日本血吸蟲童蟲在東方田鼠和昆明小鼠中的蛋白差異初探

朱政斌, 喻鑫玲

(1.湖南理工學(xué)院 化學(xué)化工學(xué)院, 湖南 岳陽 414006; 2. 湖南省血吸蟲病防治所, 湖南 岳陽 414000)

日本血吸蟲童蟲在東方田鼠和昆明小鼠中的蛋白差異初探

朱政斌1, 喻鑫玲2

(1.湖南理工學(xué)院 化學(xué)化工學(xué)院, 湖南 岳陽 414006; 2. 湖南省血吸蟲病防治所, 湖南 岳陽 414000)

東方田鼠具有天然抗日本血吸蟲活性, 為了篩選抗日本血吸蟲疫苗分子, 通過日本血吸蟲尾蚴感染東方田鼠和昆明小鼠, 感染11天后收集東方田鼠和昆明小鼠肝童蟲. 肝童蟲經(jīng)組織勻漿收集蛋白質(zhì)并進行蛋白質(zhì)定量后SDS-PAGE分離, 切取差異蛋白條帶進行蛋白質(zhì)鑒定. 發(fā)現(xiàn)差異蛋白主要為日本血吸蟲結(jié)構(gòu)蛋白, 能量代謝相關(guān)蛋白以及熱休克蛋白等. 為進一步研究抗日本血吸蟲疫苗奠定了基礎(chǔ).

東方田鼠; 日本血吸蟲童蟲; 結(jié)構(gòu)蛋白; 能量代謝相關(guān)蛋白; 熱休克蛋白

血吸蟲病是六大重點熱帶病之一, 主要流行于非洲、中東、南美、東亞和東南亞的76個國家和地區(qū).全球大約有6億多人受到威脅, 2億多人受感染, 2000多萬人有嚴(yán)重臨床癥狀[1]. 日本血吸蟲病在我國長江中下游地區(qū)廣泛存在, 是我國主要的寄生蟲病[2]. 東方田鼠是唯一對日本血吸蟲有抗性的嚙齒類哺乳動物,是研究日本血吸蟲抗病機制的最佳動物模型[3]. 研究發(fā)現(xiàn), 日本血吸蟲尾蚴感染東方田鼠由皮膚進入體內(nèi)移行, 經(jīng)過肺臟至肝臟, 在肝臟中停止發(fā)育并最終在肝臟消亡[4]. 篩選東方田鼠抗日本血吸蟲抗性相關(guān)的靶分子, 對研制抗日本血吸蟲疫苗和治療藥物具有重要借鑒意義[5]. 本文通過蛋白質(zhì)組學(xué)方法, 篩選日本血吸蟲童蟲在東方田鼠和昆明小鼠肝臟中的差異蛋白, 進一步深入了解東方田鼠感染日本血吸蟲后的抗日本血吸蟲機制, 為進一步研究開發(fā)抗日本血吸蟲抗原提供依據(jù).

1 材料與方法

1.1 實驗動物

東方田鼠(80～100克)由湖南省血吸蟲防治研究所提供, SPF級昆明小鼠(25～28克)購自湖南景達斯萊克實驗動物中心. 每種動物在實驗中均隨機分組, 雌雄各半. 每組動物均感染30只.

1.2 童蟲收集和動物感染

感染日本血吸蟲陽性釘螺由湖南省血吸蟲病防治所篩選. 在室溫條件下, 用雙蒸水將陽性釘螺洗滌干凈, 將其置于三角瓶中, 然后在光照條件下逸尾蚴, 使用腹部貼片法感染, 每只東方田鼠感染1000條尾蚴, 每只昆明小鼠感染50條尾蚴, 感染時間20min. 感染11天后, 從動物肝臟收集童蟲, 童蟲收集方法為將動物肝臟組織剪成小塊后在生理鹽水中讓童蟲釋放, 在解剖鏡下收集童蟲.

1.3 童蟲蛋白提取與分離

將從東方田鼠和昆明小鼠肝臟中收集的童蟲分別進行組織勻漿, 組織勻漿在緩沖液中(緩沖液為5 mM HEPES-KOH, pH 7.5, 0.05% Nonidet P-40, 0.5 mM Na3EGTA, 0.5 mM Na3EDTA, and protease inhibitors cocktail; Roche公司產(chǎn)品)進行, 操作溫度為4℃, 勻漿后進行離心, 離心條件為離心力10000g, 溫度為4℃,離心時間20min, 離心完成后收集上清. 上清液蛋白質(zhì)濃度用BCA試劑盒進行蛋白質(zhì)定量. 蛋白質(zhì)定量后進行SDS-PAGE分離, SDS-PAGE采用4-15%線性梯度分離膠進行分離.

