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    運動預(yù)適應(yīng)保護(hù)效應(yīng)中大鼠心肌B型鈉尿肽表達(dá)的變化

    2014-07-19 11:51:48劉澤廣潘珊珊苑建齊
    體育科學(xué) 2014年9期
    關(guān)鍵詞:染色血漿顯著性

    劉澤廣,潘珊珊,郝 喆,陸 矯,苑建齊

    運動預(yù)適應(yīng)保護(hù)效應(yīng)中大鼠心肌B型鈉尿肽表達(dá)的變化

    劉澤廣,潘珊珊,郝 喆,陸 矯,苑建齊

    目的:探討運動預(yù)適應(yīng)(EP)對心肌BNP表達(dá)變化的影響以及在運動預(yù)適應(yīng)保護(hù)效應(yīng)期間BNP是否發(fā)揮了保護(hù)效應(yīng)。方法:SD大鼠分為對照組(C組)、大強度運動組(HE組)、早期運動預(yù)適應(yīng)組(EEP組)、晚期運動預(yù)適應(yīng)組(LEP組)、早期運動預(yù)適應(yīng)+大強度運動組(EEP+HE組)、晚期運動預(yù)適應(yīng)+大強度運動組(LEP+HE組)。在EP動物模型基礎(chǔ)上,通過大強度運動致大鼠運動性心肌損傷。用免疫化學(xué)發(fā)光法檢測血漿cTnI含量,HE染色、HBFP染色法和變色酸2R-亮綠染色法檢測心肌形態(tài)及缺血缺氧改變。分別通過免疫組織化學(xué)法和酶聯(lián)免疫吸附法檢測心肌組織和血漿中的BNP表達(dá)變化。結(jié)果:與C組相比,HE組cTnI和缺血缺氧水平顯著升高,而EEP組和LEP組無顯著差異;HE組、EEP組和LEP組心肌組織BNP均呈顯著性升高,而血漿BNP僅HE組和EEP組有顯著性升高,LEP組卻無明顯差異。與HE組相比,EEP+HE組和LEP+HE組cTnI和缺血缺氧水平明顯下降,心肌組織BNP均呈顯著性升高,而血漿BNP僅LEP+HE組有顯著升高,EEP+HE組無顯著性差異。結(jié)論:EP可有效促進(jìn)心肌分泌BNP,且BNP參與了EP對運動性心肌損傷的保護(hù)效應(yīng)。

    B型鈉尿肽;運動預(yù)適應(yīng);心肌保護(hù)效應(yīng);心肌損傷;大鼠

    B型鈉尿肽(B-type natriuretic peptide,BNP),是鈉尿肽家族中的一員,1988年首次在豬腦中被發(fā)現(xiàn)[36],是一種含有23個氨基酸的多肽,主要來源于左心室[24,25]。研究表明,BNP的表達(dá)量與心肌機(jī)械張力、神經(jīng)激素調(diào)節(jié)系統(tǒng)以及心動過速等因素有關(guān)[38]。BNP在心房及心室的儲存量都較少,因此,當(dāng)心肌受到刺激時,BNP呈爆發(fā)式合成以實現(xiàn)快速分泌。BNP與心鈉素的功能相似,具有利尿、利鈉和抗醛固酮的作用,可以達(dá)到緩解心肌前負(fù)荷及后負(fù)荷的效果[11],以增加心搏出量。在臨床方面,BNP對心衰的治療和診斷作用受到了日益的重視,一種重組的B型鈉尿肽藥物在治療失代償心衰方面表現(xiàn)出了顯著的療效[8,12]。另外,BNP是診斷心衰較為敏感的標(biāo)志物[1,9],并且對心衰具有較強的預(yù)后價值[27]。

    近年來,運動預(yù)適應(yīng)的保護(hù)效應(yīng)不斷被人們所熟知,反復(fù)短暫的間歇性大強度運動可造成心肌反復(fù)短暫的相對缺血缺氧,通過運動誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生內(nèi)源性心肌保護(hù)效應(yīng)的方式稱之為運動預(yù)適應(yīng)(exercise preconditioning,EP)[29,34]。EP的心肌保護(hù)效應(yīng)分為兩個時間窗:運動結(jié)束后即刻產(chǎn)生,持續(xù)1~3 h的早期保護(hù)效應(yīng);運動結(jié)束24 h后產(chǎn)生,持續(xù)24~72 h的晚期保護(hù)效應(yīng)。在EP保護(hù)效應(yīng)的細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中主要涉及觸發(fā)物質(zhì)、中介物質(zhì)和效應(yīng)物質(zhì),在本課題組前期的工作中,已對中介物質(zhì)中的蛋白激酶C[2]、效應(yīng)物質(zhì)中的ATP敏感鉀離子通道、降鈣素基因相關(guān)肽等[6,7]物質(zhì)進(jìn)行了研究,但觸發(fā)物質(zhì)中的BNP在EP保護(hù)效應(yīng)中的表達(dá)變化如何,尚待進(jìn)一步的研究。在運動過程中,由于交感神經(jīng)活動的增強,血壓升高,心率加快,室內(nèi)充盈壓上升,從而促進(jìn)了BNP的合成和分泌。有研究表明,長期劇烈運動可顯著提高血漿BNP的濃度[28]。隨著研究的不斷深入,人們發(fā)現(xiàn)一次短時間運動也可以有效促進(jìn)BNP的分泌[15,21,32]。據(jù)此,本研究假設(shè)EP這種運動方式可以促進(jìn)心肌產(chǎn)生BNP,并且在隨后心肌耐受長時間缺血缺氧的過程中發(fā)揮效能。因此,我們在EP動物模型的基礎(chǔ)上,用一次長時間大強度運動致大鼠運動性心肌損傷,采用血漿cTnI檢測及HE、缺血缺氧染色法綜合評價運動對心肌的損傷情況;分別通過免疫組織化學(xué)法和酶聯(lián)免疫吸附法檢測心肌組織和血漿中的BNP表達(dá)變化,以探討EP是否可以有效的促進(jìn)心肌分泌BNP,并且,在EP保護(hù)效應(yīng)中是否發(fā)揮了重要作用,為EP心肌保護(hù)效應(yīng)與機(jī)制提供理論基礎(chǔ)和實驗依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 實驗對象與分組

