè)患者miRNA水平的比例，以倍數(shù)表示。

1.4 統(tǒng)計(jì)方法

采用SPSS14.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，所有資料均采用中位數(shù)與四分位數(shù)間距（P25～P75）表示，計(jì)量資料之間的比較均采用秩和檢驗(yàn)，以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 UAP、AMI患者發(fā)病時(shí)miRNA比較

圖1為miR-1，miR-133a，miR-208b，miR-499在3組患者的血清水平比較。結(jié)果表明，AMI患者4種miRNA較對(duì)照組顯著增高，分別上調(diào)了4.15，4.46，7.95，6.62倍（中位數(shù)，下同），UAP組較對(duì)照組也顯著上調(diào)，分別上調(diào)了1.62，1.98，2.32，2.98倍，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.2 miRNA在AMI發(fā)病時(shí)的變化及其與cTnT的診斷效能的比較

圖2統(tǒng)計(jì)分析了miR-1，miR-133a，miR-208b，miR-499在AMI患者發(fā)病后血清水平的變化情況，4種miRNA均表現(xiàn)為發(fā)病時(shí)顯著提升，發(fā)病后6 h最高，發(fā)病后24，72 h顯著下降，并已接近正常水平。

表1統(tǒng)計(jì)并計(jì)算了miR-1，miR-133a，miR-208b，miR-499對(duì)AMI患者診斷的ROC曲線下面積，分別為0.68，0.75，0.80，0.73。而cTnT用于AMI診斷的ROC曲線下面積為0.83，CK-MB為0.65，可見(jiàn)miR-1，miR-133a，miR-208b，miR-499用于診斷AMI的診斷效能介于CK-MB和cTnT之間。

圖1 各組患者發(fā)病時(shí)血清m iRNA水平比較

圖2 AM I患者血清m iRNA水平的變化

表1 m iR-1、m iR-133a、m iR-208b和m iR-499對(duì)AM I患者的診斷效能

3 討論

近年來(lái)，生物標(biāo)志物對(duì)ACS等心血管疾病的早期診斷、治療以及預(yù)后的判定、降低疾病死亡率起到了關(guān)鍵性的作用［4］。并且，臨床醫(yī)生合理選擇理想的生物標(biāo)志物對(duì)ACS的早期診斷、治療以及預(yù)后判斷等同樣也起到關(guān)鍵作用［5］。

