遺傳眼病永生化細胞系建立方法△

王冬杰 李寧東 韓瑞芳

【實驗研究】

遺傳眼病永生化細胞系建立方法△

王冬杰 李寧東 韓瑞芳

遺傳眼病；EB病毒；永生化B淋巴細胞系；成纖維細胞；原代培養(yǎng)

目的 通過遺傳眼病患者的外周血或皮膚組織建立永生化細胞系，以保存其遺傳資源。方法 永生化B淋巴細胞系的建立：抽取患者靜脈血，分離淋巴細胞，以EB 病毒體外轉化B淋巴細胞為類淋巴母細胞，利用環(huán)孢霉素A抑制T 淋巴細胞RNA 聚合酶 Ⅱ活性，防止已轉化B淋巴細胞因受到T淋巴細胞的攻擊而退化，培養(yǎng)后建立永生化B淋巴細胞系；皮膚成纖維細胞原代培養(yǎng)：利用DispaseⅡ酶處理離體皮膚組織以分離表皮組織，將其余組織剪碎后貼瓶培養(yǎng)，成纖維細胞可從組織塊爬出，生長成為細胞系。結果 永生化B淋巴細胞系：共完成標本17例，成功建系15例，成功率88.2%；經過轉化后B淋巴細胞懸浮生長，胞漿豐富、形態(tài)各異，聚集成團，可無限傳代用于實驗研究。皮膚成纖維細胞原代培養(yǎng)：共完成標本5例，成功建系3例，成功率60.0%；皮膚成纖維細胞貼壁生長，呈典型紡錘形，中間飽滿，兩邊細長，50代以內增殖旺盛可用于實驗研究。結論 通過遺傳眼病患者的外周血和皮膚組織可建立永生化B淋巴細胞系和皮膚成纖維細胞系以保存其全部遺傳信息，為進一步研究相關遺傳性眼病奠定物質基礎。

[眼科新進展，2014，34(12)：1114-1117]

與遺傳相關的眼科疾病不勝枚舉，其中既有遵循孟德爾法則，按照常染色體顯性、常染色體隱性或X連鎖模式遺傳的，如原發(fā)性視網膜色素變性(retinitis pigmentosa)、先天性眼球震顫(congenital nystagmus)、角膜營養(yǎng)不良等，也有線粒體遺傳所致疾病者，如Leber遺傳性視神經病變(Leber’s hereditary optic neuropathy)[1-3]。伴隨著分子遺傳學的發(fā)展，與遺傳性眼病相關的致病基因陸續(xù)被發(fā)現(xiàn)，基因功能的研究普遍開展，但到目前仍有大量未知致病基因及其功能有待于進一步揭示。

面對日益稀少的眼科遺傳資源，特別是罕見的遺傳家系，如何將其永久保存下來是目前眼科學領域面臨的重要課題。雖然可以抽取遺傳眼病患者的DNA永久保存，但它們不能還原細胞原始的生命活動，也丟失了部分的遺傳信息，如mRNA、tRNA等。現(xiàn)今各國各專業(yè)學者為了克服遺傳資源的不可再生性已開始建立細胞庫來保護遺傳資源[4-7]。本研究希望通過建立永生化的細胞系，為進一步研究相關遺傳性眼病奠定物質基礎。

1 材料與方法

1.1 材料 標本均來源于在天津市眼科醫(yī)院就診并確診患有遺傳性眼科疾病的患者，征得患者及家屬同意共收集外周靜脈血標本17份，皮膚標本5份。B95-8細胞，即EB病毒(Epstein-Barr virus，EBV)轉化的絨猴白細胞，來源于中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心。

1.2 主要試劑及儀器 RPMI-1640培養(yǎng)基、DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS，美國Hyclone公司)，環(huán)孢霉素A、二甲基亞砜(DMSO)、淋巴細胞分離液、DispaseⅡ酶(美國Sigma公司)，2.5 g·L-1Tryspin-EDTA(天津Bioroc公司)，青霉素鏈霉素混合液(100×，北京Blotopped公司)；倒置相差顯微鏡(Nikon)。

