愈骨療傷方醇提物和水提物的藥效學(xué)研究

陳海飛，鮑蕾蕾，孫 艷,2，許志仁,2，范正平，卞 俊*

(1.解放軍第四一一醫(yī)院藥學(xué)科，上海 200434；2.江西中醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，南昌 333004)

愈骨療傷方劑(Yuguliaoshang recipe，YGLS)是由解放軍第四一一醫(yī)院中醫(yī)科李念群主任醫(yī)師提供的祖?zhèn)髅胤?。該方在治療過程中，以整體觀為主要思想，并根據(jù)魏氏傷科學(xué)術(shù)經(jīng)驗，以早期活血化瘀，中期和血生新，后期固本培元等治療原則創(chuàng)制。臨證立足中醫(yī)，詳細審證，辨證辨病，治傷重視氣血，調(diào)攝脾胃。本方選用中藥川斷、骨碎補、土鱉蟲、當(dāng)歸、生地、白芍、沒藥、乳香、鹿角霜、煅自然銅、甘草11味中藥組方，具有活血化瘀、續(xù)骨愈傷、消腫止痛之功效。用于外傷等引起的骨折、骨碎、骨裂、頸椎病及關(guān)節(jié)、軟組織損傷所引起的腫脹、疼痛等。YGLS作為祖?zhèn)髅胤皆诒驹号R床應(yīng)用30多年，療效明確。本實驗旨在通過藥效學(xué)研究評價YGLS水提和醇提兩種提取工藝，對該方治療骨折愈合的效果，以篩選出YGLS的最佳提取工藝。

1 材料和方法

1.1 藥品和儀器 YGLS醇提取物和水提取物， 均為本院藥學(xué)科制劑室自制的粉劑， 臨用前分別加入蒸餾水配制成混懸液。水提取物3種混懸液的濃度為5.2%、10.6%和21.2%，醇提取物3種混懸液的濃度為3.2%、6.4%和12.8%。傷科接骨片(批號 200906326，大連美羅中藥材有限公司)，將其研磨成粉末后加入蒸餾水配制成8%混懸液。麝香接骨膠囊(批號 090301，吉林省輝南天宇藥業(yè)股份有限公司)，將其研磨成粉末后加入蒸餾水配制成8%混懸液。戊巴比妥鈉(批號WS 20110112，美國Sigma公司)；注射用青霉素鈉(批號 A110203116，哈藥集團制藥總廠)。TJL16 離心機(上海安寧科學(xué)儀器廠)；Vitro 3350血液生化儀(美國強生公司)； CX31顯微鏡(日本Olympus公司)。

1.2 家兔及分組 健康新西蘭大白兔60只[第二軍醫(yī)大學(xué)動物中心，動物合格證號：SCXK(滬)2007-0007]，雌雄各半，體重為2.0～2.5 kg。采用體重分層隨機數(shù)字表將家兔分成10組：對照組、模型組、2個陽性對照組(傷科接骨片和麝香接骨膠囊組)、3個YGLS水提取物組和3個YGLS醇提取物組。根據(jù)前期預(yù)實驗結(jié)果，YGLS低、中、高劑量分別為0.8、1.6、3.2 g生藥/kg體重。水提取物的得率為33%，3個YGLS水提取物組給予水提取物粉末的量為0.26、0.53、1.06 g/kg。醇提取物的得率為20%，3個YGLS醇提取物組給予醇提取物粉末的量為0.16、0.32、0.64 g/kg。

1.3 骨折模型的制備[1]大白兔靜脈注射戊巴比妥鈉50 mg/kg麻醉。仰臥固定后，剪去右側(cè)脛骨處的兔毛，消毒皮膚，用手術(shù)刀切開脛骨上方的皮膚，分離肌肉及肌膜，暴露脛骨。用雙層鋼鋸造成新西蘭大白兔脛骨中段不完全性骨折，骨折處寬約3 mm，深度為脛骨直徑的1/2。縫合皮下組織及皮膚。手術(shù)后肌注青霉素鈉2.0×105IU/只，共3 d，預(yù)防感染。

1.4 給藥 各組均于術(shù)后第2天開始灌胃給藥。對照組、模型組家兔給予蒸餾水，2個陽性對照組家兔分別給予8%傷科接骨片混懸液和8%麝香接骨膠囊混懸液，3個YGLS水提取物組家兔分別給予5.2%、10.6%和22.2%YGLS水提取物混懸液，3個YGLS醇提取物組家兔分別給予3.2%、6.4%和12.8%YGLS醇提取物混懸液。灌胃劑量均為5 ml/kg，1次/d，連續(xù)給藥30 d。

