亞硫酸氫鹽在SPORL法預(yù)處理稻草中的作用

李 洲 王高升,* 王 霞 肖 林 夏蕊蕊

(1.天津科技大學(xué)天津市制漿造紙重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,天津,300457；2. 山東龍力生物科技股份有限公司,山東省秸稈生物煉制技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,山東德州,251200)

面對(duì)日益嚴(yán)重的能源危機(jī),利用來源豐富、廉價(jià)且可再生的植物纖維原料生產(chǎn)燃料乙醇是一條解決能源問題的有效途徑[1]。植物纖維原料主要由纖維素、半纖維素和木素等組成,利用纖維素水解得到的葡萄糖發(fā)酵生產(chǎn)乙醇是目前制備纖維素乙醇的主流技術(shù)。由于木素和半纖維素對(duì)纖維素的包裹以及纖維素本身的復(fù)雜結(jié)構(gòu)，對(duì)植物纖維直接進(jìn)行酶水解時(shí),其水解程度很低,一般只有10%～20%。只有經(jīng)過有效預(yù)處理,破壞植物纖維的復(fù)雜結(jié)構(gòu),增加纖維素酶對(duì)纖維素的可及度,才能使植物纖維原料被充分利用。因此,預(yù)處理是利用植物纖維原料生產(chǎn)燃料乙醇的關(guān)鍵技術(shù)。研究開發(fā)高效、低成本的預(yù)處理技術(shù)是植物纖維原料生產(chǎn)燃料乙醇的主要方向之一。目前,開發(fā)了許多預(yù)處理技術(shù),并取得了一些成果。這些預(yù)處理技術(shù)可分為物理法、化學(xué)法、物理化學(xué)法和生物法,基本原理都是去除木素和半纖維素,破壞原料的物理結(jié)構(gòu),降低纖維素結(jié)晶度和聚合度。研究較多的方法有蒸汽爆破法(Steam Explosion)[2]、 稀酸法(Dilute Acid)[3]、 有機(jī)溶劑法(Organosolv)[4]、 氨氣爆破法(AFEX)[5]、 堿法(Alkaline)[6]、 熱水法(Hot Water)[7-8]、 替代溶劑預(yù)處理(Alternative Solvents Pretreatment)[9-11]、 生物預(yù)處理(Fungal Pretreatment)[12]等。這些方法都存在各自的缺點(diǎn),主要有以下幾個(gè)方面：①氨氣爆破法、稀酸法、熱水法對(duì)原料的適應(yīng)性差,通常對(duì)木素含量低的農(nóng)業(yè)廢棄物有效,但對(duì)木素含量高的針葉木效果不理想；②稀酸法、蒸汽爆破法會(huì)產(chǎn)生發(fā)酵抑制物，如糠醛含量高；③石灰法和真菌預(yù)處理的處理時(shí)間長(zhǎng)；④蒸汽爆破法大規(guī)模生產(chǎn)時(shí)存在障礙，如缺少適合大規(guī)模生產(chǎn)的設(shè)備；⑤替代溶劑預(yù)處理的原材料價(jià)格高；⑥稀酸法的反應(yīng)器需要特種耐腐蝕金屬材料；⑦經(jīng)熱水法、氨氣爆破法預(yù)處理后，半纖維素水解為寡糖,需要利用酶或酸將寡糖進(jìn)一步水解成單糖。

SPORL(Sulfite Pretreatment to Overcome Recalcitrance of Lignocellulose)法預(yù)處理是近年來開發(fā)出的一種預(yù)處理方法，主要利用酸性亞硫酸氫鹽對(duì)植物纖維原料進(jìn)行預(yù)處理,以克服植物纖維原料對(duì)酶的抗性。目前的研究表明,SPORL法對(duì)于多種生物質(zhì)原料(如云杉、紅松、桉木、楊木、麥草、棉稈和玉米秸稈等)有很好的適應(yīng)性,提高了纖維素酶水解效率[13-19]。

