GSTT 1基因多態(tài)性及吸煙與胃癌的關(guān)系

史劍權(quán) 駱寶建 劉榮英 陳言東

1.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京胸科醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科，北京 101149；2.包頭醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院，內(nèi)蒙古 包頭 014030

胃癌（gastric cancer，GC）的發(fā)生是一個多因素、多階段的過程，它與環(huán)境致癌物、個體的遺傳易感性等因素密切相關(guān)，因此，與環(huán)境致癌物代謝有關(guān)的代謝酶（包括GST家族、CYP家族等）基因多態(tài)性的問題成了當(dāng)前腫瘤研究的一個重要方向。GSTT1作為谷胱甘肽 S-轉(zhuǎn)移酶 （glutathione-s-transferase，GSTs，EC2.5.1.18）家族的重要成員，其基因多態(tài)性（包括存在型和缺失型）與腫瘤的關(guān)系，也就引起了國內(nèi)外學(xué)者的關(guān)注。近年來，國內(nèi)外的研究報道表明GSTT1基因缺失型與肺癌[1]、肝癌[2]、胰腺癌[3]等多種腫瘤的易感性有關(guān)。關(guān)于GSTT1基因多態(tài)性與胃癌遺傳易感性方面的研究，結(jié)論尚不統(tǒng)一[4]。本研究中，通過研究吸煙（環(huán)境因素）和GSTT1基因多態(tài)性（遺傳因素）對胃癌發(fā)生的影響，為胃癌的病因研究以及一級預(yù)防提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來源

所有胃癌病例均來源于內(nèi)蒙古消化病研究所（設(shè)于包頭醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院）和包頭市腫瘤醫(yī)院。所有胃癌病例均由組織病理學(xué)檢查確診為胃癌。對照組的個體均來自于當(dāng)?shù)嘏懦[瘤病史的一般人群。所有標(biāo)本收集的起止時間為2005年5月～2006年3月。胃癌組患者60例，男43例，女17例，年齡（55.60±8.14）歲；對照組83例，男53例，女30例，年齡（56.33±7.90）歲。胃癌組和對照組的年齡和性別比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。

1.2 流行病學(xué)調(diào)查

由經(jīng)過培訓(xùn)的醫(yī)護(hù)人員，對所有研究對象（胃癌組和對照組）進(jìn)行包括性別、年齡、吸煙情況的流行病學(xué)調(diào)查。對吸煙情況分為“不吸煙”和“吸煙”兩種。其中，“吸煙”規(guī)定為每天至少吸1支煙，持續(xù)1年以上者，達(dá)不到這一標(biāo)準(zhǔn)者規(guī)定為“不吸煙”。

1.3 主要試劑

①Taq DNA 聚和酶，dNTPs，DNA Marker，無菌去離子水均購于加拿大上海Songon生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司。②瓊脂糖、EB、Tris、EDTA、硼酸、溴酚蘭均購于北京鼎國生物技術(shù)有限公司。③DNA提取液：由內(nèi)蒙古基因診斷研究所提供。

1.4 GSTT1基因型的檢測

1.4.1 DNA的提取 取胃癌組患者及對照組的人外周血2 mL，置入加有EDTA的抗凝試管中，于半小時內(nèi)置于-20℃低溫冰箱中冷凍保存或立即進(jìn)行基因組DNA的提?。ㄌ崛》椒ㄓ蓛?nèi)蒙古基因診斷中心提供）。

1.4.2 PCR擴(kuò)增 應(yīng)用聚合酶鏈反應(yīng)PCR方法擴(kuò)增基因組DNA，參照文獻(xiàn)[5]，構(gòu)建GSTT1和β-珠蛋白基因的引物（表 1），其中，β-珠蛋白（268 bp）作為內(nèi)對照。所有的引物序列均經(jīng)美國生物信息中心（national center for biotechnology information，NCBI） 的序列比對工具 （basic local alignment search tool，BLAST） 的驗證，并由加拿大上海Songon生物技術(shù)有限公司合成（PAGE純化）。GSTT1基因引物序列為正義鏈5'-TTCCTTACTGGTCCTCACATCTC-3'， 反 義鏈 5'-TCACCGGATCATGGCCAGCA-3'。β-珠蛋白基因引物序列為正義鏈5'-GAAGAGCCAAGGACAGGTAC-3'，反義鏈5'-CAACTTCATCCACGTTCACC-3'。PCR反應(yīng)體系 15 μL，其中包括模板 DNA 3 μL，GSTT1 和β-珠蛋白的上下游引物（濃度為 25 μmol/L）各 0.3 μL、dNTP （濃度為 25 mM）0.3 μL、10×buffer 1.5 μL、Tag酶（濃度 5 U/μL）為 0.35 μL、MgCl2（濃度為 25 mM）1.3 μL、無菌去離子水 7.35 μL。上 PCR 儀，PCR 反應(yīng)循環(huán)參數(shù)：95℃預(yù)變性 5 min，94℃變性 45 s，60e退火45 s，73℃延伸 45 s，共 36 個循環(huán)，最后再 73℃延伸10 min后終止擴(kuò)增。