1.3 永生化B淋巴細胞系的建立

1.3.1 EBV的制備 B95-8細胞常規(guī)培養(yǎng)(RPMI-1640：FBS=3：1)并給予1：3傳代，待培養(yǎng)液變黃后饑餓5～7 d，旋緊培養(yǎng)瓶蓋后搖勻，反復凍融3次(-80 ℃，37 ℃)，1500 r·min-1離心10 min，0.22 μm針式過濾器過濾，分裝并保存于-80 ℃冰箱。

1.3.2 EBV感染B淋巴細胞 (1)用RPMI-1640培養(yǎng)基等倍稀釋外周靜脈血，吸取4 mL稀釋血沿管壁緩慢加入到4 mL淋巴細胞分離液的表面，2500 r·min-1離心10 min，吸取白細胞層，加入8 mL RPMI-1640培養(yǎng)液中洗脫淋巴細胞分離液，1500 r·min-1離心10 min，棄上清即可得到純凈的白細胞；(2)1.5 mL完全培養(yǎng)基(RPMI-1640：FBS=3：1)將細胞重懸并轉移至25 cm2培養(yǎng)瓶中，加入1.5 mL EBV及100 μL環(huán)孢霉素A混勻，瓶蓋旋松，傾斜放入37 ℃、體積分數(shù)5%CO2潮濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；(3)培養(yǎng)至5～7 d酌情添加0.5 mL完全培養(yǎng)基，建株前2周視細胞生長情況再添加0.5 mL完全培養(yǎng)基，以后每隔2～3 d觀察一次，根據細胞生長情況添加完全培養(yǎng)液，當總體積增加到10～15 mL時，半量換液，使總體積不能超過20 mL；(4)當培養(yǎng)瓶底肉眼可見細胞團融合至80%時，收集細胞，用3 mL凍存液(完全培養(yǎng)液：DMSO=9：1)重懸分裝至凍存管中(每管1 mL)，程序降溫并保存至液氮中。

1.4 皮膚成纖維細胞原代培養(yǎng) (1)獲取的新鮮皮膚組織用含體積分數(shù)1%雙抗的1×PBS溶液反復清洗3次，剪除多余的脂肪等結締組織，將標本剪成小塊浸于3 g·L-1DispaseⅡ酶液中4 ℃消化6～8 h；(2)剝離表皮并剪碎其余組織，將組織小塊放于潔凈的平皿中貼壁，使真皮層朝下，組織塊之間隔開，每個組織塊添加一滴完全培養(yǎng)基(DMEM：FBS=9：1)，將平皿放于37 ℃、體積分數(shù)5%CO2潮濕溫箱中靜置30 min，用槍頭吸取少量完全培養(yǎng)基將培養(yǎng)液連通并潤濕培養(yǎng)皿邊緣后置于溫箱中過夜，次日避開組織塊緩慢添加2 mL完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)，2 d后再添加2 mL完全培養(yǎng)基，總體積不超過5 mL；(3)培養(yǎng)5～7 d，倒置顯微鏡下觀察組織塊周圍皮膚成纖維細胞生長情況，待培養(yǎng)皿內大多數(shù)組織塊周圍長出細胞且排列較緊密時給予換液；(4)當組織塊周圍皮膚成纖維細胞排列緊密，形成渦旋即克隆中心時，給予傳代，2～3 d給予換液并于倒置相差顯微鏡下觀察，當細胞達90%以上融合時，可1：3傳代，待75 cm2培養(yǎng)瓶中細胞90%以上融合時，收集細胞，3 mL凍存液(完全培養(yǎng)基：DMSO=9：1)重懸后分裝至3個凍存管中，程序降溫后轉移至液氮中長期保存。