我國(guó)是世界第一秸稈大國(guó),我國(guó)秸稈總產(chǎn)量占全球秸稈總產(chǎn)量的17.3%,每年可收集到的纖維秸稈資源量為3.0億～3.3億t,其中約1.0億t為稻草[20]。近年來,由于秸稈產(chǎn)量的增加，農(nóng)村產(chǎn)業(yè)結(jié)構(gòu)和能源結(jié)構(gòu)的改變,各類替代物品的應(yīng)用,以及秸稈分布零散、體積大、收集運(yùn)輸成本高、綜合利用經(jīng)濟(jì)性差和產(chǎn)業(yè)化程度低等原因,秸稈出現(xiàn)了地區(qū)性、季節(jié)性和結(jié)構(gòu)性過剩,大量秸稈資源浪費(fèi)嚴(yán)重。目前,我國(guó)的稻草、玉米秸稈和麥草都有不同程度的過剩問題,尤其是稻草過剩最多。稻草是我國(guó)主要農(nóng)作物秸稈,年產(chǎn)量占全國(guó)秸稈總產(chǎn)量的25%，主要分布于我國(guó)南方地區(qū)和東北地區(qū)。由于稻草硅含量較高,導(dǎo)致其在造紙工業(yè)中的應(yīng)用較少。本實(shí)驗(yàn)采用SPORL法預(yù)處理稻草,考察亞硫酸氫鹽用量對(duì)稻草酶水解效果的影響,為進(jìn)一步研究SPORL法預(yù)處理機(jī)理和充分利用稻草資源打下基礎(chǔ)。

1 實(shí) 驗(yàn)

1.1材料

實(shí)驗(yàn)所用稻草產(chǎn)自江蘇省常州市,使用時(shí)先將稻草切成2～3 cm的草段,過篩以去除雜質(zhì)。纖維素酶由青島蔚藍(lán)生物股份有限公司提供,濾紙酶活為165.2 U/g。實(shí)驗(yàn)所用鹽酸四環(huán)素、亞硫酸氫鈉、間苯三酚、冰醋酸、濃硫酸、鹽酸等均為分析純。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1SPORL法預(yù)處理

稱取100 g絕干稻草并與預(yù)處理藥液混合均勻后置于1 L反應(yīng)罐內(nèi),密封并裝入電熱蒸煮鍋(ZQS1電熱蒸煮鍋,陜西科技大學(xué)機(jī)械廠)內(nèi),每次實(shí)驗(yàn)可以同時(shí)裝載4個(gè)1 L反應(yīng)罐。在預(yù)定溫度、時(shí)間、固液比等條件下進(jìn)行SPORL法預(yù)處理。預(yù)處理完畢,分離固相與液相,液相離心后用pH計(jì)測(cè)定pH值,并收集到試劑瓶中用于后續(xù)分析；固相(預(yù)處理稻草)經(jīng)疏解分散、洗凈并甩干后,貯于密封袋中,在4℃下冷藏儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2預(yù)處理稻草酶水解

稱取2 g絕干預(yù)處理稻草并置于100 mL三角瓶中,加入50 mL HAc-NaAc緩沖液(pH值4.8、濃度0.1 mol/L),纖維素酶用量為7.5 U/g(對(duì)絕干預(yù)處理稻草),同時(shí)加入0.4 mL質(zhì)量濃度為10 g/L的鹽酸四環(huán)素溶液,補(bǔ)加蒸餾水至100 mL。酶水解溫度50℃、搖床轉(zhuǎn)速200 r/min,在酶水解72 h時(shí)取400 μL水解液于離心管中,煮沸使纖維素酶失活，然后用微量高速離心機(jī)在10000 r/min的轉(zhuǎn)速下離心10 min,取上清液測(cè)定葡萄糖濃度。

1.2.3測(cè)定方法

按照GB/T2677.2—2011、GB/T2677.8—1994、GB/T10337—2008、GB/T742—2008分別測(cè)定水分、酸不溶木素含量、酸溶木素含量及灰分；采用山東省科學(xué)院生物研究所生產(chǎn)的SBA-40D型生物傳感分析儀測(cè)定葡萄糖含量；聚戊糖含量的測(cè)定見文獻(xiàn)[21]；預(yù)處理前后稻草纖維素與聚戊糖含量的測(cè)定見文獻(xiàn)[22]。

1.2.4相關(guān)計(jì)算

某成分的保留率是指預(yù)處理后原料中某成分(如纖維素、木素、半纖維素等)的保留量對(duì)預(yù)處理前原料中該成分含量的百分比；酶水解轉(zhuǎn)化率指預(yù)處理后原料經(jīng)過酶水解后得到的葡萄糖對(duì)預(yù)處理后原料中葡聚糖的百分比；葡萄糖得率是指預(yù)處理后原料經(jīng)酶水解后得到的葡萄糖與原料中葡聚糖的百分比。計(jì)算公式如下：

