應(yīng)用16S rDNA 克隆文庫(kù)法分析B6-Co小鼠角膜炎細(xì)菌組成△

宋鴻雁 仇保豐 劉春 朱順星 繆進(jìn) 王生存 吳劉成 王旭 邵義祥

【實(shí)驗(yàn)研究】

應(yīng)用16S rDNA 克隆文庫(kù)法分析B6-Co小鼠角膜炎細(xì)菌組成△

宋鴻雁 仇保豐 劉春 朱順星 繆進(jìn) 王生存 吳劉成 王旭 邵義祥

細(xì)菌性角膜炎；16S rDNA克隆文庫(kù)；細(xì)菌組成；B6-Co小鼠

目的 鑒定B6-Co突變系小鼠角膜的病原菌組成，并與人類(lèi)細(xì)菌性角膜炎病原菌組成進(jìn)行比較分析。方法 選取10 d齡B6小鼠和B6-Co小鼠各6只為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，提取小鼠角膜組織刮取物細(xì)菌基因組DNA，通過(guò)PCR擴(kuò)增構(gòu)建16S rDNA 克隆文庫(kù)，采用隨機(jī)測(cè)序法分析B6-Co小鼠角膜細(xì)菌組成，B6小鼠作為對(duì)照。結(jié)果 B6-Co角膜混濁小鼠中共鑒定出20種細(xì)菌，隸屬于15個(gè)屬，包括葡萄球菌屬、假單胞菌屬、鏈球菌屬、微球菌屬、棒狀桿菌屬等。葡萄球菌屬和假單胞菌屬為優(yōu)勢(shì)群，葡萄球菌屬豐度為19.7%～53.1%，假單胞菌屬的豐度為17.4%～32.8%。其中葡萄球菌屬主要是表皮葡萄球菌，豐度為13.8%～20.9%；緩慢葡萄球菌，豐度為14.0%～30.9%；金黃色葡萄球菌，豐度為7.4%～20.3%。此外，棒狀桿菌和微球菌也比較常見(jiàn)。10 d齡B6小鼠未檢測(cè)出細(xì)菌。結(jié)論 B6-Co突變系小鼠角膜細(xì)菌組成與人類(lèi)角膜炎病原菌相似，是研究人類(lèi)角膜炎診斷方法、發(fā)病機(jī)理及臨床用藥的很好的動(dòng)物模型。

[眼科新進(jìn)展，2014，34(12)：1124-1127]

角膜病是眼科常見(jiàn)病，也是比較嚴(yán)重的致盲性眼病之一[1]。角膜病病因有多種，其中炎癥引起的角膜病占首要地位[2]。近年來(lái)，細(xì)菌性角膜炎的發(fā)病率在我國(guó)呈現(xiàn)明顯升高趨勢(shì)[3-4]。準(zhǔn)確的病原學(xué)診斷是合理治療角膜病的關(guān)鍵，然而目前細(xì)菌性角膜炎病原學(xué)診斷仍缺乏有效的方法。研究顯示，35%～60%的感染性角膜病病例在目前的診斷條件下無(wú)法查到病原體，使得角膜病的臨床診斷和治療面臨許多困難。目前細(xì)菌菌群分析中應(yīng)用最多的是16S rDNA 克隆文庫(kù)方法。B6-Co小鼠是邵義祥等利用乙基亞硝基脲(ENU)誘變技術(shù)獲得并建立的具有角膜混濁表型的突變系小鼠，該模型小鼠胚胎期16.5 d時(shí)上下眼瞼閉合缺陷，出生后眼瞼開(kāi)裂，后逐漸發(fā)展為角膜混濁[5]。本研究擬采用建立16S rDNA 克隆文庫(kù)隨機(jī)測(cè)序的方法揭示B6-Co小鼠角膜混濁的細(xì)菌組成，為人類(lèi)角膜病的診斷和治療提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 清潔級(jí)10 d齡健康無(wú)眼疾B6小鼠6只，B6-Co角膜混濁小鼠6只，雌雄均各半，由南通大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證：SCXK(蘇)2008-0010，使用許可證：SYXK(蘇)2012-0030。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的使用均遵循南通大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用管理辦法及國(guó)家相關(guān)規(guī)定。