2 結果

2.1 永生化B淋巴細胞系 采用EBV轉化加環(huán)孢霉素A法共完成17例標本，15例標本成系，2例因細菌污染導致失敗，建系成功率為88.2%，復蘇成功率為100%，可無限傳代用于實驗研究。倒置相差顯微鏡下觀察轉化的B淋巴細胞懸浮生長，體積增大，形態(tài)各異，胞漿豐富；培養(yǎng)2周后鏡下可見團狀或簇狀增殖生長的細胞團；隨著培養(yǎng)時間延長，細胞團數(shù)目、體積均增大，肉眼可見(圖1)。培養(yǎng)瓶底細胞團融合至80%時，即細胞密度為(3～6)×106個·mL-1時，可將細胞凍存。

Figure 1 Immortalized B lymphoblastoid cell lines under inverted microscope.A:B95-8 cells (×100);B:Many proliferative cell bolus at cultured 3 weeks (×40);C:B lymphocyte cells growing suspendly with large volume and abundant kytoplasm (×200);D:Anabiotic cells growing well at 2 days (×100) 倒置相差顯微鏡下觀察永生化B淋巴細胞建系。A:B95-8細胞(×100)；B:培養(yǎng)3周時大量簇狀增殖生長的B淋巴細胞團(×40);C:B淋巴細胞懸浮生長，體積增大，胞漿豐富(×200)；D：復蘇后2 d細胞生長旺盛(×100)

2.2 皮膚成纖維細胞系 采用DispaseⅡ酶消化法共完成5例標本，3例標本成系，2例因細菌污染導致失敗，建系成功率為60.0%，復蘇成功率為100%，50代以內成纖維細胞增殖能力較強，可用于實驗研究。倒置相差顯微鏡下觀察，培養(yǎng)5～7 d組織塊周圍有單個皮膚成纖維細胞爬出，呈貼壁生長狀態(tài)，細胞界限清晰，多數(shù)呈典型紡錘形，中間飽滿，兩邊細長，也可見不規(guī)則三角形，細胞質向外伸出 2～3個長短不同的突起，細胞核呈類圓形或長橢圓形；2周后組織塊周圍成纖維細胞排列逐漸緊密，多呈放射狀、編織狀走形，形成克隆中心，75 cm2培養(yǎng)瓶中細胞增殖到瓶底90%以上時凍存細胞(圖2)。

Figure 2 Skin fibroblast cells lines under inverted microscope.A:Fibroblast climbed out around the tissue at cultured 7 days (×40);B:Fibroblast adhered to the wall with fusiform or triangle (×200);C:Cell grew well around the tissue at cultured 2 weeks with tight arrangement and clone centre (×100);D:Cells grew to the whole bottom at 8 days after passage (×100) 倒置相差顯微鏡下觀察皮膚成纖維細胞建系。A:培養(yǎng)7 d組織塊周圍成纖維細胞爬出(×40)；B:成纖維細胞呈紡錘形或三角形貼壁生長(×200)；C:培養(yǎng)2周組織塊周圍細胞生長旺盛，排列緊密，形成克隆中心(×100)；D:傳代后8 d細胞長滿瓶底(×100)

3 討論

3.1 建株原理

3.1.1 永生化B淋巴細胞系 EBV感染人外周血B淋巴細胞后可活化B淋巴細胞，促進靜息期的B細胞轉化為永生化大量增殖的類淋巴母細胞系。環(huán)孢霉素A能在G0-G1期過程中選擇性地抑制T淋巴細胞RNA聚合酶Ⅱ的活性，與EBV同時加入可有效阻止T淋巴細胞對EBV的應答反應，阻止已轉化的B淋巴細胞受T淋巴細胞的攻擊而退化[7]。該方法培養(yǎng)的細胞類似癌細胞，具有永久分裂的能力，可以無限繁殖，永久保存?zhèn)€體的DNA信息用于遺傳性眼病家系基因型的分析和研究，避免了反復采血給患者和研究人員帶來的麻煩[2]。

3.1.2 皮膚成纖維細胞原代培養(yǎng) DispaseⅡ酶作用于基底膜區(qū)域的組織將離體皮膚標本的表皮同真皮層分離，同時保持細胞的活性，有利于單個成纖維細胞的爬出；胰蛋白酶能選擇性地水解蛋白質中由賴氨酸或精氨酸的羧基所構成的肽鏈，可以使細胞間的蛋白質水解從而使細胞離散，在傳代時可將細胞從瓶壁上消化下來。由于成纖維細胞本身就具有旺盛的分裂增殖能力，實驗研究表明，50代以內的皮膚成纖維細胞均可應用于實驗研究[8]。