式中，W、W1、W2、W3分別表示預(yù)處理原料得率、成分保留率、酶水解轉(zhuǎn)化率、葡萄糖得率；X、X1分別表示預(yù)處理前后原料成分含量；C表示酶水解液葡萄糖濃度；m、m1分別表示預(yù)處理前后原料葡萄糖含量；0.1表示水解液體積為0.1 L；0.9表示葡萄糖和葡聚糖的換算系數(shù)；2表示所取預(yù)處理原料絕干質(zhì)量為2 g。

2 結(jié)果與討論

實(shí)驗(yàn)所用稻草的主要化學(xué)成分如表1所示。與玉米秸稈、麥草等農(nóng)業(yè)廢棄物相比，稻草的纖維素和木素含量低,而灰分高。不同的化學(xué)成分含量會(huì)對(duì)預(yù)處理效果產(chǎn)生影響。本實(shí)驗(yàn)在預(yù)處理溫度、時(shí)間和固液比一定的條件下重點(diǎn)研究了亞硫酸氫鹽用量對(duì)稻草主要化學(xué)成分的去除和酶水解效率的影響。

表1 稻草主要化學(xué)成分 %

注 纖維素含量通過葡聚糖含量反映。

2.1對(duì)預(yù)處理過程中亞硫酸氫鹽用量的探討

2.1.1亞硫酸氫鹽用量對(duì)稻草預(yù)處理得率的影響

在固液比1∶4、溫度170℃、保溫時(shí)間30 min、硫酸用量1.84%條件下對(duì)稻草進(jìn)行預(yù)處理,研究亞硫酸氫鈉用量對(duì)稻草預(yù)處理得率的影響,結(jié)果如圖1所示。從圖1可以看出,隨亞硫酸氫鈉用量的增加,稻草預(yù)處理得率呈先下降后上升趨勢(shì)；在亞硫酸氫鈉用量為1.5%～4.5% 范圍內(nèi),稻草預(yù)處理得率由39.6%降到37.3%；當(dāng)亞硫酸氫鈉用量繼續(xù)增加至12.0%時(shí),稻草預(yù)處理得率為42.5%,比最低點(diǎn)增加了5.2個(gè)百分點(diǎn)。由于稻草主要由纖維素、半纖維素、木素等成分構(gòu)成,它們?cè)陬A(yù)處理過程中的溶出將直接影響預(yù)處理得率的變化規(guī)律。下面將結(jié)合稻草預(yù)處理后化學(xué)成分的變化對(duì)這種現(xiàn)象加以解釋。

圖1 亞硫酸氫鈉用量對(duì)稻草預(yù)處理得率的影響

圖2 亞硫酸氫鈉用量對(duì)預(yù)處理稻草化學(xué)成分的影響

2.1.2亞硫酸氫鹽用量對(duì)預(yù)處理稻草化學(xué)成分的影響

亞硫酸氫鈉用量對(duì)預(yù)處理稻草化學(xué)成分的影響如圖2所示。由圖2(a)可以看出,隨亞硫酸氫鈉用量的增加,預(yù)處理稻草纖維素含量逐漸增加；當(dāng)亞硫酸氫鈉用量大于7.5%時(shí)，預(yù)處理稻草纖維素含量保持穩(wěn)定。當(dāng)亞硫酸氫鈉用量小于4.5%時(shí),纖維素保留率基本沒有變化；但當(dāng)亞硫酸氫鈉用量由4.5%增至7.5%時(shí),纖維素保留率快速上升；繼續(xù)增加亞硫酸氫鈉用量,纖維素保留率基本穩(wěn)定。在亞硫酸氫鈉用量7.5%條件下,預(yù)處理稻草纖維素含量和纖維素保留率均達(dá)到一個(gè)較高值,此時(shí),纖維素保留率達(dá)到80%以上。繼續(xù)增加亞硫酸氫鈉用量至12.0%,預(yù)處理稻草纖維素含量和纖維素保留率變化緩慢。這表明存在一個(gè)合適的亞硫酸氫鈉用量,該用量有助于纖維素在酸性條件下的保留,避免纖維素發(fā)生酸催化水解。SHI Yan[23]研究認(rèn)為,亞硫酸氫鈉在酸性條件下會(huì)與六碳糖醛基形成加合物,從而阻止六碳糖進(jìn)一步降解。至于亞硫酸氫鈉在酸性條件下如何阻止纖維素進(jìn)一步發(fā)生水解反應(yīng),有待進(jìn)一步研究。