1.1.2 主要試劑及儀器 pGEM-T Vector系統(tǒng)(美國(guó)Promega公司)；16S rDNA PCR細(xì)菌擴(kuò)增試劑盒(大連TaKaRa公司)；細(xì)菌基因組提取試劑盒、DH5α感受態(tài)細(xì)胞[天根生化科技(北京)有限公司]；酵母浸提物和胰蛋白胨(英國(guó)OXOID公司)。Centifuge 5417 冷凍離心機(jī)、Eppendorf AG 22331 Hamburg PCR儀(德國(guó)Eppendorf公司)；DYY-6B型穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀(北京市六一儀器廠)；one Drop? OD-1000紫外-可見(jiàn)光全光譜分光光度計(jì)(上海中天生物科技有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 樣品采集 在超凈工作臺(tái)內(nèi)以體積分?jǐn)?shù)75%酒精擦拭B6小鼠和B6-Co小鼠上下眼瞼、瞼緣及周?chē)M織2～3遍，無(wú)菌鑷子將上下眼瞼分開(kāi)，充分暴露角膜，用無(wú)菌刀片刮取角膜組織。B6-Co小鼠則刮取病灶及其邊緣組織。將刮取物置于加有500 μL TE緩沖溶液的無(wú)菌Eppendorf管內(nèi)。

1.2.2 細(xì)菌基因組DNA的提取 含有刮取物的Eppendorf管12 000 r·min-1離心5 min，棄去上清，收集沉淀。往沉淀中加入500 μL DNA提取液(100 mmol·L-1Tris-HCl pH 8.0，150 mmol·L-1EDTA pH 8.0，100 mmol·L-1NaCl 和10 g·L-1SDS)和50 μL溶菌酶(20 g·L-1)，37 ℃放置30 min，加入4 μL RNase A(100 g·L-1)和20 μL蛋白酶K(20 g·L-1)。參照細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒(TIANGEN)說(shuō)明書(shū)提取小鼠角膜細(xì)菌基因組DNA。提取的基因組DNA加入60 μL雙蒸水溶解，在10 g·L-1瓊脂糖凝膠上電泳，紫外燈下觀察電泳結(jié)果。

1.2.3 細(xì)菌16S rDNA的擴(kuò)增與純化 以細(xì)菌基因組DNA為模板，使用16S rDNA PCR細(xì)菌擴(kuò)增試劑盒對(duì)小鼠角膜細(xì)菌16S rDNA進(jìn)行擴(kuò)增，操作方法參照試劑盒說(shuō)明書(shū)。PCR反應(yīng)體系：模板DNA 100 ng，PCR Premix 25 μL，F(xiàn)orward Primer 0.5 μL，Reverse Primer 0.5 μL，16S-free H2O補(bǔ)足至總體積50 μL。反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性 1 min，53 ℃退火1 min，72 ℃延伸 90 s，30個(gè)循環(huán)；然后于72 ℃再延伸5 min。PCR結(jié)束后，將PCR擴(kuò)增反應(yīng)物在10 g·L-1瓊脂糖凝膠上電泳，紫外燈下觀察結(jié)果。對(duì)成功克隆出預(yù)期大小條帶的，在紫外燈下進(jìn)行切膠，然后用TaKaRa公司生產(chǎn)的膠回收試劑盒回收純化目的片段，具體方法參照試劑盒說(shuō)明書(shū)。

1.2.4 16S rDNA克隆文庫(kù)的構(gòu)建 取回收后的PCR產(chǎn)物與pGEM-T easy vector克隆載體連接成重組質(zhì)粒，連接體系參照載體的使用說(shuō)明進(jìn)行，將上述成分在薄壁Eppendorf管中混合均勻后置于16 ℃保溫桶中連接過(guò)夜，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.coliDH5感受態(tài)細(xì)菌，加入不含有抗生素的LB培養(yǎng)液，于37 ℃恒溫振蕩器內(nèi)低速振蕩培養(yǎng)1 h，3600 r·min-1離心5 min，棄約800 μL上清，混勻剩余200 μL菌液，將之全部涂布于含有IPTG和X-Gal的氨芐青霉素平板上，于37 ℃培養(yǎng)12～16 h，進(jìn)行藍(lán)白斑篩選。

