驢CSN3基因序列分析

陳建興，陳海偉，畢曉丹，王銀朝，雷戰(zhàn)

（1.赤峰學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，內(nèi)蒙古 赤峰 024000；2.山東東阿阿膠股份有限公司，山東 聊城 252201）

驢CSN3基因序列分析

陳建興1，陳海偉1，畢曉丹1，王銀朝2，雷戰(zhàn)2

（1.赤峰學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，內(nèi)蒙古 赤峰 024000；2.山東東阿阿膠股份有限公司，山東 聊城 252201）

陳建興,男,1980年出生于山西省運(yùn)城市芮城縣,1999年考入西北民族大學(xué)就讀動(dòng)物科學(xué)專業(yè)。2006年考入青島農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院攻讀動(dòng)物遺傳育種與繁殖專業(yè)碩士，2009年獲農(nóng)學(xué)碩士學(xué)位。同年考入內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院攻讀動(dòng)物遺傳育種與繁殖專業(yè)博士學(xué)位，師從雙博士芒來(lái)教授。2012年獲農(nóng)學(xué)博士學(xué)位。主要研究方向?yàn)閯?dòng)物分子遺傳學(xué)。

家驢具有很大的市場(chǎng)開發(fā)潛力和價(jià)值.本研究通過(guò)生物信息學(xué)技術(shù)分析了家驢CSN 3基因的序列特征，為家驢向肉用或乳用方向選育初步提供一定的分子依據(jù).經(jīng)分析研究發(fā)現(xiàn)家驢CSN 3基因共包含五個(gè)外顯子和四個(gè)內(nèi)含子.初始轉(zhuǎn)錄物的前81nt為5'UTR區(qū)，后205nt為3'UTR區(qū)，中間的549nt為CDS區(qū).整個(gè)CDS區(qū)翻譯出182個(gè)氨基酸構(gòu)成的多肽.家驢的κ酪蛋白中的氨基酸以脯氨酸所占的比例最高（14.286%），其次為纈氨酸（10.989%），最低的為半胱氨酸、色氨酸和甘氨酸（所占比例都為0.5495%）.各物種κ酪蛋白氨基酸序列間每個(gè)位點(diǎn)氨基酸替代數(shù)的平均值的大小能夠較好反映物種間親緣關(guān)系的遠(yuǎn)近.κ酪蛋白氨基酸序列能夠很好地反映物種之間的親緣關(guān)系，適合用于系統(tǒng)發(fā)育分析.

驢；CSN 3基因；κ酪蛋白；序列分析

家驢（Equus asinus）是人類大約6,000年前從非洲野驢（Equus africanus）的一個(gè)或者兩個(gè)亞種馴化而來(lái)的[1,2].隨后，在許多文化體系中，家驢一直作為主要的馱運(yùn)家畜為人類文明的發(fā)展做出了巨大貢獻(xiàn).時(shí)至今日，家驢和騾子在許多貧窮并且氣候干旱的地區(qū)仍是運(yùn)輸重物、人員和財(cái)物的主要馱畜[3].但隨著農(nóng)業(yè)機(jī)械化和交通運(yùn)輸業(yè)的快速發(fā)展，在發(fā)達(dá)國(guó)家以及一些國(guó)家的發(fā)達(dá)地區(qū)，家驢這樣的馱運(yùn)動(dòng)物已被淘汰，這就導(dǎo)致不僅個(gè)別品種消失，而且家驢該物種整體也出現(xiàn)種質(zhì)退化和種群數(shù)量下降的趨勢(shì)[4].我國(guó)家驢的養(yǎng)殖數(shù)量一直居世界之首[4,5]，家驢的種質(zhì)資源退化狀況與世界范圍內(nèi)的整體局勢(shì)相似[5].

在哺乳動(dòng)物中，CSN3基因編碼的κ酪蛋白是乳中的主要蛋白成分之一[6]，并且，該蛋白成分決定乳微粒的大?。ㄈ槲⒘Ｄ茉黾拥V物質(zhì)的溶解度并協(xié)助營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)從母體傳遞到幼體）和特定功能（κ酪蛋白被凝乳酶分解的產(chǎn)物負(fù)責(zé)乳凝結(jié)）[7].一般情況下，CSN3基因包括5個(gè)外顯子，并且第4外顯子編碼成熟蛋白中的160～169個(gè)氨基酸.第四外顯子編碼的多肽鏈長(zhǎng)度占整個(gè)成熟蛋白的85%左右.趙春江等發(fā)現(xiàn)CSN3基因與中國(guó)荷斯坦牛乳蛋白率含量有顯著相關(guān)[8].藍(lán)賢勇等的研究發(fā)現(xiàn)，CSN3基因?qū)δ躺窖虍a(chǎn)羔數(shù)有顯著影響[9].Hobor等（2006）[10]鑒定了三個(gè)家馬品種CSN3第一和第四外顯子上的各兩個(gè)SNP位點(diǎn)，隨后，又對(duì)馬屬動(dòng)物該基因的啟動(dòng)子區(qū)和第四外顯子區(qū)序列進(jìn)行了比較分析[11]. Selvaggi等[12]研究了Murgese馬CSN3第一外顯子兩個(gè)位點(diǎn)的遺傳多態(tài)性.

