腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子在胰腺導(dǎo)管腺癌中的表達(dá)及其臨床意義

胡立威 陳炯 周杭城 楊仁保 陳龍江 趙躍

胰腺癌除高侵襲性及多重耐藥性外，胰周神經(jīng)浸潤(rùn)也是其一個(gè)顯著特征，發(fā)生率可達(dá)54%～100%[1]。文獻(xiàn)證實(shí)[2]，神經(jīng)浸潤(rùn)與患者臨床手術(shù)時(shí)機(jī)的選擇以及生存時(shí)間密切相關(guān)。因此，近年來(lái)越來(lái)越多的研究開(kāi)始關(guān)注胰腺癌的神經(jīng)浸潤(rùn)機(jī)制。文獻(xiàn)報(bào)道[3-4]，胰腺內(nèi)外神經(jīng)組織產(chǎn)生的許多神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子、黏附分子參與了胰腺癌的神經(jīng)侵襲過(guò)程。腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(brain-derived neurotrophic factor，BDNF)自分泌表達(dá)于胃、胰實(shí)體腫瘤[4]，參與胰腺腫瘤的發(fā)生、增殖，癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和神經(jīng)浸潤(rùn)[5-7]。本研究檢測(cè)胰腺導(dǎo)管腺癌組織中BDNF基因的表達(dá)，分析BDNF表達(dá)與胰腺癌病理參數(shù)之間的關(guān)系，探討其在胰腺癌發(fā)生、發(fā)展中的作用。

材料與方法

一、臨床資料

收集安徽省立醫(yī)院1991年8月至2012年12月外科手術(shù)切除的46例胰腺癌及38例胰腺良性疾病患者的資料。46例胰腺癌患者中男性24例，女性22例，年齡45～76歲，病理證實(shí)均為胰腺導(dǎo)管腺癌。38例胰腺良性疾病患者中男性21例，女性17例，年齡 41～65歲，包括13例急性胰腺炎、8例慢性胰腺炎、9例胰腺囊腫、1例胰腺導(dǎo)管內(nèi)乳頭狀瘤，7例有胰管結(jié)石。另選取20例正常胰腺作為對(duì)照組，其中男性11例，女性9例，標(biāo)本來(lái)源于尸體解剖、胰腺意外傷及脾臟切除附帶的正常胰腺組織。

二、免疫組化染色

取4%甲醛固定的組織標(biāo)本，石蠟包埋，切片，常規(guī)行免疫組化染色。兔抗人BDNF單抗購(gòu)自SantaClauz公司，工作濃度1∶200，生物素化標(biāo)記的鼠抗兔二抗購(gòu)自北京中杉金橋公司，工作濃度1∶200，最后加辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的鏈霉素卵白素工作液，DAB反應(yīng)染色。以PBS緩沖液代替一抗作陰性對(duì)照。腫瘤細(xì)胞或間質(zhì)內(nèi)皮細(xì)胞胞質(zhì)或胞膜出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽(yáng)性。由病理科醫(yī)師盲法讀片。每張切片先在低倍鏡下選取胰腺細(xì)胞密集區(qū)，再在高倍鏡下取10個(gè)視野計(jì)數(shù)1 000個(gè)細(xì)胞，計(jì)算染色細(xì)胞占總細(xì)胞數(shù)的百分?jǐn)?shù)，以染色細(xì)胞≥20%為陽(yáng)性，<20%為陰性。

三、RT-PCR法

取新鮮的組織標(biāo)本，應(yīng)用Trizol提取總RNA。BDNF上游引物為5′-TTAGCGAGTGGGTCACAGCG-3′，下游引物為5′-ATTGGGTAGTTCGGCATTGC-3′，擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度207 bp。以β-actin作為內(nèi)參。引物由上海生工生物工程有限公司合成。先用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(杭州博日公司)轉(zhuǎn)錄成cDNA，按說(shuō)明書(shū)操作，再行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)條件：95℃ 10 min，95℃ 30 s、56℃ 30 s、72℃ 45 s，27個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸7 min。取5μl PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳后，UVI凝膠成像掃描儀掃描，以目的條帶與內(nèi)參條帶灰度比值作為mRNA的相對(duì)表達(dá)量。

四、蛋白質(zhì)印跡法

取新鮮胰腺組織切成小塊，加裂解液制備成勻漿，離心取上清進(jìn)行蛋白定量。取50 μg蛋白常規(guī)行蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)BDNF表達(dá)量。以β-actin作為內(nèi)參。所用抗體同免疫組化法抗體。最后滴加ECL發(fā)光，X線曝光、顯影、定影。應(yīng)用掃描儀掃描，以目的條帶與內(nèi)參條帶的灰度比值表示蛋白相對(duì)表達(dá)量。

