慢性乙型肝炎患者外周血調(diào)節(jié)性B細(xì)胞與調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的表達(dá)頻率及其相關(guān)性

楊鴻林，金潔，蔣廷旺

（1.江蘇大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與醫(yī)學(xué)技術(shù)學(xué)院，江蘇鎮(zhèn)江212013；2.吳江區(qū)第一人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，江蘇蘇州215200；3.常熟市醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)所，江蘇蘇州215500）

慢性乙型肝炎患者外周血調(diào)節(jié)性B細(xì)胞與調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的表達(dá)頻率及其相關(guān)性

楊鴻林1，2，金潔1，蔣廷旺3

（1.江蘇大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與醫(yī)學(xué)技術(shù)學(xué)院，江蘇鎮(zhèn)江212013；2.吳江區(qū)第一人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，江蘇蘇州215200；3.常熟市醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)所，江蘇蘇州215500）

目的：分析慢性乙型肝炎患者外周血IL-10＋CD19＋調(diào)節(jié)性B細(xì)胞（regulatory B cells，Breg）與CD4＋CD25high調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（regulatory T cells，Treg）的比例及兩者的相互作用。方法：收集急性乙肝（acute hepatitis B，AHB）患者28例，慢性乙型肝炎（chronic hepatitis B，CHB）患者31例和健康體檢者（健康組）25例。分離外周血單個(gè)核細(xì)胞（peripheral blood mononuclear cells，PBMC），經(jīng)CpG ODN 2006和佛波酯體外作用后，流式細(xì)胞術(shù)分析Breg、Treg的表達(dá)及其相關(guān)性，ELISA檢測培養(yǎng)上清IL-10水平。通過免疫磁珠剔除CD4＋CD25＋T細(xì)胞后分析Breg與Treg表達(dá)頻率間的相關(guān)性。結(jié)果：CpGODN 2006和佛波酯作用后CHB組Breg和Treg百分率較AHB組和健康組均明顯升高（Breg：P值分別為0.003和0.001；Treg：P值分別為＜0.001，0.005），AHB組和健康組間兩類細(xì)胞表達(dá)頻率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Breg：P＝0.796；Treg：P＝0.227）；Spearman相關(guān)性分析顯示CHB組Breg與Treg表達(dá)百分比存在正相關(guān)關(guān)系（r＝0.50，P＝0.004），而AHB組和健康組無此相關(guān)性（r＝－0.15，P＝0.462；r＝0.09，P＝0.669）。CHB組IL-10表達(dá)高于AHB組和健康組（Z值分別為－6.596、－6.373，P均＜0.001），AHB組和健康組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Z＝－0.952，P＝0.341）。Spearman相關(guān)性分析表明CHB組IL-10與Breg存在正相關(guān)關(guān)系（r＝3.303，P＝0.005）。CHB組患者Breg和IL-10的表達(dá)在剔除CD4＋CD25＋T細(xì)胞前后間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論：Breg和Treg在CHB患者中表達(dá)頻率升高，Breg可能通過IL-10的分泌參與慢性乙肝的免疫調(diào)節(jié)，且該作用不依賴于Treg。

調(diào)節(jié)性B細(xì)胞；慢性乙型肝炎；調(diào)節(jié)性T細(xì)胞；IL-10

乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）進(jìn)入人體后，細(xì)胞免疫應(yīng)答在病毒清除過程中發(fā)揮了重要作用。研究發(fā)現(xiàn)，HBV慢性感染患者特異性T細(xì)胞免疫應(yīng)答往往受到抑制，對(duì)病毒呈現(xiàn)免疫低反應(yīng)性，但是其確切的機(jī)制仍不清楚［1－2］。

B細(xì)胞在自身免疫病、感染、腫瘤等疾病中具有調(diào)節(jié)T細(xì)胞應(yīng)答的功能，而多項(xiàng)研究提示IL-10可能是B細(xì)胞發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用的主要介質(zhì)［3－4］。這種能夠分泌IL-10的B細(xì)胞近年來被命名為調(diào)節(jié)性B細(xì)胞（regulatory B cells，Breg）［5］。然而，Breg在HBV感染過程中的免疫調(diào)節(jié)作用目前報(bào)道較少，且機(jī)制尚不明確。本研究旨在探討B(tài)reg和調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（regulatory T cells，Treg）在慢性乙肝中的表達(dá)頻率及其相關(guān)性。