1.2.5 陽(yáng)性克隆的鑒定 用無(wú)菌牙簽從平板上隨機(jī)挑取白色菌落，于含有終濃度為100 μg·mL-1氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中37 ℃振蕩培養(yǎng)12～16 h。使用TaKaRa公司生產(chǎn)的MiniBEST Plasmid Purification Kit 對(duì)培養(yǎng)的細(xì)菌提取質(zhì)粒。使用16S rDNA Bacterial Identification PCR Kit提供的測(cè)序引物對(duì)提取的DNA重組質(zhì)粒進(jìn)行PCR鑒定，PCR反應(yīng)體系如下：10×Taq Buffer 2.5 μL，dNTP Mix(10 mmol·L-1each)1 μL，25 mmol·L-1MgCl20.5 μL，Seq Forward 0.5 μL，Seq Reverse 0.5 μL，Taq 酶(5 U·μL-1)0.5 μL，DNA質(zhì)粒0.5 μL，雙蒸水補(bǔ)足至總體積25 μL。反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性 1 min，53 ℃退火1 min，72 ℃延伸 90 s，30個(gè)循環(huán)；然后于72 ℃再延伸15 min。循環(huán)反應(yīng)完畢后，將擴(kuò)增反應(yīng)物在10 g·L-1瓊脂糖凝膠上電泳，紫外燈下觀察結(jié)果。

1.2.6 DNA序列的測(cè)定及分析 從文庫(kù)中隨機(jī)挑選PCR鑒定均為陽(yáng)性的克隆96個(gè)，送生工生物工程(上海)有限公司進(jìn)行測(cè)序，用DNAstar對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行編輯，然后將所得測(cè)序結(jié)果輸入網(wǎng)址http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/，進(jìn)入NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行網(wǎng)上比對(duì)。本研究得到的序列已提交GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)，收錄號(hào)為KJ910348～KJ910369。

2 結(jié)果

2.1 16S rDNA基因的PCR擴(kuò)增 參照細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒(TIANGEN)提取B6-Co小鼠角膜病灶組織刮取物細(xì)菌基因組DNA，然后用16S rDNA Bacterial Identification PCR Kit進(jìn)行16S rDNA的擴(kuò)增，結(jié)果細(xì)菌的基因組DNA成功擴(kuò)增出了約為1700 bp的條帶，與預(yù)期大小基本一致(圖1)。而B(niǎo)6小鼠角膜組織刮取物中未擴(kuò)增出條帶。

2.2 16S rDNA克隆文庫(kù)細(xì)菌種類(lèi) 本研究成功構(gòu)建6個(gè)16S rDNA克隆文庫(kù)，經(jīng)過(guò)比對(duì)分析發(fā)現(xiàn)，從B6-Co小鼠角膜病灶組織刮取物中鑒定的細(xì)菌共20種，隸屬于15個(gè)屬(表1)。與NCBI參考菌株相比，克隆文庫(kù)中序列相似性大于或等于97%的歸結(jié)為同一種細(xì)菌。

2.3 16S rDNA克隆文庫(kù)細(xì)菌組成 B6-Co小鼠角膜病灶組織刮取物PCR擴(kuò)增獲得的6個(gè)克隆文庫(kù)的細(xì)菌組成如圖2。文庫(kù)中數(shù)量少于或等于2個(gè)克隆的細(xì)菌定義為“others”，序列相似性低于97%的定義為“unclassified”細(xì)菌。由圖2可知葡萄球菌屬(Staphylococcus)和假單胞菌屬(Pseudomonas)是優(yōu)勢(shì)群，豐度分別為19.7%～53.1%和17.4%～32.8%。其中葡萄球菌屬主要是表皮葡萄球菌(Staphylococcusepidermidis)，豐度為13.8%～20.9%；緩慢葡萄球菌(Staphylococcuslentus)，豐度為14.0%～30.9%；金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)，豐度為7.4%～20.3%。除此外，文庫(kù)中棒狀桿菌(Corynebacterium)和微球菌(Micrococcus)也比較常見(jiàn)。其他種類(lèi)細(xì)菌如不動(dòng)桿菌、節(jié)桿菌、擬桿菌、分支桿菌、大腸桿菌、寡養(yǎng)單胞菌等也被檢測(cè)到。