五、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

一、BDNF蛋白的表達(dá)

免疫組化染色顯示，正常胰腺組織僅見(jiàn)少許胰腺腺泡細(xì)胞的胞質(zhì)及部分導(dǎo)管細(xì)胞胞核出現(xiàn)淺黃色顆粒。胰腺導(dǎo)管腺癌組織中BDNF蛋白主要表達(dá)在癌細(xì)胞胞質(zhì)、神經(jīng)鞘膜及神經(jīng)周圍，且靠近神經(jīng)組織的癌細(xì)胞BDNF陽(yáng)性程度高于遠(yuǎn)離神經(jīng)組織癌細(xì)胞(圖1)，BDNF陽(yáng)性表達(dá)率為52.2%(24/46)。胰腺良性疾病BDNF陽(yáng)性表達(dá)率為7.8%(3/38)，其中慢性胰腺炎2例，胰腺囊腫1例。胰腺癌與胰腺良性病變的BDNF陽(yáng)性表達(dá)率差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=18.706，P<0.01)。

圖1 正常胰腺組織(a)、慢性胰腺炎組織(b)、無(wú)神經(jīng)浸潤(rùn)的胰腺癌組織(c)及有神經(jīng)浸潤(rùn)的胰腺癌組織(d)BDNF蛋白的表達(dá)(HE ×200)

蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)結(jié)果顯示，正常胰腺、胰腺良性疾病、胰腺癌組織中BDNF蛋白的表達(dá)量分別為0.38±0.01、0.56±0.01、0.97±0.01(圖2)。胰腺癌和胰腺良性疾病組織的BDNF表達(dá)量顯著高于正常胰腺組織(t值分別為11.407、13.032，P值均<0.01)；胰腺癌的表達(dá)量又顯著高于胰腺良性疾病(t=6.896，P<0.01)。

二、BDNF mRNA表達(dá)

正常胰腺、胰腺良性疾病、胰腺癌組織中BDNF mRNA的表達(dá)量分別為0.85±0.14、1.67±0.21、3.45±0.67。胰腺癌和胰腺良性疾病組織的表達(dá)量顯著高于正常胰腺組織(t值分別為10.304、11.425,P值均<0.01)；胰腺癌的表達(dá)量又顯著高于胰腺良性疾病(t=7.525,P<0.01)。

三、BDNF表達(dá)與胰腺癌臨床病理參數(shù)間的相關(guān)性

BDNF表達(dá)與腫瘤神經(jīng)浸潤(rùn)及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有相關(guān)性(P值均<0.05)，而與患者年齡、性別及腫瘤直徑、部位、分化程度均無(wú)相關(guān)性(P值均>0.05，表1)。

表1 胰腺癌組織BDNF表達(dá)與臨床病理參數(shù)間的關(guān)系

討 論

BDNF主要分布于大腦中樞神經(jīng)系統(tǒng)、外周神經(jīng)系統(tǒng)、內(nèi)分泌系統(tǒng)、骨和軟骨等組織內(nèi)。BDNF在腦內(nèi)主要位于大腦皮質(zhì)各層、海馬各區(qū)、腦干以及小腦的神經(jīng)元胞體及部分神經(jīng)突起。它主要定位于細(xì)胞的胞質(zhì)。通過(guò)與配體酪氨酸激酶受體B(tyrosine kinase receptor B，TrkB) 特異性高親和力結(jié)合，參與維持正常腦組織細(xì)胞的生理功能。也有研究證實(shí)[8]，BDNF可與TrkB或p75神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)蛋白受體(p75 neurotrophin receptor，p75NTR)結(jié)合，通過(guò)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的瀑布效應(yīng)阻斷或介導(dǎo)細(xì)胞的程序性凋亡，從而抑制或者促進(jìn)凋亡的發(fā)生[8-9]。BDNF與TrkB結(jié)合后可激活Ras癌基因，使其下游效應(yīng)因子磷脂酰肌醇3-激酶(phosphoinositide3-kinase，PI3K)和Raf激酶啟動(dòng)PI3K/Akt和Raf/MEK/ERK激酶信號(hào)途徑而抑制細(xì)胞的失巢凋亡，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞增殖和遷移[10-11]。Pearse等[12]的研究也證實(shí)，BDNF/TrkB信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑可以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的存活，有助于腫瘤的進(jìn)展。

