采用高效液相一測多評法對保和丸中陳皮和連翹的含量測定研究

楊 艷，張秀麗

(1.山西省食品藥品檢驗(yàn)所，山西太原 030001;2.繁峙縣人民醫(yī)院，山西繁峙 034300)

保和丸始載于《丹溪心法》，最早為水丸，由焦山楂、炒六神曲等8味藥組成，具消食、導(dǎo)滯、和胃作用，主要用于食積停滯、脘腹脹滿等癥?，F(xiàn)有161個(gè)生產(chǎn)企業(yè)，216個(gè)批準(zhǔn)文號，大、小蜜丸、水丸和濃縮丸4種劑型。濃縮丸執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)為《衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)》中藥成方制劑第七冊，除性狀外，僅收載有3味藥的顯微鑒別。為控制本產(chǎn)品質(zhì)量，故擬增加非標(biāo)方法陳皮中橙皮苷及連翹中連翹酯苷A的含量測定項(xiàng)。

1 儀器與試藥

儀器:WATERS Acquity UPLC超高效液相色譜儀，二極管陣列檢測器(沃特世科技有限公司)。

試藥:乙腈為色譜純;水為純化水;冰醋酸為分析純;其他試劑均為分析純。

對照品:連翹酯苷A、橙皮苷(供含測用，批號分別為L-012-110921、110721-200613)，均購于中國藥品生物制品檢定所。

樣品:藥都制藥集團(tuán)股份有限公司(生產(chǎn)批號:110304)。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

2.1.1 色譜柱的選擇 a)資生堂 C18柱(5 μm，4.6 mm ×250 mm);b)自裝柱富士填料 C18(5 μm，4.6 mm × 250 mm);c)Allitima C18(5 μm，4.6 mm ×250 mm)。分離良好，柱溫: 室溫，流 速:0.7 mL·min－1。

2.1.2 流動相的選擇 實(shí)驗(yàn)過程中共選擇了以下2種流動相系統(tǒng):

a)流動相A為乙腈，流動相B為0.5%冰醋酸溶液，線性梯度洗脫:0 min— A∶B=10∶90;60 min—A∶B=50∶50;b)流動相A為甲醇，流動相 B為0.5%冰醋酸溶液［1］，線性梯度洗脫:0 min—A∶B=10∶90;60 min— A∶B=50∶50。

結(jié)果表明，流動相系統(tǒng)中以第一種，即流動相A為乙腈，流動相 B為0.5%冰醋酸溶液，梯度洗脫0 min—A∶B=10∶90;60 min— A∶B=50∶50為最佳，譜圖上各個(gè)色譜峰的分離度較好，保留時(shí)間適中。因此選此流動相作為保和丸的含量測定的流動相(見表1)。

表1 流動相 %Table 1 Mobile Phase %

結(jié)果:采用以上色譜柱及流動相均能達(dá)到良好的分離效果(見圖1～3)。

圖1 連翹酯苷A對照品HPLC色譜圖Fig.1 HPLC Chromatogram Map of Forsythiaside A Controls

圖2 橙皮苷對照品HPLC色譜圖Fig.2 HPLC Chromatogram Map of Hesperidin Controls

圖3 保和丸供試品HPLC色譜圖(1.連翹酯苷A對照品，2.橙皮苷對照品)Fig.3 Baohe Pills and Samples HPLC Chromatogram Map(1.horsythiaside A controls，2.hesperidin controls)

2.1.3 檢測波長的選擇 參照《中國藥典》2010年版一部連翹藥材、陳皮藥材［含量測定］項(xiàng)下方法［2］，選擇二極管陣列檢測器，波長范圍190 nm～400 nm，提取280 nm波長處的色譜圖，色譜圖分離良好。

2.2 供試品提取方法的考察

2.2.1 提取溶劑的考察 分別采用50%甲醇、70%甲醇、85%甲醇、正丁醇、乙酸乙酯、甲醇超聲提取及加熱回流法［3］，通過比較，采用70%甲醇加熱回流提取法效果最佳。

2.2.2 提取時(shí)間的考察 采用加熱回流提取法，分別加熱30 min、45 min、60 min，結(jié)果見表2。

表2 提取時(shí)間考察結(jié)果 mg·g－1Table 2 The Inspection Results of Extraction Time mg·g－1

結(jié)果表明:加熱回流45 min與60 min含測結(jié)果雖相差不多，但考慮到能使大蜜丸充分溶散，故將加熱回流時(shí)間定為60 min。

2.3 專屬性實(shí)驗(yàn)

分別取處方中除連翹、陳皮外的全部藥味，按本品工藝及供試品溶液的制備方法制備陰性對照溶液，注入液相色譜儀進(jìn)行測定，結(jié)果表明:在連翹酯苷A、橙皮苷保留時(shí)間處無干擾。

2.4 耐用性實(shí)驗(yàn)

用不同儀器:日本島津LC-2010AHT型高效液相色譜儀，Agilent1200高效液相色譜儀;不同色譜柱:a)資生堂 C18柱(5 μm，4.6 mm×250 mm);b)自裝柱 富 士 填 料 C18(5 μm，4.6 mm× 250 mm);c)AllitimaC18(5 μm，4.6 mm ×250 mm)，均能達(dá)到良好的分離效果。