1.4.3 電泳 取PCR產(chǎn)物15 μL，加2 μL TEB緩沖液，3%瓊脂糖凝膠電泳，EB染色，紫外燈下觀察結(jié)果。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

所有的統(tǒng)計分析以及統(tǒng)計圖的繪制均采用SPSS 13.0軟件包。①計量資料的組間比較采用t檢驗，計數(shù)資料的組間比較采用χ2檢驗，雙側(cè)檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。②吸煙、GSTT1基因型的聯(lián)合作用與胃癌的關(guān)系采用分層分析，以比值比OR及其95%的可信區(qū)間（confidence interval，CI）表示相對危險度。

2 結(jié)果

2.1 GSTT1基因型的檢測結(jié)果

GSTT1擴(kuò)增產(chǎn)物的大小為480 bp，內(nèi)對照β-珠蛋白產(chǎn)物的大小為268 bp，同時出現(xiàn)480 bp及268 bp兩條帶者即為GSTT1基因存在型，用GSTT1（+）表示；只出現(xiàn)268 bp一條帶（β-珠蛋白基因）者為GSTT1基因缺失型，用 GSTT1（-）表示，見圖 1。其中，1、3、4 泳道為 GSTT1基因存在型，2、5、6泳道為 GSTT1基因缺失型，M為marker。

圖1 GSTT1和β珠蛋白基因PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果

2.2 胃癌組及對照組GSTT1基因型分布的比較

分別對胃癌組60例和對照組83例進(jìn)行了GSTT1基因檢測，結(jié)果表明，胃癌組GSTT1（-）例數(shù)為34 例，GSTT1（+）例數(shù)為 26 例；同時，對照組中，GSTT1（-）例數(shù)為 33 例，GSTT1（+）例數(shù)為 50 例。GSTT1 基因缺失率為56.7%（34/60），明顯高于對照組的39.8%（33/83），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=3.998，P＜0.05）。攜帶GSTT1（-）基因型者發(fā)生胃癌的危險性是攜帶GSTT1（+）基因型者的 1.98 倍（OR=1.98，95%CI：1.01～3.89）。

2.3 胃癌組及對照組吸煙情況的比較

分別調(diào)查胃癌組和對照組的吸煙情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，胃癌組中吸煙者的例數(shù)為39例，不吸煙的例數(shù)為21例；對照組中，吸煙者的例數(shù)為29例，不吸煙的例數(shù)為54例。胃癌組中吸煙者的比例為65.0%（39/60），高于對照組34.9%（29/83），組間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。吸煙者發(fā)生胃癌的危險性是非吸煙者的 3.458 倍（OR=3.458，95%CI：1.723～6.939）。

2.4 GSTT1基因型及吸煙與胃癌的關(guān)系

2.4.1 根據(jù)是否吸煙分層分析GSTT1基因型與胃癌的關(guān)系 不吸煙人群中，胃癌組和對照組的GSTT1基因型分布差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P ＞ 0.05），GSTT1（-）基因型未顯著增加不吸煙者患胃癌的風(fēng)險。吸煙人群中，胃癌組和對照組的GSTT1基因型分布差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；并且，吸煙人群中，GSTT1缺失型的人患胃癌的風(fēng)險性是GSTT1存在型的4.75倍（P=0.003，OR=4.75，95%CI：1.68～13.41），即 GSTT1（-）基因型顯著增加吸煙者患胃癌的風(fēng)險。見表1。

表1 根據(jù)吸煙情況分層分析GSTT1基因型與胃癌的關(guān)系（例）

2.4.2 根據(jù)GSTT1基因型分層分析吸煙與胃癌的關(guān)系 GSTT1（+）人群中，吸煙者在胃癌組和對照組中的分布無顯著性差異（P＞0.05），吸煙未明顯增加GSTT1（+）人群患胃癌的風(fēng)險。GSTT1（-）人群中，吸煙者在胃癌組和對照組中的分布差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；并且，GSTT1（-）人群中，吸煙者患胃癌的風(fēng)險性是不吸煙者的 11.6 倍（OR=11.6，95%CI：3.516～28.266），即吸煙顯著增加GSTT1（-）人群患胃癌的風(fēng)險。見表2。

