神經(jīng)退行性疾病治療中靶蛋白GPR 17與其激動(dòng)劑和拮抗劑相互作用的分子模擬

葉 桓 劉 述

神經(jīng)退行性疾病治療中靶蛋白GPR 17與其激動(dòng)劑和拮抗劑相互作用的分子模擬

葉 桓 劉 述

目的 尋找高選擇性的GPR 17受體的拮抗劑對于神經(jīng)退行性疾病的治療具有重要意義。方法 本研究經(jīng)過對GPR 17三維結(jié)構(gòu)的長時(shí)程分子動(dòng)力學(xué)模擬后，利用AutoDock軟件將GPR 17的激動(dòng)劑UDP（二磷酸尿苷），拮抗劑MRS 2179對接進(jìn)活性口袋中，并分析其結(jié)合模式。結(jié)果 GPR 17的核苷酸結(jié)合口袋相似于其他P 2Y受體，拮抗劑UDP，MRS 2179能特異地與GPR 17結(jié)合，形成穩(wěn)定的復(fù)合物構(gòu)象，其中Arg 255在配體識別過程中起到關(guān)鍵作用。結(jié)論 本研究為設(shè)計(jì)新型的GPR 17受體拮抗劑提供了理論指導(dǎo)。

神經(jīng)退行性疾??；GPR 17；分子對接；分子動(dòng)力學(xué)

神經(jīng)退行性疾病如老年性癡呆（AD）的病理特征為Aβ多肽沉積在神經(jīng)元周圍，神經(jīng)元內(nèi)Tao蛋白異常磷酸化，小膠質(zhì)細(xì)胞被激活，產(chǎn)生慢性炎癥，導(dǎo)致腦內(nèi)大量神經(jīng)元壞死，促進(jìn)神經(jīng)再生可能是治療老年性癡呆等神經(jīng)退行性疾病的有效途徑[1-4]。

目前，關(guān)于GPR 17受體的中樞作用研究表明，GRP 17受體是腦和脊髓損傷的感受器，損傷后GPR 17表達(dá)會(huì)升高，拮抗GPR 17表達(dá)能減輕腦缺血損傷和脊髓損傷，發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用[5-6]。目前，還沒有GPR 17的特異性拮抗劑，開發(fā)GPR 17的拮抗劑可能是治療神經(jīng)退行性疾病的一條新的有效途徑。分子進(jìn)化研究表明，GPR 17位于系統(tǒng)發(fā)育的兩大受體家族，P 2Y核苷酸受體和半胱氨酰白三烯(Cys-LT)受體家族的中間位置，可以被內(nèi)源性配體半胱氨酰白三稀及細(xì)胞外核苷酸所激活，引起腺甘酸環(huán)化酶抑制和細(xì)胞內(nèi)鈣離子釋放增加。細(xì)胞外核苷酸是與種系發(fā)育相關(guān)的重要的細(xì)胞外信號分子，這類物質(zhì)失調(diào)與炎癥性疾病包括腦缺血密切相關(guān)，細(xì)胞外核苷酸包括腺嘌呤核苷酸(ATP、ADP)、尿嘧啶核苷酸(UTP、UDP)以及糖基化核苷酸(UDP-葡萄糖、UDP-半乳糖)等。

GRP 17作為一種G蛋白偶聯(lián)受體，具有七螺旋跨細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)（TM）（如圖1），然而，GRP 17的晶體結(jié)構(gòu)尚未被解析，本研究只能采用同源建模的方法獲得GPR 17的三維結(jié)構(gòu)，通過長時(shí)程的分子動(dòng)力學(xué)模擬后，將小分子二磷酸尿苷(Uridine diphosphate，UDP)激動(dòng)劑和MRS 2179拮抗劑對接進(jìn)GRP 17受體的結(jié)合口袋中，討論細(xì)胞外信號分子激活G蛋白偶聯(lián)受體的分子機(jī)理，為開發(fā)治療老年性癡呆等神經(jīng)退行性疾病的新藥提供指導(dǎo)。

圖1 GPR 17的蛋白分子結(jié)構(gòu)

1 材料與方法

1.1 小分子配體文件的準(zhǔn)備 在Chemdraw 軟件中畫出UDP和MRS 2179的結(jié)構(gòu)圖，并以MDL Molfile(*.mol)格式存儲(chǔ)（見圖1）；使用OpenBabel 軟件導(dǎo)入已經(jīng)建立的格式文件，使用其convert功能，將小分子轉(zhuǎn)換成為SYBYL Molfile(*.mol 2)的三維結(jié)構(gòu)格式文件。量子化學(xué)軟件MOPAC在AM 1水平上對小分子的構(gòu)象進(jìn)行能量優(yōu)化，而且加上原子凈電荷（partial charge）。