由圖2(b)可以看出,當(dāng)亞硫酸氫鈉用量小于3.0%時(shí),預(yù)處理稻草聚戊糖的含量和保留率降低幅度較大,此后,隨亞硫酸氫鈉用量的增加,聚戊糖的含量和保留率基本保持穩(wěn)定,聚戊糖的保留率約為17%。這可能是因?yàn)楸緦?shí)驗(yàn)是在高溫酸性條件下進(jìn)行的,絕大部分容易水解的半纖維素已被溶出,亞硫酸氫鈉對(duì)殘存的較難水解的半纖維素去除作用不明顯。

由圖2(c)可以看出,隨亞硫酸氫鈉用量的增加,預(yù)處理稻草木素的含量和保留率均逐漸下降。當(dāng)亞硫酸氫鈉用量為12.0%時(shí),幾乎一半的木素被脫除。這說明亞硫酸氫鈉有助于木素脫除,主要原因是木素和亞硫酸氫根離子發(fā)生磺化反應(yīng)并生成親水性的木素磺酸鹽而溶出[24]。亞硫酸氫鈉用量的增加使體系中亞硫酸氫根離子增多,為木素磺化反應(yīng)提供了有利條件,促進(jìn)了木素溶出。因此,預(yù)處理稻草木素的含量和保留率隨亞硫酸氫鈉用量的增加而呈明顯下降的趨勢(shì)。

從圖2(d)可以看出,隨亞硫酸氫鈉用量的增加,預(yù)處理稻草灰分及灰分保留率均呈先下降后上升最終趨于穩(wěn)定的趨勢(shì)。當(dāng)亞硫酸氫鈉用量為3.0%時(shí),預(yù)處理稻草灰分及灰分保留率最低。繼續(xù)增加亞硫酸氫鈉用量,預(yù)處理稻草灰分及灰分保留率增大；但當(dāng)亞硫酸氫鈉用量大于7.5%時(shí),預(yù)處理稻草灰分保留率保持穩(wěn)定,此時(shí)約57%的灰分溶出。

考察了稻草預(yù)處理過程中各成分的變化規(guī)律后,就可以較好地解釋預(yù)處理得率所呈現(xiàn)的變化規(guī)律。在亞硫酸氫鈉用量為1.5%～4.5%范圍內(nèi),聚戊糖、木素和灰分的溶出增多,而纖維素基本沒有變化,使得預(yù)處理得率呈下降趨勢(shì)。在亞硫酸氫鈉用量為4.5%～7.5%范圍內(nèi),半纖維素溶出基本保持不變,纖維素和灰分保留率增大,木素的溶出率有較大幅度上升。由于木素在原料中含量較少(僅為14.69%),纖維素是原料的最主要成分(含量31.73%),所以木素的溶出對(duì)預(yù)處理得率的變化不起主要作用,對(duì)預(yù)處理得率變化起主要作用的是纖維素,導(dǎo)致預(yù)處理得率隨纖維素保留率的增大而增大。當(dāng)亞硫酸氫鈉用量大于7.5%時(shí),聚戊糖溶出基本不變,纖維素和灰分保留率呈緩慢上升的趨勢(shì),雖然木素繼續(xù)溶出,但其對(duì)得率影響不大,因此，最終的結(jié)果是預(yù)處理得率呈緩慢上升的趨勢(shì)。

2.1.3亞硫酸氫鹽用量對(duì)稻草酶水解效果的影響

亞硫酸氫鈉用量對(duì)稻草酶水解效果的影響如圖3所示。從圖3可知,隨亞硫酸氫鈉用量的增加,酶水解轉(zhuǎn)化率和葡萄糖得率逐漸上升。當(dāng)亞硫酸氫鈉用量為10.5%時(shí),酶水解轉(zhuǎn)化率與葡萄糖得率均達(dá)到最大值。繼續(xù)增加亞硫酸氫鈉用量,酶水解轉(zhuǎn)化率與葡萄糖得率略有下降。增加亞硫酸氫鈉用量能夠促進(jìn)木素脫除和半纖維素水解,從而使得纖維素酶能夠與纖維素更好地接觸,促進(jìn)預(yù)處理稻草酶水解。由于亞硫酸氫鈉用量的增加有助于預(yù)處理稻草纖維素保留率的提高,使得當(dāng)亞硫酸氫鈉用量大于7.5%時(shí),葡萄糖得率大幅提高。本實(shí)驗(yàn)酶水解轉(zhuǎn)化率和葡萄糖得率均不夠高,這主要與所采用的纖維素酶的用量和來源有關(guān)。