Figure 1 Agarose gel electrophoresis of 16S rDNA amplication of corneal scrapings of B6-Co mice.M:DNA marker DL2000;Line 1-4:Partial 16S rDNA amplications of samples B6-Co小鼠角膜細(xì)菌16S rDNA基因片段的PCR擴(kuò)增電泳檢測(cè)結(jié)果。M：DL2000 Marker；1～4：細(xì)菌16S rDNA的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物

表1 B6-Co小鼠角膜刮取物16S rDNA 基因序列分析結(jié)果Table 1 Distribution of 16S rDNA gene detected from corneal scraping of B6-Co mice

3 討論

細(xì)菌是導(dǎo)致化膿性角膜炎最常見(jiàn)的病因，其致病種類(lèi)眾多。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外研究人員調(diào)查了引起人類(lèi)細(xì)菌性角膜炎的致病菌，這些研究結(jié)果大多是建立在傳統(tǒng)的細(xì)菌體外人工培養(yǎng)、純化和鑒定技術(shù)的基礎(chǔ)之上，曾對(duì)細(xì)菌性角膜炎的診治起到了很大的推動(dòng)作用。但遺憾的是，現(xiàn)代研究表明，自然界中90%以上的細(xì)菌是無(wú)法人工培養(yǎng)的，這就決定了傳統(tǒng)的方法無(wú)法徹底澄清細(xì)菌性角膜炎的致病菌種類(lèi)和特性，因而，不可避免地會(huì)對(duì)該病的診斷和治療造成巨大影響。國(guó)內(nèi)外已有報(bào)道顯示，細(xì)菌性角膜炎病原體培養(yǎng)陽(yáng)性率普遍較低，這一科學(xué)問(wèn)題至今尚未解決，因而使得角膜病的臨床診斷和治療面臨許多困難[6]。另有研究顯示，35%～60%的感染性角膜病病例在目前的診斷條件下無(wú)法查到病原體。因此，尋求其他手段對(duì)細(xì)菌性角膜炎的致病菌種進(jìn)行系統(tǒng)、全面地分析，對(duì)各種細(xì)菌在角膜炎發(fā)病過(guò)程扮演的角色加以研究，已經(jīng)迫在眉睫。

16S rDNA 基因克隆文庫(kù)分析技術(shù)不依賴于微生物的分離培養(yǎng)，能夠快速準(zhǔn)確鑒定出樣品中尚不能人工培養(yǎng)的細(xì)菌，相對(duì)于傳統(tǒng)的細(xì)菌培養(yǎng)法，它可以檢測(cè)某種細(xì)菌的豐度，并能依次確定樣品中優(yōu)勢(shì)菌的構(gòu)成比例，對(duì)菌群構(gòu)成可獲得更準(zhǔn)確、全面的認(rèn)識(shí)[7]。在前期研究工作中，本課題組通過(guò)乙基亞硝基脲誘變獲得B6-Co突變系小鼠，B6-Co小鼠表現(xiàn)為角膜混濁，其突變表型能世代相傳，屬于單基因顯性遺傳，角膜混濁的發(fā)生率約為43.1%[5]。通過(guò)對(duì)不同年齡段B6-Co小鼠和正常C57BL/6小鼠角膜病理變化的研究，發(fā)現(xiàn)B6-Co小鼠角膜混濁的變化為炎癥性病變，其過(guò)程與人類(lèi)角膜炎相似[8]。在前期研究工作中，我們運(yùn)用PCR技術(shù)檢測(cè)了B6-Co小鼠角膜炎的病原菌感染情況，結(jié)果顯示，細(xì)菌陽(yáng)性率為77.78%[9]。本研究應(yīng)用16S rDNA基因克隆文庫(kù)隨機(jī)測(cè)序方法調(diào)查了10 d齡B6-Co小鼠的角膜細(xì)菌種類(lèi)，檢測(cè)了B6-Co小鼠的角膜菌群中優(yōu)勢(shì)細(xì)菌的豐度，得出各類(lèi)細(xì)菌的構(gòu)成比例。其中假單胞菌屬、葡萄球菌屬是優(yōu)勢(shì)群。葡萄球菌屬主要是表皮葡萄球菌、緩慢葡萄球菌、金黃色葡萄球菌。除此外，文庫(kù)中棒狀桿菌和微球菌也比較常見(jiàn)。