1.2 大分子受體蛋白的分子動(dòng)力學(xué)模擬 GPR 17的UNIPROT編號為Q 13304，共有367個(gè)氨基酸。登陸GPCRRD數(shù)據(jù)庫（http://zhanglab.ccmb.med.umich.edu/ GPCRRD/），下載采用GPCR-I-TASSER算法構(gòu)建的GPR 17的三維模擬結(jié)構(gòu)(具體流程如圖3)。研究人員通過此算法已經(jīng)構(gòu)建了1028個(gè)人類GPCR的三維結(jié)構(gòu)。然而采用GPR 17的人工三維模擬結(jié)構(gòu)還不能直接用于分子對接。為了模擬真實(shí)情況，在進(jìn)行分子對接之前，本研究采用由美國伊利諾斯大學(xué)開發(fā)的分子動(dòng)力學(xué)模擬程序包NAMD 2.9（http://www.ks.uiuc.edu/ Research/namd/），將GPR 17插入磷脂雙層膜（DPPC膜，二棕櫚酸磷脂酰膽堿）中，進(jìn)行長時(shí)程的分子動(dòng)力學(xué)模擬。模擬體系用VMD 軟件（http://www.ks.uiuc.edu/Research/vmd/）構(gòu)建，在膜蛋白體系的上下層中加入水分子（2 nm厚），水分子采用TIP 3P模型；為了保證體系的電中性，加入濃度為0.15 M的KCL溶液（生理離子濃度）來中和體系，整個(gè)體系有367個(gè)氨基酸，133個(gè)磷脂分子，3047個(gè)水分子，27個(gè)陽性鉀離子，45個(gè)陰性氯離子，共有60301個(gè)原子。模擬過程中溫度保持在300 K，同時(shí)保持1個(gè)大氣壓的恒壓。為使該體系達(dá)到平衡，首先固定磷脂頭部和蛋白質(zhì)，用最陡下降法進(jìn)行 1000 步的能量優(yōu)化來優(yōu)化磷脂尾部和水分子，然后固定磷脂尾部和蛋白質(zhì)對磷脂頭部和水分子繼續(xù)進(jìn)行1000步能量優(yōu)化。體系平衡后進(jìn)行5 ns分子動(dòng)力學(xué)模擬，采用的是CHARMM 36力場[7]。

圖2 UDP和MRS 2179的化學(xué)結(jié)構(gòu)式

圖3 GPCR-I-TASSER算法流程圖

1.3 分子對接 GPR 17受體經(jīng)過5 ns分子動(dòng)力學(xué)模擬后，挑選一個(gè)合適的蛋白構(gòu)象用于分子對接，采用國際上廣泛使用的免費(fèi)分子對接軟件AutoDock 4.0（http://autodock. scripps.edu/），對接前，將GPR 17蛋白加極性氫，加Kollman United點(diǎn)電荷，保存為macro.pdbq文件。利用Autogrids程序設(shè)定格點(diǎn)（grid），為了探索GPR 17的活性口袋，我們將將格點(diǎn)平均數(shù)設(shè)為150×150×150，格點(diǎn)空間距離為0.375，用mkgpf 3程序生成.gpf文件。將小分子UDP和MRS 2179的原子類型匯總，輸入的參數(shù)準(zhǔn)備gpf文件和dpf文件，在dpf文件中，“ga_num_evals”和“ga_num_evaluations”用于限定程序收斂條件，決定運(yùn)算費(fèi)時(shí)長短。將ga_num_evals=10000000；ga_ run=100（默認(rèn)10）；ga_pop_size=300（默認(rèn)150）；其余參數(shù)采用AutoDock 4.0的默認(rèn)值。對接后，將受體-配體復(fù)合物再進(jìn)行5 ns的分子動(dòng)力學(xué)模擬，具體參數(shù)同上。