3.2 建株成功的技術要點及復蘇的注意事項

3.2.1 技術要點 (1)所有與活細胞接觸的試劑以及操作必須保證無菌；(2)外周靜脈血需用肝素抗凝，室溫下放置不能超過72 h；皮膚標本獲取后盡快處理，以充分保護細胞活性，提高建株成功率；(3)培養(yǎng)初期少量少次添加完全培養(yǎng)基，偏酸性的環(huán)境有利于懸浮的B淋巴細胞生長，而對于成纖維細胞的培養(yǎng)，初期時組織塊需保持濕潤但不能振蕩或添加過量培養(yǎng)基導致組織塊漂??；(4)外周血建株吸取淋巴細胞層時要完全，細胞多才容易生長，另外凍存待用的EBV懸液不宜反復凍融，一般根據建株用量分裝，以保證EBV質量，對于皮膚標本，處理過程中要時刻保持濕潤，在短時間內處理并使組織貼壁以有利于成纖維細胞爬出。

3.2.2 細胞復蘇的注意事項 (1)處于對數(shù)生長期的細胞凍存后復蘇成功率高；(2)復蘇時從液氮中取出的標本需在37 ℃水浴箱中迅速解凍，水浴箱內液體不可沒過瓶蓋，溶解后立即轉移至RPMI-1640或DMEM培養(yǎng)基中洗脫凍存液，以減少常溫下DMSO對細胞的毒害作用；(3)操作時避免造成污染并縮短時間，防止細胞死亡過多。

3.3 建系意義 人類理想的遺傳學材料，既要取材方便、基因組DNA容易獲得，也需要細胞生長周期短，多次取材方便等有利條件。外周靜脈血是最常見易得的標本之一，應用EBV轉化外周血B淋巴細胞能使其轉化成為一種連續(xù)分裂、永久生存的B淋巴細胞株，每株細胞含有正常的二倍體組型并且含有供血者完整的遺傳信息。皮膚標本的獲取相對不易，培養(yǎng)條件要求高且容易污染，但對于一些罕見的遺傳病有重要的科研價值。例如Palister-Killian綜合征是由于組織特異性嵌合等臂12p染色體[i(12p)]所導致，這種[i(12p)]常見于患者的皮膚成纖維細胞，而在患者外周血淋巴細胞中常呈低比例嵌合[9]。不僅如此，皮膚成纖維細胞系還具有建系時間較短、方便攜帶至其他實驗室繼續(xù)研究等優(yōu)點。因此為了更好地做好眼科遺傳學的診斷和分析就需要建立皮膚成纖維細胞系作為必要的補充手段。針對不同的患者情況可以選擇一種或兩種方式儲存遺傳信息，還可作為細胞來源用于遺傳眼病的實驗研究。

永生化B淋巴細胞系的建立經歷多位學者改良出現(xiàn)多種優(yōu)化方法[10-11]，本文采用的是淋巴細胞轉化法，而皮膚成纖維細胞建系也可以不用DispaseⅡ酶消化直接使組織塊貼壁，但往往生長出的皮膚成纖維細胞混雜有鱗狀上皮細胞，后期需要經過多次傳代才能去除。本研究中兩種方法建立的細胞系均攜帶有人類個體全部的遺傳信息，對于細胞純度要求較高的研究可多次傳代以純化細胞，但此處鑒別細胞的種類對本文的意義不大，故未予敘述。

