五倍子對草魚白細(xì)胞數(shù)量和兩種酶活性的影響

董艷珍　肖文淵

摘 要：將12尾草魚置于添加有2.5mg/L濃度的五倍子水體中飼養(yǎng)25d，在試驗(yàn)前和試驗(yàn)第5d、10d、15d、20d、25d分別測定草魚的白細(xì)胞數(shù)量、過氧化氫酶活性和堿性磷酸酶活性。結(jié)果表明：草魚白細(xì)胞數(shù)量隨時(shí)間延長先增加后減少，在第20d達(dá)到最大值4.55×104個(gè)/mm3；血清過氧化氫酶活性變化不明顯，在1.63～1.80U/mL內(nèi)波動；血清堿性磷酸酶活性隨時(shí)間延長而先升高后降低，在第20d達(dá)到最大值8.37金氏/100mL。

關(guān)鍵詞：五倍子；草魚；白細(xì)胞；過氧化氫酶；堿性磷酸酶

中圖分類號 S965.1 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A 文章編號 1007-7731（2014）11-132-02

Abstract：12 grass carp were cultured in water with addition of 2.5mg/L of gallnut. Before the test and on the 5d，20d， 15th，20th，and 25d the leukocyte number，activity of serum catalase and alkaline phosphatase of were determined. Results showed that the number of leukocyte of grass carp increased first and then decreased with prolonging of time，and on the 20d it reached the maximum value of 4.55×104/mm3；the change of catalase activity was not significantly，varying from 1.63 to 1.80U/mL；alkaline phosphatase activity increased first and then decreased， and reached the maximum 8.37 Guinness /100mL on the 20d.

Key words：Gallnut；Grass carp；Leukocyte；Catalase；Alkaline phosphatase

草魚肉質(zhì)鮮嫩，營養(yǎng)價(jià)值高，飼料來源廣，生長速度快，是我國池塘、水庫養(yǎng)殖的主要品種之一。但由于池塘水環(huán)境、飼料及飼養(yǎng)管理水平等諸多因素的影響，造成草魚養(yǎng)殖中病害頻發(fā)，死亡率高，抗生素、促生長劑、殺蟲藥等的大量使用，造成藥物在魚體內(nèi)大量富集殘留和病原體的抗藥性等不良后果，使水產(chǎn)品質(zhì)量下降，既危害了人類健康，又污染了環(huán)境，嚴(yán)重影響了草魚池塘養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展和經(jīng)濟(jì)效益的提高。安全生產(chǎn)無公害水產(chǎn)品已經(jīng)成為水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)可持續(xù)發(fā)展的關(guān)鍵[1]。中草藥具有來源廣泛、價(jià)廉效優(yōu)、毒副作用小、抗藥性不顯著、不易形成機(jī)體藥物殘留和影響水產(chǎn)品質(zhì)量、提高水產(chǎn)動物免疫力和抗病力等優(yōu)點(diǎn)，在我國養(yǎng)殖業(yè)集約化追求綠色、環(huán)保、生態(tài)的浪潮推動下，其以提高免疫功能方面的獨(dú)特優(yōu)勢，得到了越來越普遍的推廣和應(yīng)用，在水產(chǎn)養(yǎng)殖中具有重要意義[2]。

五倍子為五倍子蚜寄生于鹽膚木、青麩楊、紅麩楊上而形成的蟲癭；主要成分為沒食子酸和鞣酸，抗菌范圍廣，是用于治療水產(chǎn)動物細(xì)菌性疾病的外用藥[3]。五倍子作為水產(chǎn)動物藥物的報(bào)道較多，但多集中在其抗菌活性方面。如鄭曙明等對復(fù)方五倍子有效成分進(jìn)行了分離鑒定及抑菌活性研究 [4]；姜蕾等研究了五倍子對3種致病菌的體外抑菌效果和對魚體急性毒性試驗(yàn)，得出五倍子具有較強(qiáng)的抑菌殺菌效果[5]。但有關(guān)五倍子對草魚免疫機(jī)能影響的報(bào)道很少，本文主要探究五倍子對草魚白細(xì)胞數(shù)量、血清過氧化氫酶（CAT）、堿性磷酸酶（AKP）活性的影響。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)魚 試驗(yàn)用草魚12尾，購自西昌市場，魚體健壯，體長15±1.5cm，體重70±3g。