分子動(dòng)力學(xué)模擬計(jì)算在Linux集群系統(tǒng)上應(yīng)用GPU/ CUDA技術(shù)完成。

2 結(jié)果

GPR 17受體的動(dòng)力學(xué)優(yōu)化在模擬的磷脂雙層膜中進(jìn)行（如圖4）。分子動(dòng)力學(xué)結(jié)果表明，優(yōu)化體系達(dá)到平衡后，進(jìn)行5 ns的分子動(dòng)力學(xué)模擬，根據(jù)對均根方差（RMSD）的觀察，可以看出該蛋白結(jié)構(gòu)已經(jīng)達(dá)到穩(wěn)定。分子對接后，再進(jìn)行5 ns的分子動(dòng)力學(xué)模擬，蛋白復(fù)合物也達(dá)到穩(wěn)定（如圖5）。

圖4 GPR 17受體的分子動(dòng)力學(xué)模擬體系。

GPR 17位于P 2Y核苷酸受體和半胱氨酰白三烯受體家族的中間位置，通過研究P 2Y受體的結(jié)合位點(diǎn)可以為研究GPR 17與配體結(jié)合提供依據(jù)。研究表明，GPR 17的核苷酸結(jié)合區(qū)與P 2Y受體的核苷酸結(jié)合區(qū)位置相同，核苷酸結(jié)合口袋位于TM 3，TM 5，TM 6 and EL 2之間[8-9]。根據(jù)以往研究，對于所有的P 2Y-核苷酸受體配體復(fù)合物，核苷酸配體的磷酸鹽部分容納在由三個(gè)氨基酸3.29（第3個(gè)跨膜螺旋第29個(gè)氨基酸，余以此類推），7.39 和6.55組成的陽性離子口袋中，GPR 17的氨基酸Arg 283對應(yīng)于氨基酸 6.55，Gly 136對應(yīng)于氨基酸3.29，Ser 311對應(yīng)于氨基酸7.39，雖然Gly 136不能顯示支鏈的相互作用，但能提高支鏈的柔性。通過研究多個(gè)P 2Y 受體的EL 2（細(xì)胞膜外第2個(gè)loop，余以此類推），在GPR 17受體EL 2上存在一個(gè)重要的酸性氨基酸Glu 202，位于兩個(gè)保守的半胱氨酸之前，對于穩(wěn)定受體配體復(fù)合物起到重要作用。

圖5 GPR 17受體分子動(dòng)力學(xué)模擬體系的RMSD

圖6 分子對接結(jié)果

通過誘變研究P 2Y 1受體，氨基酸3.29和Asp 232 (EL 2)參與了由配體引起的受體激活，同時(shí)氨基酸3.29參與了與Glu 207(EL 2)的離子相互作用，這對于保持受體的基礎(chǔ)狀態(tài)非常重要。核苷酸的磷酸部分與Arg 131的支鏈相互作用，可以使Arg 131-Glu 207離子對去穩(wěn)定化，參與了受體激活。在GPR 17 TM 3上的氨基酸Arg 133，靠近氨基酸3.29，作為一個(gè)保守的陽離子氨基酸，Arg 133與Tyr 41，Tyr 200和Ser 224的支鏈形成一個(gè)穩(wěn)定的相互作用。在GPR 17，靠近氨基酸3.29的負(fù)離子氨基酸是Gln 211，能與Tyr 144 S，Ser 224和His 220形成穩(wěn)定的氫鍵。

分析分子對接的結(jié)果，小分子二磷酸尿苷(UDP)是GPR 17的天然配體之一，可作為激動(dòng)劑激活GPR 17受體，UDP與GPR 17的結(jié)合模式在圖6顯示，GPR 17的核苷酸結(jié)合位點(diǎn)與UDP的二磷酸鹽存在多個(gè)相互作用，使二磷酸鹽在活性口袋內(nèi)穩(wěn)定；Arg 283(6.55)的胍基部分和α和β-磷酸形成離子鍵；β-磷酸和Tyr 213(EL 2)，Tyr 140(TM 3)和Tyr 290(EL 3)的羥基形成一個(gè)氫鍵網(wǎng)絡(luò)，并與His 280 (TM 6)的支鏈相互作用；Gln 211(EL 2)與α-磷酸和β-磷酸結(jié)合；EL 2上的Gln 199，其支鏈指向細(xì)胞膜內(nèi)，在活性口袋內(nèi)接近UDP的磷酸部分，同時(shí)，His 220(TM 5)，Tyr 144(TM 3)，Ser 224(TM 5)和Tyr 279(TM 6)的支鏈也位于口袋內(nèi)。UDP的鳥苷環(huán)部分，主要與TM 1和TM 7的氨基酸存在極性相互作用，尿嘧啶的4-O部分與Ser 311(TM 7)和Tyr 66 (TM 1)的羥基部分作用，而3-NH部分與Ser 315(TM 7)作用；UDP的鳥苷環(huán)部分在活性口袋中存在大量疏水相互作用，包括與Tyr 179，Phe 139，Phe 276和Tyr 140；Asn 204（EL 2）和Ser 311(7.43)存在一個(gè)氫鍵，結(jié)構(gòu)保守的氨基酸Ser 311(7.43)，Tyr 66(1.39)和Phe 139(3.32)可以通過靜電相互作用固定尿嘧啶堿基，此外，保守的Arg 283(6.55)也參與結(jié)合UTP的尿嘧啶堿基。UDP的糖基部分與GPR 17的7 TM區(qū)域存在特殊聯(lián)系，核糖的2'-OH部分與Asn 142(3.55)和Thr 314(7.42)形成氫鍵，3'-OH指向TM 6，但是沒有直接參與任何特殊的氫鍵。