對(duì)于家驢CSN3基因的研究，只是在Hobor（2008）的研究[11]中附帶與家馬和斑馬的部分相應(yīng)序列做了比較分析，并未見到專門的研究報(bào)道.為此，本研究通過(guò)生物信息學(xué)技術(shù)初步分析家驢CSN3基因的序列特征，為家驢向肉用或乳用方向選育提供科學(xué)參考，為我國(guó)家驢的遺傳改良提供分子依據(jù).

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)來(lái)源

所使用的CSN3基因序列，全部來(lái)自GenBank.家驢、家馬、家貓、虎鯨、駱駝、狒狒、人、豬、綿羊、牛、兔、褐鼠和家鼠的GenBank登錄號(hào)分別為：FR822990、NM_001081884、XM_003985304、XM_00 4268339、HE863813、XM_003898807、NM_005212、NM_001004026、NM_001009378、NM_174294、NM_ 001082625、NM_031562和NM_007786.

1.2 分析方法

序列間每個(gè)位點(diǎn)的氨基酸替代分析采用泊松矯正模型來(lái)進(jìn)行.各物種κ酪蛋白氨基酸組成分析、進(jìn)化分歧估計(jì)和進(jìn)化樹構(gòu)建通過(guò)MEGA5來(lái)完成.

2 結(jié)果及分析

2.1 家驢CSN3基因基本構(gòu)成

家驢CSN3基因的外顯子和內(nèi)含子的大小構(gòu)成情況參見圖1.從圖中可見，家驢CSN3基因共包含五個(gè)外顯子和四個(gè)內(nèi)含子.前三個(gè)外顯子都非常小，第四外顯子序列長(zhǎng)度占整個(gè)初始轉(zhuǎn)錄物長(zhǎng)度的59.4%.根據(jù)GenBank上登錄的信息（登錄號(hào)為FR822990），該初始轉(zhuǎn)錄物的前81nt為5'UTR區(qū)，后205nt為3'UTR區(qū)，中間的549nt為CDS區(qū).整個(gè)CDS區(qū)翻譯出182個(gè)氨基酸構(gòu)成的多肽.多聚腺苷酸（polyA）信號(hào)位于第五外顯子的末端.

圖1 家驢CSN3基因基本結(jié)構(gòu)模式圖白色框表示外顯子，灰色框代表內(nèi)含子.

2.2 家驢κ酪蛋白氨基酸組成分析

通過(guò)對(duì)家驢等13個(gè)物種的κ酪蛋白氨基酸組成進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，氨基酸序列長(zhǎng)度以褐鼠的最?。?78），綿羊的最大（192），而一半左右物種（包括驢、人、虎鯨、家貓、駱駝和狒狒）的長(zhǎng)度為182.從氨基酸組成情況來(lái)看，由于狒狒與人的親緣關(guān)系最近，固然二者應(yīng)該最為相似.但家驢與人的κ酪蛋白六種氨基酸（半胱氨酸、天冬氨酸、甘氨酸、蛋氨酸、天冬酰胺和精氨酸）的比例（依次為0.5495%、1.6484%、0.5495%、1.0989%、6.044%和4.3956%）驚人地一致，這在這些物種（除狒狒外）中是絕無(wú)僅有的.家驢的κ酪蛋白中的氨基酸以脯氨酸所占的比例最高（14.286%），其次為纈氨酸（10.989%），最低的為半胱氨酸、色氨酸和甘氨酸（所占比例都為0.5495%）.