目前已有學者為眼科及其他種類的遺傳疾病建立了永生化細胞系，為科研和臨床疾病的診斷提供了便利，但對建株成功率及建株后DNA是否發(fā)生變化的問題仍有爭議[12-14]。最近有研究顯示，EBV轉化的淋巴細胞其端粒酶活化水平較低的一般在早期階段走向死亡，只有很少部分的細胞端粒酶足夠活化并且發(fā)生染色體非整倍體或其他分子改變，例如p16/Rb抑癌基因的下調，TP53抑癌基因的突變等造成了細胞的無限增殖，即存在所謂的細胞存活關鍵期，導致建系的成功率偏低[15]。但根據筆者的建株經驗和其他人建系結果來看，建株成功率均在80%以上，只有個別由于污染造成建系失??；另外核型分析顯示永生化B淋巴細胞系核型與建系前無差異[5]，絕大多數(shù)基因未發(fā)生變化[13]，故此問題仍有待于進一步全面探索。

綜上所述，為遺傳眼病患者建立永生化細胞系保存其全套的遺傳資源，對遺傳眼病的基礎研究具有長遠的價值。

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date：Jul 12，2014

Accepted date:Sep 1，2014Foundation item：National Natural Science Foundation of China(No：81170884)From theClinicalCollegeofOphthalmology，TianjinMedicalUniversity(WANG Dong-Jie)，Tianjin300020，China；TianjinEyeHospital(LI Ning-Dong，HAN Rui-Fang)，Tianjin300020，China

Responsible author:LI Ning-Dong，E-mail：lnd30@163.com

Establishment of immortalized cell lines for genetic eye diseases

WANG Dong-Jie，LI Ning-Dong，HAN Rui-Fang

genetic eye diseases;EB virus;immortalized B lymphoblastoid cell lines；fibroblast;primary culture

Objective To establish immortalized cell lines by acquiring peripheral blood or skin tissues from patients diagnosed with genetic eye diseases,so as to preserve the genetic resources.Methods Immortalized B lymphoblastoid cell lines establishment:The white cells from patients’ peripheral blood were isolated,then EB virus was used to transform B lymphocytes into B lymphoblastoid cells,and cyclosporin A was used to inhibit T lymphocyte RNA polymerase Ⅱactivity for preventing the transformed B cells from T lymphocytes attacking,the transformed B lymphoblastoid cells would grow gradually to cell lines.Skin fibroblast cells in primary culture:The skin tissue in vitro was immersed in Dispase Ⅱ enzyme solution to separate the epidermis and dermis,then the dermal was cut into small pieces and pasted them to the bottom of a cultural vessel,skin fibroblasts would climb out of the tissues and develop to cell line.Results Immortalized B lymphoblastoid cell lines:Totally 17 samples were completed,15 samples in success,the success rate was 88.2%;The transformed B lymphocyte cells grew suspendly with different shapes and the cytoplasm was prominent,every generation could be unlimitedly used for experimental study.Skin fibroblast cells in primary culture:Totally 5 samples were completed,3 samples in success,the success rate was 60%;The skin fibroblast cells grew adherently in typical spindle shape,of which the middles were full and both sides were slender,the skin fibroblast cells showed high proliferation within 50 generations,which could be used in experimental study.Conclusion The peripheral blood or skin tissues in patients with genetic eye diseases can be used to establish immortalized cell lines and save all genetic information,which laying foundation for the further study.

王冬杰，李寧東，韓瑞芳.遺傳眼病永生化細胞系建立方法[J].眼科新進展，2014，34(12)：1114-1117.

10.13389/j.cnki.rao.2014.0309

王冬杰，女，1988年1月出生，河北人，在讀碩士研究生。聯(lián)系電話：13516296960；E-mail：db-sd@163.com

About WANG Dong-Jie：Female，born in January，1988.Master degree candidate.Tel：13516296960；E-mail：db-sd@163.com

2014-07-12

修回日期：2014-09-01

本文編輯：盛麗娜

國家自然科學基金資助(編號：81170884)

致謝：中南大學中國醫(yī)學遺傳學國家重點實驗室！

300020 天津市，天津醫(yī)科大學眼科臨床學院(王冬杰)；300020 天津市，天津市眼科醫(yī)院(李寧東，韓瑞芳)

李寧東，E-mail：lnd30@163.com

[Rec Adv Ophthalmol，2014，34(12):1114-1117]