板橋黨參多糖抗腫瘤活性實驗研究

楊 瑾,董興高,袁德培,熊茂來

1.湖北民族學(xué)院中醫(yī)藥學(xué)院(湖北 恩施 445000)2.湖北民族學(xué)院醫(yī)學(xué)院(湖北 恩施 445000)

板橋黨參多糖抗腫瘤活性實驗研究

楊 瑾1,董興高2,袁德培1,熊茂來2

1.湖北民族學(xué)院中醫(yī)藥學(xué)院(湖北 恩施 445000)2.湖北民族學(xué)院醫(yī)學(xué)院(湖北 恩施 445000)

目的 初步研究板橋黨參多糖的抗腫瘤活性。方法 MTT法檢測板橋黨參多糖體外抗腫瘤活性。對S180荷瘤小鼠灌胃板橋黨參多糖，觀察腫瘤的生長抑制情況。以最大給藥量法對小鼠進行灌胃給藥測定板橋黨參多糖的急性毒性。結(jié)果 板黨多糖對MCF-7細(xì)胞具有顯著抑制增殖作用；荷瘤小鼠小、中、大劑量組腫瘤質(zhì)量明顯小于模型對照組(P<0.05)，小鼠以最大劑量灌胃給藥后全部存活。結(jié)論 板黨多糖具有抑制腫瘤生長的作用。

板橋黨參；多糖；抗腫瘤活性；MCF-7；S180

道地板橋黨參(簡稱“板黨”)是桔?？贫嗄晟葙|(zhì)藤本植物川黨參(CodonopsistangshenOliv.)的干燥根，主產(chǎn)于湖北省恩施土家族苗族自治州恩施市板橋鎮(zhèn)，多糖是其有效成分之一[1]。板黨具有補氣血、養(yǎng)脾胃、潤肺生津、滋陰壯陽等功效，是傳統(tǒng)的補中益氣要藥。本研究參照有關(guān)文獻[2]，采用超聲波水提—醇沉法提取板黨多糖，采用MTT法檢測體外抗腫瘤活性，觀察板黨多糖對S180荷瘤小鼠腫瘤生長的抑制作用，以及對板黨多糖進行安全性評價。

1 材料與方法

1.1 儀器、材料與試劑 Sartorius分析天平(BSA 124S)；SY-180超聲清洗器(上海寧商超聲儀器有限公司)；UV1600紫外分光光度計(浙江福立分析儀器有限公司)；MCO-18AIC(UV) CO2培養(yǎng)箱(日本SANYO公司)；Multiskan Spectrum酶標(biāo)儀(美國Thermo Scientific公司)。板黨采收于湖北省恩施市板橋黨參GAP藥材基地，經(jīng)湖北民族學(xué)院中醫(yī)藥學(xué)院劉杰書教授鑒定為川黨參(CodonopsistangshenOliv.)；小牛血清(四季青)；DMEM培養(yǎng)基(美國GIBCO公司)；胰蛋白酶(美國GIBCO公司)；SPF級昆明小鼠，4周齡，18～20 g，雌雄各半，購自湖北省實驗動物研究中心[生產(chǎn)許可證號：SCXK(鄂)2008-0005]；MCF-7細(xì)胞株、S180細(xì)胞株由武漢大學(xué)藥學(xué)院肖玉玲副教授提供。

1.2 實驗方法

1.2.1 板黨多糖的提取與精制 板黨干燥品50 g，粉碎過60目篩，置250 mL圓底燒瓶中加入石油醚150 mL，60～80℃回流提取0.5 h，過濾，回收石油醚。濾渣揮干石油醚，加入80%乙醇125 mL，靜置過夜后60～80℃回流提取0.5 h，過濾。濾渣揮干乙醇，在提取溫度60℃、板黨∶蒸餾水為1∶12(g∶mL)、超聲波功率為70%、提取時間為1.0 h的條件下提取2次。合并2次濾液，減壓濃縮、冷凍干燥后，得到板黨粗多糖。將板黨粗多糖用氯仿多次萃取，加入活性炭脫色，過濾，濾液加入95%乙醇，靜置過夜后過濾，濾渣依次用無水乙醇、乙醚、丙酮多次洗滌，60℃烘干，得到精制板黨多糖[3]。

1.2.2 急性毒性實驗 取SPF級昆明小鼠，禁食不禁水12 h，分為正常對照組和實驗組，每組12只。實驗組以0.5 g/mL(20 g/kg)的板黨多糖每日3次灌胃給藥，給藥4 h后喂飼基礎(chǔ)飼料；正常對照組喂飼基礎(chǔ)飼料，連續(xù)觀察7 d，記錄期間小鼠死亡數(shù)[4]。

1.2.3 板黨多糖對MCF-7癌細(xì)胞體外增殖的影響

取對數(shù)生長期的MCF-7細(xì)胞，接種于96孔板，每孔100 μL，培養(yǎng)24 h后加藥，給藥組劑量分別為1 000、500、100、10 μg/mL，同時設(shè)正常對照組，加入正常培養(yǎng)液，每組6個復(fù)孔。培養(yǎng)72 h后，以MTT法檢測，按以下公式計算抑制率。