1 對(duì)象與方法

1.1 對(duì)象

急性乙型肝炎（acute hepatitis B，AHB）和慢性乙型肝炎（chronic hepatitis B，CHB）的臨床診斷參考2000年中華醫(yī)學(xué)會(huì)傳染病與寄生蟲病學(xué)分會(huì)、肝病學(xué)分會(huì)聯(lián)合修訂的《病毒性肝炎防治方案》中的急性乙肝和慢性乙肝診斷標(biāo)準(zhǔn)［6］。選擇AHB患者28例，CHB患者31例。健康對(duì)照組選擇年齡性別相匹配的健康體檢者25例。所有研究對(duì)象排除甲型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、戊型肝炎病毒和艾滋病病毒的交叉感染且無自身免疫性疾病。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

抽取患者及對(duì)照者外周血10 mL，EDTA-K3抗凝，立即用淋巴細(xì)胞分離液（上海國藥公司）分離外周血單個(gè)核細(xì)胞（peripheral blood mononuclear cells，PBMC），RPMI 1640培養(yǎng)基（10%胎牛血清，4 mmol／L谷氨酰胺，100 U／mL青霉素，100μg／mL鏈霉素）調(diào)整PBMC至1×106／mL，培養(yǎng)于24孔板中。培養(yǎng)液中加入免疫佐劑CpG ODN 2006（上海生工生物技術(shù)公司）至0.1μmol／L，作用72 h后再以5 ng／mL佛波酯（PMA）作用6 h。

1.3 流式細(xì)胞分析

收集培養(yǎng)的細(xì)胞以2 mL預(yù)冷磷酸鹽緩沖液（phosphate-buffered saline，PBS）洗滌2次。應(yīng)用以下抗體進(jìn)行胞內(nèi)和胞膜染色：IL-10-PE，CD19-APC，CD4-FITC，CD25-PE（均購自美國BD公司）。未經(jīng)刺激的細(xì)胞和同型對(duì)照用于反映染色的特異性。以FACSCalibur四色流式細(xì)胞儀及CellQuest Pro軟件（美國BD公司）獲取并分析IL-10＋CD19＋Breg和CD4＋CD25highTreg的表達(dá)頻率。

1.4 ELISA法測定PBMC培養(yǎng)上清中IL-10含量

收集PBMC細(xì)胞的培養(yǎng)上清，采用ELISA試劑盒（美國eBioscience公司）測定IL-10含量，操作按照說明書進(jìn)行。

1.5 統(tǒng)計(jì)方法

以SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，偏態(tài)分布資料用中位數(shù)和四分位數(shù)［M（P25-P75）］表示，兩組間比較采用Mann-Whitney U檢驗(yàn)。兩組連續(xù)變量間的相關(guān)性采用Spearman相關(guān)分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 IL-10＋CD19＋Breg和CD4＋CD25highTreg的表達(dá)頻率

各組患者PBMC經(jīng)CpG ODN 2006和PMA作用后，結(jié)果顯示AHB組、CHB組和健康組Breg百分率分別為10.30%（7.05%～13.30%）、14.30%（10.70%～16.70%）和10.40%（6.85%～12.60%）。其中CHB組Breg的表達(dá)明顯高于AHB組和健康組（Z值分別為3.006和3.462，P值分別為0.003和0.001）；AHB組與健康組間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Z＝0.258，P＝0.796）。見圖1。

CHB組CD4＋CD25highTreg的比例為5.80%（4.20%～9.10%），明顯高于AHB組［4.05%（2.53%～5.40%）］和健康組［4.50%（2.55%～5.50%）］（Z值分別為3.683和2.837，P值分別＜0.001和0.005）。健康組Treg比例與AHB組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Z＝1.088，P＝0.227）。見圖2。