本研究還模擬了一個(gè)選擇性P 2Y受體拮抗劑MRS 2179與GPR 17的相互作用，MRS 2179作為核糖核苷酸類似物，結(jié)合在GPR 17受體同樣的口袋中，如圖5，MRS 2179的磷酸部分與Arg 255殘基存在有靜電相互作用，而且，3'和5'磷酸鏈通過氫鍵穩(wěn)定在口袋中。3'-磷酸部分形成氫鍵通過His 280(TM 6)的支鏈(N 1)；Tyr 144(TM 3)的羥基部分與3'-磷酸部分的氧原子相互作用。Gln 211(EL 2)的NH 2部分與MRS 2179的3'-磷酸部分形成氫鍵。The 5'-磷酸部分與Tyr 213(EL 2)，Thr 203(EL 2) and Tyr 279 (TM 6)的羥基部分形成氫鍵。

MRS 2179的腺嘌呤部分，N 7與Arg 115(TM 2)相互作用，N 6與Ser 7.43(TM 7)相互作用，N 1與Asn 142(TM 3)相互作用，N 3與Phe 139的骨架相互作用。在活性口袋中，Phe 139和Phe 276殘基的疏水部分容納核苷。

對于UDP和MRS 2179，一個(gè)主要的相互作用參與磷酸部分 (尤其是α-磷酸)與堿性Arg 283殘基?？傊?，受體的主要功能區(qū)結(jié)合UDP，MRS 2179重疊。尿苷的原子1與腺嘌呤的N 9重疊，MRS 2179的3'-磷酸部分與UDP的α-磷酸部分重疊，然而核糖占據(jù)相同空間區(qū)域在螺旋束中間。

總之，對于UDP，尿嘧啶環(huán)與TM 7，TM 3和TM 1結(jié)合，指向TM 1和TM 2，雙磷酸部分與TM 3和TM 6結(jié)合，并指向TM 5，TM 6和EL 2。對于MRS 2179，腺嘌呤環(huán)結(jié)合TM 7和TM 3并指向TM 1和TM 2，磷酸部分結(jié)合在TM 3、TM 7、TM 6和EL 2，5'-磷酸指向EL 2，3'-磷酸指向TM 5和TM 6。

3 討論

在大鼠局灶性缺血模型，體內(nèi)敲除GPR 17基因或者注射P 2Y/CysLT拮抗劑可以減少缺血損傷的進(jìn)程，揭示GPR 17是一個(gè)新型的神經(jīng)治療靶點(diǎn)。研究GPR 17的結(jié)構(gòu)和配體結(jié)合機(jī)制對于研發(fā)選擇性和潛在的藥物是非常必要的。

目前大多數(shù)研究GPR 17是通過基因干擾等手段，然而對其結(jié)構(gòu)的構(gòu)建與分析必須借助計(jì)算機(jī)模擬的方法，研究表明，在1321 N 1細(xì)胞，異源性表達(dá)GPR 17，阻滯白三烯結(jié)合位點(diǎn)采用CysLT 拮抗劑并不能取消尿嘧啶的反應(yīng)，然而，阻滯核苷酸位點(diǎn)可以允許白三烯LTD 4起反應(yīng)[10-11]，這些現(xiàn)象僅通過生物實(shí)驗(yàn)是無法揭示其機(jī)制的。