抑制率=(正常對照組A570-給藥組A570)/正常對照組A570

1.2.4 腫瘤抑制率的測定 選用生長良好的7～10 d的S180瘤株，生理鹽水調(diào)整細(xì)胞密度5.0×106/mL，以每只0.2 mL的量接種于小鼠右前腋下，建立荷瘤小鼠模型。每組12只，隨機分為5組，模型對照組(生理鹽水)、環(huán)磷酰胺組(40 mg/kg)、板黨多糖組劑量為(50 mg/kg、100 mg/kg、200 mg/kg)[5]。次日開始給藥，板黨多糖各組、模型對照組每天灌胃1次，環(huán)磷酰胺組隔日灌胃1次，連續(xù)給藥10 d。末次給藥24 h后，稱取小鼠體質(zhì)量，取瘤塊稱質(zhì)量，計算抑瘤率。

抑瘤率=(模型對照組平均瘤質(zhì)量-給藥組平均瘤質(zhì)量)/模型對照組平均瘤質(zhì)量

2 結(jié)果

2.1 板黨多糖的含量 超聲波水提-醇沉法提取板黨多糖，得到粗多糖6.41 g，提取率達(dá)12.82%；純化后得到精制板黨多糖2.57 g，提取率達(dá)5.14%。

2.2 板黨多糖的安全性評價 小鼠全部存活，其毛色、活動、飲食、糞便色澤與質(zhì)地均正常。

2.3 板黨多糖的體外抗腫瘤活性 板黨多糖在10 μg/mL對MCF-7細(xì)胞的抑制作用不明顯，在100、500、1000 μg/mL對MCF-7細(xì)胞的抑制率隨質(zhì)量濃度增加而升高，呈現(xiàn)良好的質(zhì)量濃度依賴性。見圖1，圖2。

圖1 板黨多糖對MCF-7細(xì)胞的增殖抑制作用注：與正常對照組比較，aP<0.05。

圖2 板黨多糖對MCF-7細(xì)胞形態(tài)的影響

2.4 板黨多糖的體內(nèi)抗腫瘤活性 板黨多糖可以劑量依賴性抑制S180瘤株的生長，且低、中、高劑量與模型組相比差異均有顯著性(P<0.01)。見表1。

3 討論

研究已證實，多糖和皂苷是板黨的主要活性成分，板黨多糖的抗腫瘤活性國內(nèi)外報道甚少。本研究對板黨多糖干預(yù)昆明小鼠的抑瘤率、安全性評價以及體外增殖抑制等綜合考察，結(jié)果表明板黨多糖能夠直接抑制腫瘤細(xì)胞活性，在臨床抗腫瘤方面具有潛在價值，雖然，環(huán)磷酰胺也能抑制S180移植瘤的生長(P<0.05)，但考慮到臨床上化療藥物的毒副作用，以及對腫瘤患者術(shù)后給藥等因素，板黨多糖具有潛在的臨床抗腫瘤價值，但其藥效作用的確切結(jié)構(gòu)還有待于經(jīng)過進一步精制后確定。板黨多糖對細(xì)胞周期、細(xì)胞遷移相關(guān)蛋白表達(dá)、細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)、細(xì)胞免疫水平等機制的影響，值得采用免疫組化、體外細(xì)胞實驗等方法研究。

表1 板黨多糖對移植腫瘤生長的影響

注：與模型對照組比較，*P<0.05，﹡﹡P<0.01。

[1] 楊瑾,袁德培,陳龍全,等.黨參多糖類成分抗腫瘤活性的研究進展[J].湖北民族學(xué)院學(xué)報·醫(yī)學(xué)版,2011,28(3):67-68.

[2] 孫婉娟,徐斯凡,胡華剛,等.現(xiàn)代提取工藝在黨參中的應(yīng)用[J].中央民族大學(xué)學(xué)報·自然科學(xué)版,2013,22(1):65-68.

[3] 王桂紅,張駿,周松迪,等.板橋黨參多糖的含量測定[J].數(shù)理醫(yī)藥學(xué)雜志,2011,24(6):709-711.

[4] 陳奇.中藥藥理研究方法學(xué)[M].第3版.北京:人民衛(wèi)生出版社,2011:1 019-1 020.

[5] 楊豐榕,李卓敏,高建平.黨參多糖分離鑒定及體外抗腫瘤活性的研究[J].時珍國醫(yī)國藥,2011,22(12):2 876-2 878.

Experimental Studies on Antitumor Activity of Polysaccharides fromCodonopsisTangshen

YANG Jin1,DONG Xing-gao2,YUAN De-pei1,etal.

(1.SchoolofTraditionalChineseMedicine,HubeiUniversityforNationalities,Enshi445000,China；2.SchoolofMedicine,HubeiUniversityforNationalities,Enshi445000,China)

Objective To investigate the antitumor activity of Polysaccharides fromCodonopsistangshen.Methods Detection of anti-tumor activity in vitro was based on MTT assay, and the analysis in vivo was based on S180 tumor-bearing mice fed on Polysaccharides fromCodonopsistangshen. Acute toxicity was observed on mice with maximum dose. Results Polysaccharides fromCodonopsistangshensignificantly inhibited the proliferation of MCF-7 cells, tumor mass from tumor-bearing mice with small, medium, large doses was significantly smaller than that of the model group (P<0.05).Acute toxicity test mice survived.Conclusion Polysaccharides fromCodonopsistangshensignificantly inhibited tumor growth.

CodonopsistangshenOliv.; polysaccharides; antitumor;MCF-7;S180

湖北省衛(wèi)生廳青年科技人才項目(QJX2010-26)；湖北民族學(xué)院博士啟動基金項目(MY2010B003)。

楊瑾(1981- )，女，湖北恩施人，副教授，博士，研究方向：民族醫(yī)藥學(xué)。

R285.5

A

1008-8164(2014)01-0006-03

2013-11-20]