圖1 外周血PBMC經(jīng)CpG作用后IL-10＋CD19＋B細(xì)胞占CD19＋B細(xì)胞的比例

圖2 外周血PBMC經(jīng)CpG作用后CD4＋CD25high Treg細(xì)胞占CD4＋T細(xì)胞的比例

2.2 IL-10＋CD19＋Breg與CD4＋CD25highTreg表達(dá)頻率的相關(guān)性

CpG作用后，將各組IL-10＋CD19＋Breg與CD4＋CD25highTreg的表達(dá)頻率進(jìn)行相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，CHB組Breg與Treg的表達(dá)頻率間存在顯著相關(guān)性（r＝0.50，P＝0.004），而AHB組和健康組中Breg與Treg的表達(dá)頻率則無相關(guān)性（r＝－0.15，P＝0.462；r＝0.09，P＝0.669）。見圖3。

圖3 慢性乙肝組Breg與Treg表達(dá)頻率的相關(guān)性

2.3 CHB組IL-10的表達(dá)

體外刺激后，ELISA分析PBMC細(xì)胞培養(yǎng)上清，結(jié)果發(fā)現(xiàn)AHB組、CHB組和健康組的IL-10含量分別為5.8（0～7.5）pg／mL、26.7（21.3～33.5）pg／mL、6.4（5.0～8.2）pg／mL。CHB組IL-10的表達(dá)明顯高于AHB組和健康組（Z值分別為－6.596、－6.373，P均＜0.001）。AHB組和健康組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Z＝－0.952，P＝0.341）。Spearman相關(guān)性分析表明，CHB組IL-10與Breg存在正相關(guān)關(guān)系（r＝3.303，P＝0.005），AHB組和健康組內(nèi)無此相關(guān)性（r值分別為0.296、0.158，P值分別為0.127、0.450）。

2.4 CD4＋CD25＋T細(xì)胞清除前后Breg百分率和IL-10含量的變化

通過免疫磁珠法剔除10例CHB患者PBMC中CD4＋CD25＋T細(xì)胞后，進(jìn)行同樣的體外刺激，結(jié)果如圖4所示，清除前后Breg百分率和細(xì)胞培養(yǎng)上清IL-10水平并無明顯變化（Z＝－0.038，－0.151；P＝0.970，0.880）。

圖4 慢性乙肝組Breg和IL-10表達(dá)在CD4＋CD25＋T細(xì)胞清除前后的變化

3 討論

我們分離患者PBMC并以CpG和PMA在體外活化其中的B細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)體外刺激后CHB組患者Breg比例較AHB組和健康組明顯升高。CpG ODN是TLR9的配體，可以促進(jìn)B細(xì)胞的活化和增殖，而相關(guān)研究表明CpG ODN具有促進(jìn)初始狀B細(xì)胞與HBV表位結(jié)合的潛在作用［7］。由此可見，CHB患者的IL-10＋CD19＋Breg經(jīng)體外誘導(dǎo)后相對(duì)于AHB患者和健康人增殖能力更強(qiáng)。Breg主要通過分泌IL-10對(duì)其他免疫細(xì)胞發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用，通過抑制CD4＋T細(xì)胞的增殖和IFN-γ的分泌調(diào)節(jié)T細(xì)胞免疫應(yīng)答。因此，我們分析了細(xì)胞培養(yǎng)上清中IL-10細(xì)胞因子的分泌情況，發(fā)現(xiàn)CHB患者中IL-10含量明顯升高，并且與Breg存在相關(guān)性。這說明在HBV慢性感染過程中Breg活化后能夠分泌大量IL-10參與免疫調(diào)節(jié)。CD4＋CD25＋Treg也可以分泌IL-10，在維持外周免疫耐受的過程中同樣具有重要的作用。因此，我們選擇部分CHB病例對(duì)其PBMC中CD4＋CD25＋Treg進(jìn)行清除后再進(jìn)行體外作用，發(fā)現(xiàn)Treg清除前后IL-10＋CD19＋Breg比例和IL-10含量并無明顯變化，且清除前慢性乙肝組IL-10＋CD19＋Breg比例和IL-10水平存在明顯相關(guān)性。這說明本研究中IL-10主要來源于活化的IL-10＋CD19＋Breg，同時(shí)也提示Breg的表達(dá)頻率不受Treg的影響。