1.4 差異蛋白質(zhì)提取

差異蛋白質(zhì)提取方法如文獻[6]所示, 基本過程如下: (1)脫色: 考馬斯亮藍染色的蛋白質(zhì)條帶切下后置于微量離心管中, 用去離子水沖洗兩次后加入 25mmol/L 碳酸氫銨/50%乙腈脫色直至考馬斯亮藍完全被清除, 吸干溶液后切碎膠塊, 并用 200mmol／L的碳酸氫銨溶液清洗, 用 100%乙腈脫水至膠塊變?yōu)榘咨? 真空干燥. (2)還原和烷基化: 在上述處理的樣品中加入50μL100 mmol/L碳酸氫銨(含DTT 10mmol/L), 57℃保溫l h后室溫冷卻, 除掉過量溶液, 迅速加入等體積的用100 mmol/L 碳酸氫銨新鮮配制的55mmol／L碘乙酰胺, 暗室常溫反應(yīng)30min, 反應(yīng)完成后用100mmol/L的碳酸氫銨洗滌, 再用100%乙腈脫水后凍干．(3)酶解: TPCK胰蛋白酶用50mmol/L的碳酸氫銨(含5mmol/L CaCl2)配成0.1g/L的溶液, 每管加入10μL酶解液, 待膠塊吸收后將多余酶液吸去, 之后加入20 μL不含酶的緩沖液覆蓋, 于37℃過夜消化. (4)萃取: 將酶解后的肽用50μL5%TFA/50%ACN 進行萃取兩次, 合并萃取液, 凍干后進行質(zhì)譜分析.

1.5 Q-TOF MS質(zhì)譜分析與數(shù)據(jù)庫檢索

酶解產(chǎn)物鑒定方法根據(jù)文獻[6]進行, 質(zhì)譜儀為英國Micromasss公司生產(chǎn)的電噴霧—四極桿一飛行時間串聯(lián)質(zhì)譜Micro Q-TOF, 連接毛細(xì)管色譜柱液相色譜儀和鈉升噴霧源. 待測樣品進行全自動分析, 經(jīng)Cl8毛細(xì)管柱梯度洗脫后進行肽段分離, 本次實驗操作的梯度為一小時中乙晴濃度從5%至50%, 流速3μL/min,將分離后的肽段直接進入ESI離子源, 其中強度超過閾值的肽段自動進行MS／MS測定. 所有MS的數(shù)據(jù)測定均在正離子模式下進行. 質(zhì)譜儀的校正是采用PPG-2000的串聯(lián)碎片校正的, 質(zhì)量誤差為士0.1Da. 質(zhì)譜數(shù)據(jù)以pk1.的文件格式提交Mascot搜索, 數(shù)據(jù)庫選NCBInr.

2 實驗結(jié)果與討論

2.1 童蟲提取蛋白SDS-PAGE分離

童蟲提取蛋白進行SDS-PAGE分離后進行考馬斯亮藍染色, 結(jié)果如圖1. 采用軟件進行分析, 發(fā)現(xiàn)從東方田鼠和昆明小鼠中分離獲得的童蟲有10個差異條帶. 這些差異條帶在低分子量到高分子量區(qū)間均有分布.