miRNA是一段長(zhǎng)18～23個(gè)核苷酸的非編碼RNA，具有負(fù)性調(diào)節(jié)基因表達(dá)的作用，有效地調(diào)控轉(zhuǎn)錄后翻譯的效率以及靶mRNA的穩(wěn)定性，在轉(zhuǎn)錄后水平沉默特定基因從而對(duì)基因表達(dá)起到精細(xì)調(diào)節(jié)的作用，調(diào)控細(xì)胞的生長(zhǎng)、發(fā)育、分化和凋亡［6］。miRNA是許多重要生物過(guò)程的重要調(diào)節(jié)因子，在多種心血管疾病的發(fā)生發(fā)展中起重要作用。miRNA還存在于人循環(huán)血中，逐漸成為多種疾病的生物標(biāo)志物。細(xì)胞內(nèi)的miRNA主要通過(guò)兩種途徑進(jìn)入循環(huán)系統(tǒng)，形成循環(huán)miRNA。第一種是從破裂細(xì)胞被動(dòng)滲漏，如心肌梗死。第二種是源自細(xì)胞的微囊泡主動(dòng)分泌。微囊泡可能是運(yùn)輸循環(huán)miRNA的主要載體，細(xì)胞內(nèi)miRNA先被裝入分泌囊泡中，然后伴隨囊泡的分泌進(jìn)入血液循環(huán)。由于循環(huán)miRNA存在于微囊泡的內(nèi)部，避免了RNA酶的降解，因而具備一定的穩(wěn)定性。并且循環(huán)miRNA能抵抗各種惡劣條件，包括煮沸、低或高pH值、延長(zhǎng)貯存、凍融循環(huán)等［7］，因此，隨著商品化的試劑盒的應(yīng)用，循環(huán)miRNA的檢測(cè)已十分可靠，可作為疾病的血清標(biāo)志物。近年來(lái)已有大量研究表明循環(huán)miRNA與腫瘤、心血管疾病有關(guān)［8－9］，并已發(fā)現(xiàn)miRNA與心肌梗死有關(guān)，例如miR-1、miR-208、miR-499。Ai等［10］對(duì)心肌梗死患者采用實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)血漿miR-1水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-1在心肌梗死急性期顯著升高，2周后下降至基礎(chǔ)水平。Wang等［11］對(duì)AMI患者和AMI模型大鼠心肌內(nèi)miRNA的表達(dá)規(guī)律分析后發(fā)現(xiàn)，miR-208具備心臟特異性，在AMI時(shí)明顯升高，但在正常心肌中無(wú)表達(dá)。最新研究發(fā)現(xiàn)［12－13］，miR-499在AMI后表達(dá)升高。D′Alessandra等［14］研究發(fā)現(xiàn)，miR-1，miR-133a，miR-133b和miR-499在心肌梗死患者及小鼠模型中顯著增高，時(shí)間變化曲線與cTnI波動(dòng)基本一致，即心肌梗死后數(shù)倍增高，24～48 h即可恢復(fù)正常。Corsten等［13］研究表明，miR-499與mir-208b在急性心肌梗死患者中較對(duì)照組顯著上升，上升幅度與cTnI和肌酸磷酸激酶明顯相關(guān)。本研究結(jié)果表明，AMI患者miR-1，miR-133a，miR-208b，miR-499的血清水平較對(duì)照組顯著增高，分別上調(diào)了4.15，4.46，7.95，6.62倍，變化曲線均表現(xiàn)為發(fā)病后6 h最高，發(fā)病后24 h，72 h顯著下降，并接近正常水平。miR-1，miR-133a，miR-208b，miR-499對(duì)AMI患者診斷的ROC曲線下面積分別為0.68，0.75，0.80，0.73，用cTnT診斷AMI的ROC曲線下面積為0.83，而CK-MB為0.65，可見(jiàn)4種miRNA用于診斷AMI的效能均能高于CK-MB，但仍然不及cTnT，進(jìn)一步研究可通過(guò)多個(gè)miRNA聯(lián)合診斷的方法提升診斷效率。

目前對(duì)ACS，尤其UAP中循環(huán)miRNA的研究才剛開(kāi)始，許多結(jié)論尚有待進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量進(jìn)行深入探討，本研究結(jié)果初步表明循環(huán)miRNA的表達(dá)量對(duì)ACS的診斷具有一定的價(jià)值。

［1］Becker D，Merkely B.Acute coronary syndrome—2012［J］.Orv Hetil，2012，153（51）：2009－2015.

［2］Anderson JL，Adams CD，Antman EM，et al.ACC／AHA 2007 guidelines for the management of patients with unstable angina／non-ST-Elevation myocardial infarction：a reportof the American College of Cardiology／American Heart Association Task Force on Practice Guidelines（Writing Committee to Revise the 2002 Guidelines for the Managementof PatientsWith Unstable Angina／Non-ST-Elevation Myocardial Infarction）developed in collaboration with the American College of E-mergency Physicians，the Society for Cardiovascular Angiography and Interventions，and the Society of Thoracic Surgeons endorsed by the American Association of Cardiovascular and Pulmonary Rehabilitation and the Society for Academic Emergency Medicine［J］.JAm Coll Cardiol，2007，50（7）：e1－e157.

［3］Matusik P，Guzik B，Weber C，et al.Do we know enough about the immune pathogenesis of acute coronary syndromes to improve clinical practice？［J］.Thromb Haemost，2012，108（3）：443－456.

［4］Crea F，Liuzzo G.Pathogenesis of acute coronary syndromes［J］.JAm Coll Cardiol，2013，61（1）：1－11.