1.5 觀察指標(biāo) 給藥30 d后心臟取血，1388×g離心10 min，分離血清，測定堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)活性、血磷和血鈣水平。實驗結(jié)束時取右側(cè)脛骨，X線觀察以評價骨折愈合程度，按下列標(biāo)準(zhǔn)進行評分[2，3]：0分 骨完全連接，無骨折線可見。1分 骨折斷端邊緣消失；骨膜反應(yīng)密度近似骨影；骨痂填滿缺損，與骨皮質(zhì)密度相同并相互連接。2分 骨折斷端邊緣仍可見，但接近消失；骨膜反應(yīng)較深；骨痂增多，但尚未填滿缺損，密度加深，邊緣較清。3分 骨折斷端邊緣模糊；骨膜反應(yīng)淺淡；骨痂少量，密度較淡，邊緣不整齊。4分 骨折斷端邊緣趨向模糊；骨膜輕度反應(yīng)，無骨痂可見。組織學(xué)觀察：取骨折斷端及周圍軟骨痂，標(biāo)本置于4%甲醛中固定，甲酸脫鈣，乙醇脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，切片，用蘇木精-伊紅染色，在光鏡下觀察骨痂的變化。

2 結(jié) 果

2.1 YGLS對兔骨折局部X影像表現(xiàn)的影響 給藥后30 d，模型組家兔脛骨中段可見少量骨痂生長，但未達到骨的完全連接，其骨折線、肌肉腫脹并未完全消失。傷科接骨片組家兔脛骨中段骨痂填滿缺損，骨折線隨骨痂骨性愈合而消失，肌肉腫脹消失，骨髓腔復(fù)原，骨折已基本愈合。麝香接骨膠囊組家兔骨折斷端邊緣仍可見，但接近消失；骨痂增多，但尚未填滿缺損，邊緣較清。YGLS水提取物與醇提取物中、高劑量組家兔脛骨中段骨痂填滿缺損，骨折線和肌肉腫脹消失，骨髓腔復(fù)原，骨折基本愈合，各組家兔骨折愈合的等級見表1。與傷科接骨片一樣，中、高劑量YGLS水提物和醇提物組的等級明顯低于模型組， 差別有顯著意義 (P<0.05)，即中、高劑量的YGLS水提物和醇提物組家兔骨折修復(fù)快于模型組，表明YGLS水提物和醇提物有一定的促進骨折愈合作用。

表1 家兔骨折術(shù)后使用愈骨療傷方30 d的X線片觀察結(jié)果

2.2 YGLS對骨折局部骨組織結(jié)構(gòu)的影響 傷后30 d，模型組骨折斷端連接部的成纖維細胞和成骨細胞增生，軟骨細胞生長，并伴有軟骨細胞的變性和空泡化；部分家兔可見初級骨小梁生成，早期骨痂形成。傷科接骨片陽性對照組可見骨折處骨小梁明顯增粗，骨痂形成，髓腔通過；麝香接骨膠囊陽性對照組骨小梁比模型組稍粗，但排列不規(guī)則，有骨痂形成。傷后30 d，YGLS醇提取物與水提取物低劑量組家兔骨折缺損處均可見成纖維細胞和成骨細胞生長和增生；所形成的骨小梁大多較細，與模型組相似，均可見早期骨痂形成。YGLS醇提取物與水提取物中劑量組在骨折處均可見成纖維細胞、成骨細胞和軟骨細胞增生，并可見軟骨細胞的核固縮、空泡變性等；骨小梁大多較模型組略粗，有的交互連接成網(wǎng)，但排列不規(guī)則，中央有髓腔通過，骨痂形成。高劑量醇提取物與水提取物組多數(shù)家兔的骨小梁普遍較模型組增粗，骨小梁相互連接，有髓腔通過。有少數(shù)家兔可見到軟骨細胞區(qū)，骨小梁也較成熟，該兩組家兔骨折修復(fù)過程中形成的骨痂有吸收的趨勢，呈骨折愈合加快的現(xiàn)象(見圖1)。

2.3 YGLS對骨折模型兔血清鈣、磷濃度和ALP活性的影響 從表2可見骨折后30 d，與對照組比較，模型組家兔血清ALP活性和血清鈣磷濃度乘積明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05,P<0.01)。與模型組比較，中劑量YGLS水提組與醇提組家兔血清ALP活性明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；高劑量YGLS水提組家兔血清鈣磷濃度乘積顯著升高，與模型組比較， 差異有統(tǒng)計學(xué)意義 (P<0.05)。高劑量YGLS醇提組家兔血清ALP、鈣濃度、 磷濃度及鈣磷濃度乘積均顯著升高，與模型組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。YGLS水提組與醇提組相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。YGLS各組與陽性對照組(傷科接骨片)相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

圖1 愈骨療傷方對骨折后30 d各組家兔骨組織結(jié)構(gòu)的影響(HE染色，×200)