Figure 2 Percentage and bacterial species in clone library of PCR from corneal scraping of B6-Co mice (samples 1 to 6).The stacked bars represent the bacterial composition of clone libraries of positive bacterial corneal scraping B6-Co小鼠角膜刮取物PCR擴(kuò)增獲得的克隆文庫(kù)的細(xì)菌種類(lèi)和百分比(樣品1～6)。堆積圖代表角膜刮片PCR陽(yáng)性克隆文庫(kù)細(xì)菌組成

本研究獲得的6個(gè)克隆文庫(kù)的細(xì)菌組成并不完全一致，其原因尚不清楚，類(lèi)似的結(jié)果也曾有報(bào)道[10-11]。我們認(rèn)為可能的原因有：(1)有研究報(bào)道不同的小鼠性別對(duì)其糞便微生物組成有影響[10]。本研究采用雌雄各半的B6-Co小鼠構(gòu)建克隆文庫(kù)，性別可能對(duì)小鼠角膜細(xì)菌組成成分有所影響。(2)個(gè)體差異可能導(dǎo)致細(xì)菌組成的差異。有報(bào)道顯示，大鼠腸道微生物組成成分存在顯著的個(gè)體差異，Kibe等[11]發(fā)現(xiàn)不同日齡甚至相同日齡的小鼠腸道微生物組成存在顯著差異。根據(jù)本研究結(jié)果，我們認(rèn)為B6-Co小鼠角膜細(xì)菌組成呈動(dòng)態(tài)變化，相同日齡的小鼠角膜細(xì)菌種類(lèi)不完全相同，其具體原因有待深入研究。

本研究檢測(cè)的細(xì)菌種類(lèi)與研究人員報(bào)道的人類(lèi)角膜炎病原菌結(jié)果一致。在人類(lèi)角膜炎臨床病例病原菌種類(lèi)調(diào)查中，研究人員報(bào)道發(fā)現(xiàn)了多種細(xì)菌，其中假單胞菌、棒狀桿菌、葡萄球菌及鏈球菌被認(rèn)為是引發(fā)人類(lèi)細(xì)菌性角膜炎的主要病原菌[12]。有研究報(bào)道，大約三分之二的細(xì)菌性角膜炎是革蘭陽(yáng)性細(xì)菌，比如葡萄球菌和鏈球菌，三分之一為革蘭陰性細(xì)菌，比如假單胞菌[13]。馬來(lái)西亞醫(yī)學(xué)中心科研人員對(duì)角膜潰瘍的微生物診斷調(diào)查結(jié)果顯示，假單胞菌是最主要的細(xì)菌，比例達(dá)到57%[14]。華盛頓大學(xué)研究者應(yīng)用PCR方法鑒定了角膜潰瘍病例的主要病原菌為葡萄球菌、假單胞菌和棒狀桿菌[15]。其他種類(lèi)的細(xì)菌比如放線桿菌、大腸桿菌、微球菌、分支桿菌、不動(dòng)桿菌等在人類(lèi)角膜炎的臨床病例中也有報(bào)道[16]。

本研究結(jié)果顯示，B6-Co突變系小鼠角膜細(xì)菌組成與人類(lèi)角膜炎病原菌相似，是一個(gè)研究人類(lèi)角膜炎診斷方法、發(fā)病機(jī)理及臨床用藥的很好的動(dòng)物模型。