2.5 線性關(guān)系的考察

精密稱取連翹酯苷A對照品9.56 mg，置100 mL量瓶中，加70%甲醇使溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得。另精密稱取橙皮苷10.18 mg，置50 mL量瓶中，加70%甲醇使溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得。按不同進(jìn)樣量依法測定，以峰面積值為縱坐標(biāo)，進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，測得連翹酯苷A回歸方程為:A=1E+0.6X+806.4，r2=0.999，表明在0.019 ～ 0.956 μg范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系;橙皮苷回歸方程為:A=3E+0.6X+32 918，r2=0.999，表明在0.102 ～ 2.036 μg范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系。

2.6 精密度考察

取同一供試品(批號110304)溶液，同一進(jìn)樣量，連續(xù)進(jìn)樣6次，按實(shí)驗(yàn)條件依法測定，結(jié)果RSD連翹酯苷A為2.2%，橙皮苷為0.3%，符合要求。

2.7 穩(wěn)定性考察

取同一供試品(批號110304)溶液，每隔一定時(shí)間同一進(jìn)樣量，按實(shí)驗(yàn)條件依法測定，結(jié)果表明供試液在36 h內(nèi)穩(wěn)定，RSD分別為:連翹酯苷A為2.7%，橙皮苷為1.0%，符合要求。

2.8 重復(fù)性考察

按擬訂含量測定方法，對同一批號(批號110304)的6份樣品進(jìn)行平行實(shí)驗(yàn)，依法測定，平均含量連翹酯苷 A 為0.684 5 mg·g－1，橙皮苷為4.358 0 mg·g－1;RSD:連翹酯苷A為1.4%，橙皮苷為0.79%。

2.9 準(zhǔn)確度實(shí)驗(yàn)

采用加樣回收法，取上述重復(fù)性實(shí)驗(yàn)所用的樣品(1103041批)，取1 g(9份)，精密稱定，分別精密加入連翹酯苷 A 對照品約0.5 mg、0.7 mg、0.8 mg，橙皮苷對照品約3.4 mg、4.3 mg、5.3 mg，按擬定含測方法制備，依法測定，計(jì)算回收率，結(jié)果見表3。

回收率=［測得總量－(取樣量×重復(fù)性測得含量)］/加入對照品量×100%。

表3 回收率測定結(jié)果Table 3 Determination Results of Recovery Rate

2.10 限度確定

根據(jù)中國藥典2010年版一部項(xiàng)下規(guī)定，結(jié)合連翹、陳皮含量限度，按處方量及轉(zhuǎn)移率30%計(jì)算，暫定限度為:本品每克含連翹以連翹酯苷A計(jì)，不得少于0.1 mg·g－1，含陳皮以橙皮苷(C28H34O15)計(jì)，不得少于1.2 mg·g－1。

3 樣品的測定

依法對107批次樣品進(jìn)行測定，測得結(jié)果分別為橙皮苷:最低0.232 mg·g－1，最高4.871 mg·g－1，107批次濃縮丸50批次不合格，占46.7%;連翹酯苷A最低0.064 mg·g－1，最高2.391 mg·g－1，107 批次濃縮丸6批次不合格，占5.6%。

4 討論

4.1 標(biāo)準(zhǔn)項(xiàng)目缺失比較嚴(yán)重

不僅無法實(shí)現(xiàn)本品的標(biāo)準(zhǔn)可控和質(zhì)量安全有效的目標(biāo)，而且難以發(fā)現(xiàn)以次充好、以假充真、偷工減料等違法行為。因此，必須進(jìn)一步提高和完善本品的現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)。

4.2 部分藥材質(zhì)量狀況堪憂

本次抽驗(yàn)107批次樣品標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)和探索研究發(fā)現(xiàn)，雖未發(fā)現(xiàn)擅自不按處方投料、改變工藝等違法行為，但質(zhì)量方面的問題比較突出。

4.3 先進(jìn)技術(shù)手段明顯缺乏

本品現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)僅有顯微鑒別，未能采用一測多評等專屬性強(qiáng)、靈敏度高的先進(jìn)技術(shù)手段和方法進(jìn)行鑒別和含量測定，無法實(shí)現(xiàn)對本品整體質(zhì)量的有效控制。因此，本品現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)中應(yīng)積極引進(jìn)先進(jìn)的技術(shù)手段和方法，以確保質(zhì)量控制的全面準(zhǔn)確和科學(xué)深入。

［1］梁 艷，郜鳳香.高效液相色譜法測定木香分氣丸中橙皮苷含量［J］.中國藥業(yè)，2013，22(8):52-53.

［2］國家藥典委員會.中華人民共和國藥典(2010年版一部)［S］.北京:中國醫(yī)藥科技出版社，2010.

［3］孟 和，朱艷紅，吳學(xué)軍.HPLC法測定保和丸中連翹苷的含量［J］.中國藥事，2013，27(3):312-314.