1.2 試驗(yàn)藥品 五倍子藥劑：稱取五倍子2g，加水煎煮20min熬制成1L藥液（濃度為2 000mg/L），藥液裝入密閉的試劑瓶中，置于冰箱4℃保存。10%草酸鉀溶液，白細(xì)胞稀釋液等。

1.3 試驗(yàn)儀器 722型分光光度計(jì)、75BG型紫外可見光分光光度計(jì)、HHW-600型恒溫水箱、可調(diào)微量進(jìn)樣器、RJ-TGL-16GA型高速冷凍離心機(jī)。

1.3 試驗(yàn)魚的飼養(yǎng)管理 將12尾草魚暫養(yǎng)在60cm×45cm×45cm規(guī)格的魚缸中，水深30cm，水溫21～24℃，暫養(yǎng)2d后開始試驗(yàn)。采用多次給藥方式，將五倍子藥液潑灑于魚缸中浸泡魚體，試驗(yàn)期間五倍子濃度保持在2.5mg/L，每5d采用虹吸法換1/3水并補(bǔ)充藥量至初始濃度，同時(shí)加入事先曝氣48h的自來水至30cm處。試驗(yàn)期間不投餌，試驗(yàn)前及試驗(yàn)開始后第5d、10d、15d、20d、25d分別測定草魚的白細(xì)胞數(shù)量、血清過氧化氫酶活性和堿性磷酸酶活性。

1.4 草魚白細(xì)胞數(shù)量、CAT及AKP活性的測定

1.4.1 白細(xì)胞計(jì)數(shù) 每次取魚2尾，采用斷尾采血法，將血滴在有0.3mL10%草酸鉀溶液的小燒杯中，混勻，制成抗凝血；用微量吸管吸取20μL抗凝血加入對應(yīng)的白細(xì)胞稀釋液中，輕輕搖勻備用；將白細(xì)胞懸濁液充入計(jì)數(shù)池，室溫中平放3min待細(xì)胞下沉后于高倍鏡下下計(jì)數(shù)。計(jì)數(shù)四角大方格內(nèi)白細(xì)胞總數(shù)。計(jì)數(shù)室4個(gè)大方格容積為1×1×0.1×4=0.4mm3，稀釋倍數(shù)為稀釋液體積8mL÷血0.02mL=40倍，計(jì)數(shù)公式如下：

血液白細(xì)胞數(shù)（個(gè)/mm3）=4個(gè)大方格中白細(xì)胞數(shù)×稀釋倍數(shù)÷4個(gè)大方格容積

1.4.2 酶活性測定 每次取魚2尾采血，在4℃以3000r/min離心10min，制得血清備用。過氧化氫酶（CAT）活性的測定采用Bruno Stellmach的紫外分光光度法[6]；堿性磷酸酶（AKP）活性的測定采用標(biāo)準(zhǔn)曲線法[6]。endprint

2 結(jié)果與分析

2.1 五倍子對草魚白細(xì)胞數(shù)量的影響 五倍子對草魚白細(xì)胞數(shù)量的影響見表1。在試驗(yàn)后20d內(nèi)白細(xì)胞數(shù)量呈遞增的趨勢，在第20d達(dá)到最大值，為4.55×104個(gè)/mm3，在第25d白細(xì)胞數(shù)目略有下降，為3.96×104個(gè)/mm3，但仍高于試驗(yàn)前數(shù)量。說明2.5mg/L濃度的五倍子對草魚白細(xì)胞數(shù)量的增加有一定的促進(jìn)作用。

2.3 五倍子對草魚血清堿性磷酸酶活性的影響 五倍子對草魚血清堿性磷酸酶活性的影響見表3。試驗(yàn)前，草魚血清堿性磷酸酶活性為7.26金氏/100mL；在試驗(yàn)的前15d草魚血清堿性磷酸酶活性逐漸高，并在第15d達(dá)到最大值，為8.37金氏/100mL；15d后，草魚血清堿性磷酸酶活性有所降低，在第20d降為7.89金氏/100mL，在第25d降為7.65金氏/100mL，但整體而言，施藥后草魚血清堿性磷酸酶活性比施藥前有所升高，由此說明，2.5mg/L濃度的五倍子能夠一定程度地提高草魚血清堿性磷酸酶活性。