表2 根據(jù)GSTT1基因型分層分析，吸煙與胃癌的關(guān)系（例）

3 討論

胃癌目前依然是導(dǎo)致惡性腫瘤相關(guān)死亡的第2位疾病[6]，具有發(fā)病率高、轉(zhuǎn)移率高、病死率高、早期診斷率低、5年生存率低等特點[7]，給家庭和社會帶來極大危害，因此，進(jìn)行胃癌的病因?qū)W研究，篩選胃癌的易感基因和高危人群，對胃癌進(jìn)行有效的一級預(yù)防（病因預(yù)防），就具有十分重要的意義。

谷胱甘肽轉(zhuǎn)硫酶是人體內(nèi)一組具有重要解毒作用的多基因酶家族，屬Ⅱ相代謝酶；它參與致癌物的代謝，是體內(nèi)重要的解毒機制[8]。目前，將人的胞漿型GSTs同工酶分為四種，即α、μ、π和θ，分別由不同的基因編碼。編碼GST-θ同功酶的GSTT1基因定位于人類22號染色體q11.23。GSTT1基因在人群中具有基因缺失多態(tài)性，可分為存在型GSTT1（+）和缺失型GSTT1（-），亦即一些人不具有GSTT1基因。大量研究表明，不同種族、不同地域的群體，GSTT1基因缺失型的頻率差異很大，GSTTl基因缺失型在非洲、亞洲、歐洲人群中分布頻率分別為 15%～26%、16%～64%和10%～21%[9]。本研究中，通過分析對照組，提示內(nèi)蒙古地區(qū)一般人群GSTT1基因缺失頻率為39.8%。

不具有GSTT1基因的個體，由于體內(nèi)GSTT1基因的缺失，導(dǎo)致機體不能產(chǎn)生有活性的GST-θ同功酶，進(jìn)而不能有效去除體內(nèi)親電子致癌物，這可能增加了體細(xì)胞突變的風(fēng)險并最終導(dǎo)致腫瘤的形成[10]，所以，GSTT1基因多態(tài)性可能與癌癥易感性有關(guān)。本實驗中，胃癌組GSTT1基因缺失率為56.7%，顯著高于對照組的39.8%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。攜帶GSTT1（-）基因型者發(fā)生胃癌的危險性比 GSTT1（+）者明顯升高（OR=1.98，95%CI：1.01～3.89），提示GSTT1基因缺失型是胃癌的易感基因型。這與Palli等[11]、Zhao 等[12]學(xué)者的結(jié)論一致；但同時 Nguyen 等[13]、García-González等[14]報道胃癌組和對照組GSTT1基因型頻度分布的差異無顯著性。國外另一項Meta分析的結(jié)果顯示[15]，GSTT1基因多態(tài)性對不同種族人群胃癌易感性的作用不同：在白種人中GSTT1缺失增加患胃癌風(fēng)險，在黃種人中GSTT1缺失未增加患胃癌風(fēng)險。不同作者報道不同種族、不同地區(qū)GSTT1基因多態(tài)性與胃癌易感性關(guān)系的研究結(jié)果的不一致，其原因是多方面的：不同地區(qū)、不同種族人群中環(huán)境因素、生活習(xí)慣、遺傳特征的差異；胃癌是多種基因、多種環(huán)境因素長期相互作用的結(jié)果，某種致癌的環(huán)境因素可能會掩蓋個體GSTT1基因缺失在胃癌發(fā)病過程中所起的作用；不同研究中樣本選擇、樣本量大小、研究方法的差異。

煙草燃燒所產(chǎn)生的煙霧中，至少有43種為已知的致癌物[16]，吸煙是一種公認(rèn)的致癌因素。本研究中，胃癌組的吸煙率明顯高于對照組（P＜0.05），吸煙者相對非吸煙者，患胃癌的風(fēng)險顯著上升（OR=4.75），吸煙是胃癌的危險因素之一，這與Nomura等[17]的觀點一致。同時，GSTT1編碼的GST-θ同工酶在煙草中的致癌物：乙烯氧化物、環(huán)氧丁烷、烴類氧化物的解毒第二時相發(fā)揮作用，所以，GSTT1編碼的酶的缺失將可能導(dǎo)致煙草中的有害致癌物的解毒障礙，增加相應(yīng)人群致癌的危險性。近年來，代謝酶系基因多態(tài)性、吸煙與腫瘤易感性相互關(guān)系的研究備受關(guān)注。本研究中，通過兩組分層分析（見表1、2）可看出：①GSTT1（-）基因型未明顯增加不吸煙人群患胃癌的風(fēng)險（P＞0.05）；但GSTT1（-）基因型會顯著增加吸煙人群患胃癌的風(fēng)險（OR=4.75，95%CI：1.68～13.41）。②吸煙未明顯增加GSTT1（+）人群患胃癌的風(fēng)險性（P＞0.05）；但吸煙會顯著增加GSTT1（-）人群發(fā)生胃癌的風(fēng)險（OR=11.6，95%CI：3.516～28.266）。GSTT1（-）基因型且吸煙的人，患胃癌的風(fēng)險明顯提高。GSTT1缺失基因型和吸煙協(xié)同作用，共同增加發(fā)生胃癌的風(fēng)險。