圖1 日本血吸蟲童蟲提取蛋白SDS-PAGE分離圖譜

2.2 質(zhì)譜數(shù)據(jù)檢索結(jié)果

質(zhì)譜數(shù)據(jù)數(shù)據(jù)庫掃描結(jié)果如圖 2所示,可以確定多肽序列和蛋白質(zhì)序列以及蛋白質(zhì)名稱等信息. 質(zhì)譜數(shù)據(jù)的數(shù)據(jù)庫檢索結(jié)果見表 1. 由表 1的數(shù)據(jù)可以看出, 日本血吸蟲在東方田鼠和昆明小鼠肝臟中差異蛋白質(zhì)主要體現(xiàn)在結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)部分: 如Actin蛋白和Keratin蛋白; 能量代謝蛋白部分: 如蘋果酸脫氫酶、ATP合酶beta亞基等; 熱休克蛋白部分: 如 HSP60、HSP70、HSP75以及HSP83等蛋白質(zhì). 日本血吸蟲童蟲結(jié)構(gòu)蛋白在東方田鼠肝臟內(nèi)表達水平下調(diào), 據(jù)此可以說明東方田鼠可能通過抑制日本血吸蟲童蟲結(jié)構(gòu)蛋白表達,從而實現(xiàn)抑制日本血吸蟲發(fā)育. 日本血吸蟲童蟲能量代謝蛋白下調(diào), 說明日本血吸蟲童蟲在東方田鼠體內(nèi)代謝水平低下, 能量代謝受阻, 從而影響日本血吸蟲在東方田鼠體內(nèi)發(fā)育. 同時日本血吸蟲在東方田鼠體內(nèi)熱休克蛋白高水平表達, 說明東方田鼠體內(nèi)環(huán)境不利于日本血吸蟲童蟲發(fā)育. 從不同類型蛋白質(zhì)表達水平的差異說明東方田鼠通過多途徑、多手段實現(xiàn)對日本血吸蟲的殺滅作用.從目前日本血吸蟲疫苗的研究現(xiàn)狀以及非適宜宿主東方田鼠對日本血吸蟲殺滅作用研究發(fā)現(xiàn), 單一蛋白疫苗在日本血吸蟲減蟲率和減卵率方面作用有限, 需要通過開發(fā)多價疫苗才可能達到抑制日本血吸蟲發(fā)育以至殺滅.

圖2 Actin蛋白質(zhì)多肽片段質(zhì)譜解析結(jié)果

表1 日本血吸蟲童蟲在東方田鼠和昆明小鼠肝臟差異蛋白質(zhì)

[1] Chitsulo L, Engel D, Montrosor A, et al. The global status of schistoeomissis and its control[J]. Acta Trop, 2000, 27(1): 41～51

[2] 周曉農(nóng), 汪天平, 林丹丹, 等. 我國血吸蟲病防治研究現(xiàn)狀與發(fā)展戰(zhàn)略思考[J]. 中國血吸蟲病防治雜志, 2004, 17(1): 1～3

[3] 姚利曉, 林嬌嬌, 蔡幼民, 等. 東方田鼠抗日本血吸蟲的研究進展[J]. 中國血吸蟲病防治雜志, 2003, 15(6): 471～473

[4] 賀宏斌, 左家錚, 周利紅. 東方田鼠實驗感染日本血吸蟲的研究[J]. 湖南醫(yī)學(xué), 1992, 9(2): 65～67

[5] 袁忠英, 沈玉娟, 曹建平, 等. 東方田鼠血清免疫篩選日本血吸蟲童蟲cDNA文庫及新基因分析[J]. 中國血吸蟲病防治雜志, 2008, 20(4): 255～259

[6] 聶東宋, 劉 宇, 吳 喆, 等. 莽山烙鐵頭蛇粗毒雙向凝膠電泳分析[J]. 湖南理工學(xué)院學(xué)報, 2011, 24(1): 48～51

The Differential Proteins of the Hepatic Schistosomula in the Liver of the Microtus Fortis and Mouse

ZHU Zheng-bin1, YU Xin-ling2
(1. College of Chemistry and Chemical Engineering, Hunan Institute of Science and Technology, Yueyang 414006, China; 2. Hunan Institute of Parasite Disease, Yueyang 414000, China)

Microtus fortis is naturally resistant to Schistosoma japonicum．In order to find against Schistosoma japonicum antigen, the Microtus fortis and Kunming mouse are used in this study. They are challenged with cercariae of Schistosoma japonicum. The livers of the microtus fortis and mouse are collected at 11 days after infection. The proteins from the hepatic Schistosomula separated with SDS-PAGE. The differential proteins are analyzed by in-gel digestion and MS/MS identification. The result shows that the structure protein and energy metabolism protein are significantly down-regulated in the liver of Microtus fortis at 11 days after infection. The heat shock proteins are significantly up-regulated in the liver of Microtus fortis at 11 days after infection.

Microtus fortis; hepatic schistosomula; structure protein; energy metabolism protein; heat shock protein

Q516

A

1672-5298(2014)04-0071-03

2014-10-21

湖南省科技廳科研條件創(chuàng)新專項(2010[D203])

朱政斌(1962? ), 男, 湖南岳陽人, 湖南理工學(xué)院化學(xué)化工學(xué)院實驗師. 主要研究方向: 生物化工, 有機合成