本研究結(jié)果顯示，胰腺癌組織BDNF mRNA及蛋白表達(dá)量顯著高于正常胰腺組織及胰腺良性疾病組織，與文獻(xiàn)報(bào)道的結(jié)果相符[13-15]，提示BDNF可能參與胰腺腫瘤的自分泌生長(zhǎng)刺激和浸潤(rùn)性生長(zhǎng)。本結(jié)果還顯示，胰腺癌組織內(nèi)的神經(jīng)鞘膜及神經(jīng)周圍亦有BDNF的表達(dá)，且靠近神經(jīng)組織的癌細(xì)胞BDNF陽(yáng)性程度高于遠(yuǎn)離神經(jīng)組織癌細(xì)胞，可見(jiàn)BDNF的表達(dá)與腫瘤的神經(jīng)浸潤(rùn)呈正相關(guān)，提示BDNF與胰腺癌神經(jīng)浸潤(rùn)密切相關(guān)。臨床病理分析結(jié)果表明,BDNF的表達(dá)與胰腺導(dǎo)管腺癌患者的年齡、性別及腫瘤大小、部位等因素均無(wú)顯著相關(guān)性，但與胰腺導(dǎo)管腺癌的神經(jīng)浸潤(rùn)及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)，也提示BDNF表達(dá)水平可能與胰腺癌患者預(yù)后有關(guān)。

參 考 文 獻(xiàn)

[1] Keleg S, Buchler P, Ludwig R, et al. Invasion and metastasis in pancreatic cancer[J]. Mol Cancer,2003,2:14.

[2] Hotomi M, Sugitani I, Toda K,et al. A novel definition of extrathyroidal invasion for patients with papillary thyroid carcinoma for predicting prognosis[J]. World J Surg, 2012,36(6):1231-1240.

[3] Schneider MB, Standop J, Ulrich A, et al.Expression of nerve growth factors in pancreatic neural tissue and pancreatic cancer[J].J Histochem Cytochem,2001,49(10):1205-1210.

[4] Airaksinen MS,Saarma M.The GDNF family:signaling,biological functions and therapeutic value[J]. Nat Rev Neurosci,2002,3(5)：383-394.

[5] Aoyama M,Asai K,Shishikura T,et al. Human neuroblastomas with unfavorable biologies express high levels of brain-derived neurotrophic factor mRNA and a variety of its variants[J].Cancer,2001,164(1)：51-60.

[6] Miyamoto Y, Yamauchi J, Tanoue A, et al. TrkB binds and tyrosine-phosphorylates Tiam1, leading to activation of Rac1 and induction of changes in cellular morphology[J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 2006,103(27):10444-10449.

[7] Entschladen F, Palm D, Niggemann B, et al. The cancer′s nervous tooth: Considering the neuronal crosstalk within tumors[J]. Semin Cancer Biol, 2008,18(3):171-175.

[8] Brito V, Puigdellivol M, Giralt A, et al.Imbalance of p75(NTR)/TrkB protein expression in Huntington′s disease: implication for neuroprotective therapies[J]. Cell Death Dis,2013,4:e595.

[9] Lam CT, Yang ZF, Lau CK, et al.Brain-derived neurotrophic factor promotes tumorigenesis via induction of neovascularization: implication in hepatocellular carcinoma[J].Clin Cancer Res,2011,17(10):3123-3133.

[10] Zhang Q, Liu G, Wu Y, et al.BDNF promotes EGF-induced proliferation and migration of human fetal neural stem/progenitor cells via the PI3K/Akt pathway[J]. Molecules, 2011,16(12):10146-10156.

[11] Huang YT, Lai PC, Wu CC, et al.TrkB antibody elicits cytotoxicity and suppresses migration/invasion of transitional cell carcinoma cells[J].Int J Oncol, 2010,37(4):943-949.

[12] Pearse RN, Swendeman SL, Li Y, et al. Aneurotrophin axis in myeloms: TrKB and promote tumor-cell survival[J]. Blood, 2005, 105(11):4429-4436.

[13] Satoh F, Mimata H, Nomura T, et al．Autocrine expression of neurotrophins and their receptors in prostate cancer[J].Int J Urol,2001,8(7):S28-S34.

[14] Aoyama M,Asai K,Shishikura T,et al.Humanneuroblastomas with Unfavorable biologies express high levels of brain-derived neurotrophic factor mRNA and a variety of its variants[J].Cancer Let,2001,164(1)：51-60.

[15] Okugawa Y, Tanaka K, Inoue Y, et al.Brain-derived neurotrophic factor/tropomyosin-related kinase B pathway in gastric cancer[J]. Br J Cancer, 2013,108(1):121-130.