表2 愈骨療傷方對骨折后30 d家兔血清堿性磷酸酶活性及鈣、磷濃度的影響

Table 2 Effects of Yuguliaoshang recipe on serum alkaline phosphatase activity, the levels of calcium and phosphorus at 30 d after bone fracture in rabbits

表2 愈骨療傷方對骨折后30 d家兔血清堿性磷酸酶活性及鈣、磷濃度的影響

*P<0.05，**P<0.01，與對照組比較；△P<0.05，與模型組比較；ALP：堿性磷酸酶

ALP(zB/U·L-1)(cB/mmol·L-1)(cB/mmol·L-1)181．00±52．903．38±0．162．24±0．307．57±1．05112．67±31．71＊3．40±0．141．55±0．33＊5．08±1．02＊＊129．00±23．163．56±0．15△1．86±0．546．70±2．17142．00±40．933．48±0．111．43±0．404．99±1．43 131．38±55．923．49±0．211．77±0．416．20±1．63 156．88±37．92△3．54±0．111．76±0．616．28±2．31 162．00±58．84△3．58±0．21△2．00±0．51△7．23±2．19△ 114．25±46．633．37±0．161．71±0．595．77±2．04 146．55±25．86△3．54±0．111．74±0．586．14±2．11 146．13±38．433．54±0．101．94±0．506．84±1．75△

3 討 論

中醫(yī)藥傳統(tǒng)文化博大精深，其通過多成分、多靶點的綜合作用發(fā)揮治療效果。但傳統(tǒng)的中藥劑型湯劑由于不易保存、攜帶不方便、耗時長等缺點，已遠遠不能滿足臨床需要。為了更好地發(fā)掘中醫(yī)藥寶庫，朝著科學(xué)化、現(xiàn)代化道路發(fā)展，必須對中藥的提取工藝、制備工藝、劑型進行改革。傳統(tǒng)中藥劑型湯劑采用水煎煮的方式進行提取，但是，在該過程中存在“黑、大、粗”的問題，因此，利用中藥現(xiàn)代化的思路進行研究顯得尤為重要。作者在前期研究通過正交實驗，考察水提、醇提和超聲提取3種方式，對方劑中主要有效成分含量的影響[4]。結(jié)果顯示，醇提時指標(biāo)成分的含量最高。但是，中藥復(fù)方作為整體發(fā)揮作用，單一指標(biāo)成分的高低，不能真實地反映其在體內(nèi)作用的效果。本研究旨在突破傳統(tǒng)中藥提取工藝評價拘泥于“找成分，測含量”的化學(xué)評價模式，采用以藥效學(xué)為核心的評價方式，從家兔整體水平，對水提工藝和醇提工藝進行比較。

在臨床觀察骨折愈合的過程中，多以X線片作為主要的評價指標(biāo)，本研究亦將X線片列為主要的評價指標(biāo)。從結(jié)果可見，在相同生藥量(不同的藥物提取量)情況下，中、高劑量醇提組和水提組骨痂填滿缺損，骨折線隨骨痂骨性愈合而消失，表明兩種工藝都能在一定程度上促進骨折愈合，且兩者的作用程度相當(dāng)。從病理學(xué)檢查可見，醇提與水提中、高劑量組均可見骨折缺損處有成纖維細胞、成骨細胞生長和增生；骨小梁隨著劑量的增加，而呈現(xiàn)逐漸增粗和骨折愈合加快的現(xiàn)象。

由于在骨折愈合的過程中，成骨細胞大量增生，其分泌的ALP可以滲透入血清，因此，血清ALP可以作為成骨細胞活躍性的指標(biāo)，即間接反映骨折愈合的指標(biāo)[5]。另外，骨折愈合必須經(jīng)過鈣化的過程，鈣鹽的沉積是關(guān)鍵步驟。血清中鈣、磷的相互作用，促進鈣鹽沉積[5，6]。因此，本實驗選取兩者作為評價骨折愈合的量化指標(biāo)。從結(jié)果可見，醇提的高劑量組能顯著提高鈣、磷濃度及鈣磷濃度乘積，水提的高劑量組能提高鈣磷濃度乘積。醇提中、高劑量組和水提中劑量組均能提高血清ALP活性。各給藥組之間無顯著性差異，表明各給藥組對骨折愈合相關(guān)血液生化指標(biāo)的影響作用相當(dāng)。

從上述研究結(jié)果分析可知，在相同的生藥量下，醇提物和水提物促進骨折愈合的作用相當(dāng)。由于醇提和水提的得率不同，導(dǎo)致相同的生藥量下，服用的提取物的量不同。即在相同的作用強度下，醇提能較水提降低約40%的服藥量(醇提的得率為20%，水提的得率為33%)。因此，YGLS以選用醇提工藝為佳。

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