3 討論

（1）我國五倍子產(chǎn)量較大，分布很廣，便于大規(guī)模開發(fā)生產(chǎn)，同時(shí)五倍子作為傳統(tǒng)中藥積累了大量的藥物配方，五倍子在水產(chǎn)養(yǎng)殖中主要為外用藥，施藥方便?？梢灶A(yù)見，隨著五倍子各種活性物質(zhì)的不斷發(fā)現(xiàn)和作用機(jī)理的明晰，其在水產(chǎn)養(yǎng)殖上的應(yīng)用前景將會越來越廣闊，必將產(chǎn)生巨大的經(jīng)濟(jì)效益和社會效益[7]。

（2）白細(xì)胞是魚類體內(nèi)一種能吞噬異物、具有免疫和自我保護(hù)能力的物質(zhì)，當(dāng)魚類生存的外界環(huán)境發(fā)生變化，為抵御外來毒害以及更好的適應(yīng)環(huán)境，就會出現(xiàn)白細(xì)胞數(shù)目大量增多的現(xiàn)象[8]。本試驗(yàn)中草魚白細(xì)胞數(shù)目隨時(shí)間的變化有所增加，在0d～20d呈逐漸上升趨勢，在20d數(shù)目達(dá)到最大值，在第25d有所下降，這說明2.5mg/L濃度的五倍子對草魚白細(xì)胞數(shù)目的增加有一定的促進(jìn)作用，從而提高魚體免疫機(jī)能，達(dá)到預(yù)防疾病的效果。

（3）過氧化氫酶（CAT）能將細(xì)胞代謝所產(chǎn)生的H2O2迅速加以清除，從而保護(hù)血紅蛋白、巰基酶、膜蛋白 [1]。本試驗(yàn)中CAT活性雖在第10d和第20d有不同程度的提高，總體來說，五倍子對草魚血清CAT活性影響不明顯。

（4）堿性磷酸酶（AKP）幾乎存在于身體各種組織中，是膜結(jié)合酶，在腸上皮、腎小管、成骨細(xì)胞、肝臟及白細(xì)胞中尤其豐富。血清中AKP主要來源于肝和骨髓。AKP活性的測定對于機(jī)體免疫功能的探究和疾病的預(yù)防具有非常重要的意義[1]。本試驗(yàn)中，在第0d～第15d草魚血清堿性磷酸酶活性有一定程度的提高，在第15d達(dá)到最大值，為8.37金氏/mL，在第20d和第25d有所下降。2.5mg/L濃度的五倍子對草魚血清堿性磷酸酶活性有一定的促進(jìn)作用。

參考文獻(xiàn)

[1]李赫，宋文華，于翔.幾種免疫增強(qiáng)劑對草魚SOD、CAT 及 AKP活性的影響[J].水產(chǎn)學(xué)雜志，2010，23（4）：6-9.

[2]齊遵利，張秀文，韓敘.中草藥對水產(chǎn)動物免疫促進(jìn)作用的研究進(jìn)展[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010，38（20）：10 734-10 736.

[3]姜蕾， 鄭曙明.五倍子對鯉魚細(xì)菌性敗血癥的藥效試驗(yàn)初報(bào)[J].中國農(nóng)學(xué)通報(bào)， 2006，22（5）：460-464.

[4]鄭曙明，黃建軍，吳青等.復(fù)方五倍子有效成分的分離鑒定及抑菌活性研究[J].水生生物學(xué)報(bào)， 2010，34（1）：57-64.

[5]姜蕾， 鄭曙明.五倍子對3種致病菌的體外抑菌和急性毒性試驗(yàn)[J].水利漁業(yè)，2005，25（6）：89-90.

[6]Bruno Stellmach（錢嘉淵 譯）酶的測定方法[M].北京：中國輕工業(yè)出版社，1992：168-194.

[7]李秀萍，李春遠(yuǎn)，渠桂榮等.五倍子的研究概況[J].中醫(yī)藥學(xué)報(bào)，2002，30（3）：72-74.

[8]田娟，冷向軍，李小勤，等.復(fù)方中草藥制劑對草魚生長性能、肌肉成分和血清非特異性免疫的影響[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2008，36（28）：12 282-12 284. （責(zé)編：張長青）endprint