2.3 κ酪蛋白氨基酸序列進(jìn)化分歧估計(jì)

表1中顯示的是各物種κ酪蛋白氨基酸序列間每個(gè)位點(diǎn)氨基酸替代數(shù)的平均值，從中可以看出，該值的最小值為驢和馬之間的0.034±0.013，其次為人和狒狒間的0.080±0.020.綿羊和牛也比較小，為0.159±0.030.可以看出，分歧的大小能夠較好反映物種間親緣關(guān)系的遠(yuǎn)近.驢和人氨基酸序列之間的每位點(diǎn)的平均替代數(shù)為0.411±0.052. 2.4κ酪蛋白氨基酸序列系統(tǒng)發(fā)育分析

基于泊松矯正模型，采用最大似然法構(gòu)建了13個(gè)物種κ酪蛋白氨基酸序列的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，結(jié)果見圖2.通過(guò)自展法（1000次重復(fù)）對(duì)系統(tǒng)發(fā)育樹各分支之間的聚類關(guān)系進(jìn)行了評(píng)價(jià)，自展值顯示在分支上.從圖2可以看出，嚙齒目的褐鼠和家鼠、靈長(zhǎng)類的人和狒狒以及馬屬動(dòng)物的驢和馬都分別100%地聚在了一起，綿羊和牛這兩個(gè)反芻動(dòng)物也97%都聚在了一起.另外，雖然有些分支自展值不是很高，比如，豬和駱駝聚在一起，再與綿羊和牛的分支聚在一起，這四種偶蹄動(dòng)物聚在了一起，也反映出了一定的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系.說(shuō)明κ酪蛋白氨基酸序列能夠很好地反映物種之間的親緣關(guān)系，適合作為系統(tǒng)發(fā)育分析的材料.

表1 序列間進(jìn)化分歧估計(jì)

圖2 最大似然法構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹

3 討論與結(jié)論

在反芻動(dòng)物中，對(duì)于CSN3基因的研究比較多見[8,9]，并且也都對(duì)該基因的多態(tài)與生產(chǎn)性狀進(jìn)行了關(guān)聯(lián)分析.而對(duì)于馬屬動(dòng)物，只是偶見對(duì)家馬CSN3基因的啟動(dòng)子區(qū)和第一、第四外顯子的遺傳多態(tài)性進(jìn)行了調(diào)查[10～12]，并未見到更進(jìn)一步的研究報(bào)道.對(duì)于家驢CSN3基因的研究報(bào)道，更是接近空白.雖然CSN3主要是在乳中表達(dá)的一個(gè)基因，藍(lán)賢勇等的研究發(fā)現(xiàn)，CSN3基因?qū)δ躺窖虍a(chǎn)羔數(shù)有顯著影響[9].對(duì)于家驢來(lái)說(shuō)，該基因的多態(tài)有無(wú)，多態(tài)對(duì)生長(zhǎng)和產(chǎn)乳有無(wú)影響，都還是未知的.可見，未來(lái)對(duì)此基因的研究具有很大的意義，有可能找到對(duì)家驢開發(fā)利用有價(jià)值的分子標(biāo)記位點(diǎn).因此，本研究通過(guò)生物信息學(xué)技術(shù)初步分析家驢CSN3基因的序列特征，為將來(lái)探尋該基因的多態(tài)性打下基礎(chǔ).

由家驢等物種的κ酪蛋白氨基酸組成分析結(jié)果可以看出，家驢與人的六種氨基酸（Cys、Asp、Gly、Met、Asn和Arg）在κ酪蛋白中所占的比例完全一致，這在除狒狒外的物種中是僅有的.可見，在該酪蛋白的組成上，驢與人比較接近.考慮到κ酪蛋白是乳中的一種主要蛋白，我們也支持張曉瑩等在對(duì)驢乳的化學(xué)成分進(jìn)行分析的基礎(chǔ)上，提出的驢乳相比牛乳或羊乳更適合作為母乳的替代物的觀點(diǎn)[13].

家驢CSN3基因共包含五個(gè)外顯子和四個(gè)內(nèi)含子.初始轉(zhuǎn)錄物的前81nt為5'UTR區(qū)，后205nt為3'UTR區(qū)，中間的549nt為CDS區(qū).整個(gè)CDS區(qū)翻譯出182個(gè)氨基酸構(gòu)成的多肽.家驢的κ酪蛋白中的氨基酸以脯氨酸所占的比例最高（14.286%），其次為纈氨酸（10.989%），最低的為半胱氨酸、色氨酸和甘氨酸（所占比例都為0.5495%）.各物種κ酪蛋白氨基酸序列間每個(gè)位點(diǎn)氨基酸替代數(shù)的平均值的大小能夠較好反映物種間親緣關(guān)系的遠(yuǎn)近.κ酪蛋白氨基酸序列能夠很好地反映物種之間的親緣關(guān)系，適合用于系統(tǒng)發(fā)育分析.

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Q523

A

1673-260X（2014）07-0011-03

本文系陳建興主持2013年度內(nèi)蒙古自治區(qū)高等學(xué)?？茖W(xué)研究項(xiàng)目（NJZC13306）研究成果