總之，本研究認(rèn)為，胃癌的發(fā)生涉及到多種環(huán)境因素及遺傳因素長期的相互作用。在內(nèi)蒙古地區(qū)，GSTT1缺失基因型是胃癌的易感基因型，吸煙是胃癌的危險因素之一，吸煙和GSTT1（-）基因在胃癌的發(fā)生中有協(xié)同作用。對于GSTT1基因缺失的這類胃癌的高危人群，應(yīng)特別加強教育，使其改善生活習(xí)慣，盡量杜絕主動吸煙和被動吸煙，定期體檢，預(yù)防胃癌的發(fā)生。

[1]Dzian A，Halasova E，Matakova T，et al.Lung adenocarcinoma and squamous cell carcinoma in association with genetic polymorphisms of GSTs in Slovak population[J].Neoplasma，2012，59（2）：160-167.

[2]Chen J，Ma L，Peng NF，et al.Relationship between GSTT1 gene polymorphism and hepatocellular carcinoma in patients from China[J].Asian Pac J Cancer Prev，2012，13（9）：4417-4421.

[3]Bu X，Zhao C.Significant association between GSTT1 null genotype and susceptibility to pancreatic cancer[J].Mol Biol Rep，2013，40（7）：4295-4299.

[4]曹亞.腫瘤學(xué)[M].2版.北京：人民衛(wèi)生出版社，2003：24.

[5]Srivastava DS，Mandhani A，Mittal B，et al.Genetic polymorphism of glutathione S-transferase genes （GSTM1，GSTT1 and GSTP1）and susceptibility to prostate cancer in Northern India[J].BJU Int，2005，95（1）：170-173.

[6]聞旭陽，戴廣海.hMLH1基因啟動子CpG島甲基化，微衛(wèi)星不穩(wěn)定與胃癌[J].中國醫(yī)藥導(dǎo)報，2011，8（7）：9-11.

[7]陳玉敏，王金林，師鎖江，等.胃癌患者外周血中CK-19的表達(dá)及其臨床意義[J].中國醫(yī)藥導(dǎo)報，2013，10（14）：4-6.

[8]張力為，伊力亞爾·夏合丁，吳明拜，等.致癌物代謝酶基因（CYP2C19、GSTT1）多態(tài)性與哈薩克族人群食管癌發(fā)病風(fēng)險關(guān)系的研究[J].實用腫瘤雜志，2009，24（3）：232-236.

[9]Cotton SC，Sharp L，Little J，et al.Glutathione S-transferase polymorphisms and colorectal cancer a HuGE review[J].Am J Epidemiol，2000，151（1）：7-32.

[10]王雪峰，戴路明，張繼先.Ⅰ、Ⅱ相代謝酶基因多態(tài)性與肺癌遺傳易感性研究進(jìn)展[J].臨床肺科雜志，2008，13（9）：1162-1164.

[11]Palli D，Saieva C，Gemma S，et al.GSTT1 and GSTM1 gene polymorphisms and gastric cancer in a high-risk italian population[J].Int J Cancer，2005，115（2）：284-289.

[12]Zhao Y，Luo Y，Huang B，et al.GSTT1 null genotype contributes to increased risk of gastric cancer in Chinese population：evidence from a meta-analysis[J].Tumour Biol，2013，34（3）：1691-1697.

[13]Nguyen TV，Janssen MJ，van Oijen MG，et al.Genetic polymorphisms in GSTA1，GSTP1，GSTT1，and GSTM1 and gastric cancer risk in a Vietnamese population[J].Oncol Res，2010，18（7）：349-355.

[14]García-González MA，Quintero E，Bujanda L，et al.Relevance of GSTM1，GSTT1，and GSTP1 gene polymorphisms to gastric cancer susceptibility and phenotype[J].Mutagenesis，2012，27（6）：771-777.

[15]Saadat M.Genetic polymorphisms of glutathione S-transferase T1 （GSTT1）and susceptibility to gastric cancer：a meta-analysis[J].Cancer Sci，2006，97（6）：505-509.

[16]王辰，肖丹，孫永昌，等.中國臨床戒煙指南（2007年版，試行本）[J].國際呼吸雜志，2008，28（16）：961-970.

[17]Nomura AM，Wilkens LR，Henderson BE，et al.The association of cigarette smoking with gastric cancer：the multiethnic cohort study[J].Cancer Causes Control，2012，23（1）：51-58.