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date：Aug 15，2014

Accepted date:Oct 29，2014Foundation item：Natural Science Foundation of Jiangsu Province of China(No:BK2010279);Natural Science Foundation of the Higher Education Institutions of Jiangsu Province(No:13KJB180019)；Scientific Research Foundation of Nantong University(No:12R082)From theLaboratoryAnimalCenterofNantongUniversity，NantongUniversityInstituteofComparativeMedicine(SONG Hong-Yan，LIU Chun，ZHU Shun-Xing，MIAO Jin，WANG Sheng-Cun，WU Liu-Cheng，WANG Xu，SHAO Yi-Xiang)，Nantong226001，JiangsuProvince，China;NantongEntry-ExitInspectionandQuarantineBureau(QIU Bao-Feng)，Nantong226004，JiangsuProvince，China

Responsible author:SHAO Yi-Xiang，E-mail:shaoyx@ntu.edu.cn

Bacterial composition of B6-Co mice with bacteria keratitis analyzed with 16S rDNA clone library

SONG Hong-Yan，QIU Bao-Feng，LIU Chun，ZHU Shun-Xing，MIAO Jin，WANG Sheng-Cun，WU Liu-Cheng，WANG Xu，SHAO Yi-Xiang

bacteria keratitis；16S rDNA clone library；bacteria composition

Objective To investigate the bacterial composition in the eyes of B6-Co mice with bacteria keratitis,and compare with that in humans with bacteria keratitis.Methods Six 10-day-old C57BL/6 (B6)and C57BL/6-Corneal opacity (B6-Co)mice,respectively,were chosen as experimental animals.Total bacterial genomic DNA was extracted from corneal scrapings of B6 and B6-Co mice.16S rDNA clone libraries from PCR products were constructed.The bacterial composition from corneal scrapings of B6-Co mice with bacteria keratitis was determined by sequence analysis.B6 mice were used as controls.Results The microbiota analysis detected 20 species in the eyes of B6-Co mice with bacterial keratitis,including 15 genera such asStaphylococcus,Pseudomonas,Streptococcus,CorynebacteriumandMicrococcus.The dominant genera wereStaphylococcusandPseudomonasand accounted for 19.7%-53.1% and 17.4%-32.8%,respectively.StaphylococcusincludedStaphylococcusepidermidis,StaphylococcuslentusandStaphylococcusaureus,which accounted for 13.8%-20.9%,14.0%-30.9% and 7.4%-20.3%,respectively.In addition,CorynebacteriumandMicrococcuswere also frequently detected in the eyes of B6-Co mice.No bacteria was detected in 10-day-old B6 mice controls.Conclusion The bacterial composition in the eyes of B6-Co mice is similar to that in humans with bacteria keratitis,which suggests that B6-Co mouse is a favorable model to study diagnostic methods,pathogenesis and clinical medication of bacteria keratitis in humans.

宋鴻雁，仇保豐，劉春，朱順星，繆進(jìn)，王生存，等.應(yīng)用16S rDNA 克隆文庫(kù)法分析B6-Co小鼠角膜炎細(xì)菌組成[J].眼科新進(jìn)展，2014，34(12)：1124-1127.

10.13389/j.cnki.rao.2014.0312

宋鴻雁，女，1982年出生，四川人，博士，講師，研究方向?yàn)槿祟?lèi)動(dòng)物疾病模型。聯(lián)系電話：0513-85051557(辦)；E-mail:songhongyanv@ntu.edu.cn

About SONG Hong-Yan:Female，born in 1982，Doctor degree，lecturer.Tel:+86-513-85051557(O);E-mail:songhongyanv@ntu.edu.cn

2014-08-15

修回日期：2014-10-29

本文編輯：盛麗娜

江蘇省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(編號(hào)：BK2010279)；江蘇省高校自然科學(xué)基金項(xiàng)目(編號(hào)：13KJB180019)；南通大學(xué)自然科學(xué)類(lèi)科研基金項(xiàng)目(編號(hào)：12R082)

226001 江蘇省南通市，南通大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心 南通大學(xué)比較醫(yī)學(xué)研究所(宋鴻雁，劉春，朱順星，繆進(jìn)，王生存，吳劉成，王旭，邵義祥)；226004 江蘇省南通市，南通出入境檢驗(yàn)檢疫局動(dòng)檢科(仇保豐)

邵義祥，E-mail:shaoyx@ntu.edu.cn

[Rec Adv Ophthalmol，2014，34(12):1124-1127]