圖3 亞硫酸氫鈉用量對(duì)預(yù)處理稻草酶水解轉(zhuǎn)化率和葡萄糖得率的影響

2.2預(yù)處理稻草各主要成分保留率與酶水解轉(zhuǎn)化率的相關(guān)性

預(yù)處理過程中木素、聚戊糖及纖維素保留率與預(yù)處理稻草酶水解轉(zhuǎn)化率的相關(guān)性如圖4～圖6所示。預(yù)處理稻草酶水解轉(zhuǎn)化率隨木素保留率的減小而增大,兩者呈較好的負(fù)相關(guān)線性關(guān)系,相關(guān)系數(shù)為0.9176(見圖4)；聚戊糖保留率與預(yù)處理稻草酶解轉(zhuǎn)化率大體呈負(fù)相關(guān)關(guān)系,兩者之間相關(guān)性低,相關(guān)系數(shù)只有0.4633(見圖5)。這主要是因?yàn)閬喠蛩釟潲}能夠促進(jìn)木素的大量溶出,隨木素溶出量的增加,預(yù)處理稻草的結(jié)構(gòu)變得疏松多孔,加大了纖維素酶對(duì)纖維素的可及性,從而提高預(yù)處理稻草的酶水解轉(zhuǎn)化率。半纖維素溶出一般分為2個(gè)階段：一是快速溶出段,二是慢速溶出段。在本實(shí)驗(yàn)特定條件(pH值<3.2)下,半纖維素溶出率達(dá)到了79%～84%,殘余半纖維素的溶出處于慢速溶出段,雖然該過程能夠使預(yù)處理稻草結(jié)構(gòu)更加疏松多孔,但對(duì)纖維素酶與纖維素的接觸沒有特別明顯的促進(jìn)作用。纖維素保留率與預(yù)處理稻草酶水解轉(zhuǎn)化率呈正相關(guān)關(guān)系,兩者的相關(guān)系數(shù)(見圖6)低于木素的,但高于半纖維素的,這說明在預(yù)處理過程中減少纖維素的降解對(duì)酶水解轉(zhuǎn)化率有益。由此可知,酸性亞硫酸氫鹽預(yù)處理稻草提高酶水解轉(zhuǎn)化率的主要原因是通過亞硫酸氫鹽對(duì)木素的磺化作用,導(dǎo)致更多木素溶出,使預(yù)處理稻草結(jié)構(gòu)更加疏松多孔,增大纖維素酶與纖維素的可及性,從而提高葡萄糖得率。而稀酸法預(yù)處理是通過溶解生物質(zhì)成分中的半纖維素來增大纖維素酶的可及性,從而提高酶水解轉(zhuǎn)化率[25]。這是2種預(yù)處理方法的不同之處。

圖4 預(yù)處理稻草木素保留率與酶水解轉(zhuǎn)化率的相關(guān)性

圖5 預(yù)處理稻草聚戊糖保留率與酶水解轉(zhuǎn)化率的相關(guān)性

圖6 預(yù)處理稻草纖維素保留率與酶水解轉(zhuǎn)化率的相關(guān)性

3 結(jié) 論

3.1在SPORL法預(yù)處理稻草過程中,亞硫酸氫鹽能促進(jìn)稻草木素的脫除和半纖維素的水解溶出,但卻有利于預(yù)處理稻草纖維素的保留；其對(duì)稻草灰分也有一定影響。

3.2在SPORL法預(yù)處理稻草過程中,增加亞硫酸氫鹽用量,預(yù)處理稻草酶水解轉(zhuǎn)化率和葡萄糖得率提高。預(yù)處理稻草的木素、半纖維素和纖維素的含量對(duì)酶水解轉(zhuǎn)化率均有影響：木素保留率與預(yù)處理稻草酶水解轉(zhuǎn)化率呈較好的負(fù)相關(guān)線性關(guān)系；半纖維素溶出對(duì)預(yù)處理稻草酶水解轉(zhuǎn)化率也有促進(jìn)作用,但相關(guān)性較差。預(yù)處理稻草主要成分的保留率與酶水解轉(zhuǎn)化率的相關(guān)性從大到小順序?yàn)椋耗舅?纖維素>半纖維素。

3.3SPORL法預(yù)處理是一種不同于稀酸法的預(yù)處理方法,兩者的不同之處在于亞硫酸氫鹽對(duì)木素的磺化作用,導(dǎo)致更多的木素溶出,使預(yù)處理稻草更加疏松多孔,增大纖維素酶對(duì)纖維素的可及性,從而提高葡萄糖得率。

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