本研究采用計(jì)算機(jī)分子模擬的方法，采用同源模建的方法構(gòu)建的GPR 17三維結(jié)構(gòu)，將其置于磷脂雙膜中進(jìn)行長時(shí)程的分子動(dòng)力學(xué)模擬，然后將激動(dòng)劑以及拮抗劑分別對接進(jìn)GPR 17的活性口袋中。計(jì)算機(jī)模擬的方法可以將分子的微觀世界形象表達(dá)出來，不僅直觀準(zhǔn)確，而且節(jié)約了人力物力，特別是對于一些實(shí)驗(yàn)室無法開展的生物實(shí)驗(yàn)更具優(yōu)勢。

GPR 17作為一個(gè)新型的“雙雜交受體”，我們的計(jì)算機(jī)模擬研究幫助設(shè)計(jì)雙靶向配體治療神經(jīng)退行性病變，隨著技術(shù)不斷進(jìn)步，對中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)GPR 17分子特性以及作用的深入研究，必將推進(jìn)中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的研究進(jìn)展，并且也為尋找防治手段開辟新的途徑。

[1] Harvey K，Marchetti B.Regulating Wnt signaling:a strategy to prevent neurodegeneration and induce regeneration[J].J Mol Cell Biol,2014,6(1):1-2.

[2] Varnum MM,Ikezu T.The classification of microglial activation phenotypes on neurodegeneration and regeneration in Alzheimer's disease brain[J].Arch Immunol Ther Exp (Warsz),2012,60(4):251-266.

[3] Rambukkana A.Usage of signaling in neurodegeneration and regeneration of peripheral nerves by leprosy bacteria[J].Prog Neurobiol,2010,91(2):102-107.

[4] Salmina AB Inzhutova AL,Malinovskaya NA,et al.Endothelial dysfunction and repair in Alzheimer-type neurodegeneration:neuronal and glial control[J].J Alzheimers Dis,2010,22(1):17-36.

[5] Ceruti S.The P2Y-like receptor GPR17 as a sensor of damage and a new potential target in spinal cord injury[J].Brain,2009,132(Pt 8):2206-2218.

[6] Lecca D.The recently identified P 2Y-like receptor GPR 17 is a sensor of brain damage and a new target for brain repair[J].PLoS One,2008,3(10):e 3579.

[7] Huang J，MacKerell AD Jr.CHARMM 36 all-atom additive protein force field:validation based on comparison to NMR data[J].J Comput Chem,2013,34(25):2135-2145.

[8] Abbracchio MP.Characterization of the UDP-glucose receptor (re-named here the P 2Y 14 receptor) adds diversity to the P 2Y receptor family[J]. Trends Pharmacol Sci,2003,24(2):52-55.

[9] Schulz A,Schoneberg T.The structural evolution of a P 2Y-like G-protein-coupled receptor[J].J Biol Chem,2003,278(37):35531-35541.

[10] Pugliese AM.Functional characterization of two isoforms of the P 2Y-like receptor GPR 17:[35 S]GTPgammaS binding and electrophysiological studies in 1321 N 1 cells[J].Am J Physiol Cell Physiol,2009,297(4):C 1028-1040.

[11] Qi AD，Harden TK，Nicholas RA,Is GPR 17a P 2Y/leukotriene receptor? examination of uracil nucleotides，nucleotide sugars，and cysteinyl leukotrienes as agonists of GPR 17[J].J Pharmacol Exp Ther,2013,347(1):38-46.

Objective Looking for a high selectivity GPR 17 receptor antagonists for the treatment of neurodegenerative diseases is of great significance. Methods This study on GPR 17 three-dimensional structure after long time history of the molecular dynamics simulation, Use AutoDock software will GPR 17 agonist UDP (ii) uridine phosphate, antagonists MRS 2179 butt into active pocket, and analyzes the combination model. Results GPR 17 nucleotides in combination with pockets, similar to other P 2Y receptors antagonists UDP, MRS 2179 can combine with GPR 17, specific form stable complex conformation, including Arg 255 played a key role in the process of ligand recognition. Conclusion This study for the design of new GPR 17 receptor antagonists provides theoretical guidance.

Neurodegenerative diseases; GPR 17; Molecular docking; Molecular dynamics

10.3969/j.issn.1009-4393.2014.33.001

廣東省自然科學(xué)基金 (S 2012010009215）

安徽 510080 安徽省兒童醫(yī)院神經(jīng)外科 （葉桓） 230032 安徽醫(yī)科大學(xué)人體解剖學(xué)教研室；廣東 510080 中山大學(xué)中山醫(yī)學(xué)院人體解剖學(xué)教研室（劉述）

劉述 E-mail：mrliushu@126.com