最近的研究表明，分泌IL-10的B細(xì)胞可能具有誘導(dǎo)產(chǎn)生Treg的作用［8－9］。而且多項(xiàng)研究證實(shí)CHB患者外周血Treg比例升高。為了了解CHB中Breg與Treg之間的關(guān)系，我們通過分析各組CD4＋CD25highTreg的比例發(fā)現(xiàn)，CHB組Treg表達(dá)頻率高于其他兩組，且Breg與Treg的表達(dá)頻率間存在正相關(guān)。通過剔除CHB組PBMC中CD4＋CD25＋T細(xì)胞的研究發(fā)現(xiàn)，剔除前后Breg比例無明顯變化。該結(jié)果提示CHB中Breg對(duì)Treg可能具有調(diào)節(jié)作用，而Treg對(duì)Breg的比例則無影響。然而，我們僅僅分析了Treg的表達(dá)頻率及其與Breg之間的相關(guān)性，尚不足以證明兩者之間是否存在必然的因果關(guān)系，但是這一結(jié)果至少可以提示CHB中IL-10＋CD19＋Breg與CD4＋CD25highTreg有一定的聯(lián)系，為進(jìn)一步研究兩者之間的關(guān)系提供了思路。

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Expression and roles of regulatory B cells and T cells in patients w ith chronic hepatitis B

YANG Hong-lin1，2，JIN Jie1，JIANG Ting-wang3

（1.School of Medical Science and Laboratory Medicine，Jiangsu University，Zhenjiang Jiangsu 212013；2.Departmentof Clinical Laboratory，the First People′s Hospital of Wujiang，Suzhou Jiangsu 215200；3.Institution for Laboratory Medicine of Changshu，Suzhou Jiangsu 215500，China）

Objective：To investigate the expression and roles of IL-10＋CD19＋regulatory B cells（Breg）and CD4＋CD25highregulatory T cell（Treg）in patientswith chronic hepatitis B.M ethods：A total of 28 patientswith acute hepatitis B（AHB），31 patients with chronic hepatitis B（CHB）and 25 normal subjects（HCs group）were enrolled in this study.Peripheral blood mononuclear cells（PBMC）were isolated and stimulated with CpGODN 2006 and PMA.The expression of IL-10＋CD19＋Breg and CD4＋CD25highTregwas analyzed with flow cytometry.The level of IL-10 in culture supernatantwas analyzed with ELISA.CD4＋CD25＋T cells were removed with Immunomagnetic beads to analyze the interactions between Breg and Treg.Results：After stimulation with CpG ODN 2006 and PMA，compared with the AHB group and the HCs group，percentages of Breg and Treg in the CHB group increased significantly（Breg：P＝0.003，0.001；Treg：P＜0.001，＜0.005），and no difference was found between the AHB group and the HCs group（Breg：P＝0.796；Treg：P＝0.227）.Spearman correlation analysis found that in the CHB group，Breg and Treg was positively correlated（r＝0.50，P＝0.004），but in the AHB group and the HCs group，there was no such correlation（r＝－0.15，P＝0.462；r＝0.09，P＝0.669）.IL-10 expression in the CHB group was higher than that in the AHB group and the HCs group（Z＝－6.596，－6.373，P＜0.001），and the difference between the AHB group and the HCs group was not statistically significant（Z＝－0.952，P＝0.341）.Spearman correlation analysis showed that in the CHB group，IL-10 and Bregwere positively correlated（r＝3.303，P＝0.005）.Before and after removal of CD4＋CD25＋T cells，in the CHB group，the difference between Breg and IL-10 expression was not statistically significant.Conclusion：The expression of Breg and Treg increased in patientswith chronic hepatitis B，Bregmight play a regulatory role by IL-10 secretion.

regulatory B cells；chronic hepatitis B；regulatory T cells；IL-10

R512.62

A

1671－7783（2014）01－0048－04

10.13312／j.issn.1671-7783.y130194

常熟市科技發(fā)展計(jì)劃（社會(huì)發(fā)展）項(xiàng)目（CS201113）

楊鴻林（1977—），男，福建漳州人，主管檢驗(yàn)師，主要從事臨床檢驗(yàn)學(xué)的研究；蔣廷旺（通訊作者），主管技師，E-mail：jtwgyp＠sina.com

2013－09－02 ［編輯］陳海林