［5］Ramasamy I.Biochemical markers in acute coronary syndrome［J］.Clin Chim Acta，2011，412（15／16）：1279－1296.

［6］Lindahl B.Acute coronary syndrome-the present and future role of biomarkers［J］.Clin Chem Lab Med，2013，23：1－8.

［7］Chen X，Ba Y，Ma L，et al.Characterization of microRNAs in serum：a novel class of biomarkers for diagnosis of cancer and other diseas［J］.Cell Res，2008，18（10）：997－1006.

［8］Allegra A，Alonci A，Campo S，et al.Circulating microRNAs：new biomarkers in diagnosis，prognosis and treatment of cancer（review）［J］.Int JOncol，2012，41（6）：1897－1912.

［9］Creemers EE，Tijsen AJ，Pinto YM.Circulating microRNAs：novel biomarkers and extracellular communicators in cardiovascular disease？［J］.Circ Res，2012，110（3）：483－495.

［10］Ai J，Zhang R，Li Y，et al.CirculatingmicroRNA-1 as a potential novel biomarker for acute myocardial infarction［J］.Biochem Biophys Res Commun，2010，391（1）：73－77.

［11］Wang GK，Zhu JQ，Zhang JT，et al.Circulating microRNA：a novel potential biomarker for early diagnosis of acutemyocardial infarction in humans［J］.Eur Heart J，2010，31（6）：659－666.

［12］Adachi T，Nakanishi M，Otsuka Y，et al.Plasma microRNA 499 as a biomarker of acute myocardial infarction［J］.Clin Chem，2010，56（7）：1183－1185.

［13］Corsten MF，Dennert R，Jochems S，et al.Circulating MicroRNA-208b and MicroRNA-499 reflect myocardial damage in cardiovascular disease［J］.Circ Cardiovasc Genet，2010，3（6）：499－506.

［14］D′Alessandra Y，Devanna P，Limana F，etal.CirculatingmicroRNAs are new and sensitive biomarkers ofmyocardial infarction［J］.Eur Heart J，2010，31（22）：2765－2773.

Circulating m iRNA detection in the diagnosis of acute coronary syndrome

XU Hao-jun，GU Ming，YU Zong-liang，GU Hui-min，WANG Bing-fang

（Department of Cardiology，Kunshan Hospital Affiliated to Jiangsu University，Kunshan Jiangsu 215300，China）

Objective：To investigate the circulatingmiRNA detection in the diagnosis of acute coronary syndrome.M ethods：A total of 100 cases of ACSwere collected for the study group，and 100 subjects of normal coronary angiography werematched for the control group.The study group was further divided into unstable angina（UAP）group（n＝32）and acutemyocardial infarction（AMI）group（n＝68）.qRT-PCR was used to detect serum miR-1，miR-133a，miR-208b，miR-499.Results：Serum miR-1，miR-133a，miR-208b，miR-499 levels in AMIpatientswere significantly higher than the control group.They were increased 4.15，4.46，7.95，6.62 fold（median，the same below）.In UAP group，they were also increased significantly，1.62，1.98，2.32，2.98 fold compared with the control group respectively（P＜0.05）.Four kinds ofmiRNA in AMIpatients showed a change curve thatwas significantly improved after the onset of incidence，highest in 6 h and after the onset of24 h，72 h，decreased significantly and closed to the normal level.The area under the ROC curve ofmiR-1，miR-133a，miR-208b，miR-499 in patients with AMI were 0.68，0.75，0.80，0.73，higher than CK-MB but lower than cTnT.Conclusion：Elevated levels of specific circulatingmiRNA can be used for the diagnosis of ACS.

acute coronary syndrome；miRNA；diagnosis

R541.4

A

1671－7783（2014）01－0059－04

10.13312／j.issn.1671-7783.y130224

許浩軍（1976—），男，江蘇昆山人，主治醫(yī)師，主要從事冠心病臨床及介入診治；王炳芳（通信作者），博士，碩士生導(dǎo)師，主任醫(yī)師，E-mail：shbingfang＠163.com

2013－10－07 ［編輯］何承志