    健康雄性Sprague-Dawley大鼠150只,體重237±18 g(購自上海西普爾-必凱實驗動物有限公司)。大鼠常規(guī)分籠飼養(yǎng),5只/籠,均以標(biāo)準(zhǔn)嚙齒類動物飼料喂養(yǎng)(購自第二軍醫(yī)大學(xué)實驗動物中心),自由飲食。室溫20℃~22℃,相對濕度45%~50%,光照時間為12 h/d。大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)一周,期間進(jìn)行3天的適應(yīng)性訓(xùn)練:大鼠進(jìn)行跑臺運動,速度為15 m/min,運動10 min。在適應(yīng)性訓(xùn)練結(jié)束后,將大鼠體重分層,進(jìn)行隨機(jī)分組。總共分為6組:對照組(control group,C組)、大強度運動組(high-intensity exercise group,HE組)、早期運動預(yù)適應(yīng)組(early exercise preconditioning group,EEP組)、晚期運動預(yù)適應(yīng)組(late exercise preconditioning group,LEP組)、早期運動預(yù)適應(yīng)+大強度運動組(early exercise preconditioning plus high-intensity exercise group,EEP+HE組)、晚期運動預(yù)適應(yīng)+大強度運動組(late exercise preconditioning plus high-intensity exercise group,LEP+HE組)。

    1.2 動物模型建立

    1.3 動物取材

    大鼠腹腔采用10%水合氯醛以40 mg/100 g的劑量進(jìn)行麻醉,后將大鼠仰臥位固定于手術(shù)臺上,打開腹腔,下腔靜脈取血5 ml后,靜置15~30 min,離心取血漿,-80℃保存,用于血漿cTnI和血漿BNP的檢測。每組大鼠隨機(jī)抽取12只,打開大鼠胸腔,暴露心臟,于大鼠心尖下插入灌注針,灌注0.85%生理鹽水250 ml~300 ml,并注入1%肝素抗凝,剪斷大鼠下腔靜脈,待流出液體基本無色后,灌注4%多聚甲醛250 ml~300 ml,整個過程在30 min內(nèi)完成。取出心臟,4%多聚甲醛中后固定24 h。常規(guī)梯度酒精脫水、二甲苯透明、浸蠟、石蠟包埋,用于心肌HE、缺血缺氧染色和BNP免疫組織化學(xué)實驗。

    1.4 血漿cTnI含量檢測

    用免疫化學(xué)發(fā)光法(Chemiluminescent Immunoassay)測定血漿cTnI的含量。采用單克隆抗體試劑(堿性磷酸酶標(biāo)記),以磁微粒為固相載體,Dioxetane磷酸酯(堿性磷酸酶的底物)為發(fā)光劑,超靈敏光電倍增管接受抗體-抗原反應(yīng)激發(fā)的發(fā)光信號。儀器為Beckman Coulter公司生產(chǎn)的Access 2 immunoassay system(全自動化學(xué)發(fā)光免疫測定系統(tǒng))。試劑由儀器生產(chǎn)廠家配套供應(yīng),線性范圍為0.01~99.99 ng/ml。

    1.5 心肌組織HE及缺血缺氧染色實驗

    三種染色方法均先將石蠟切片進(jìn)行常規(guī)脫蠟至水,蘇木精染色。HE染色通過伊紅浸染,觀察心肌組織形態(tài)改變;蘇木素-堿性復(fù)紅-苦味酸(hematoxylin basic fuchsin picric acid,HBFP)染色法:在0.1%堿性復(fù)紅浸染3 min,去離子水沖洗后,先在丙酮Ⅰ浸洗5 s,后在0.1%苦味酸丙酮中浸染15~20 s,再入丙酮Ⅱ浸洗5 s;變色酸2R-亮綠(chromotrope 2R-brilliantgreen,C-2R)染色法:入變色酸2R液浸染10 min,后用0.2%冰醋酸水溶液沖洗2~3次,再浸入含有0.5%亮綠的20%酒精溶液中10 min。所有切片染色過后,均進(jìn)行脫水、透明、封片,制成相應(yīng)染色切片。

    1.6 血漿BNP含量檢測

    采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測大鼠血漿BNP含量。測定前將試劑盒放置室溫40 min,分別設(shè)定空白孔、待測樣品孔、標(biāo)準(zhǔn)孔,空白對照孔不加樣本;待測樣品孔加入樣本40 μl;標(biāo)準(zhǔn)品孔加入不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品50 μl,然后各加入抗-BNP抗體10 μl,鏈酶親和素-HRP 50 μl。蓋上封板膜后,37℃溫育60 min。洗滌后每孔先加入顯色劑A 50 μl,再加入顯色劑B 50 μl,37℃避光反應(yīng)10 min。每孔加終止劑50 μl,終止反應(yīng)。根據(jù)制備的標(biāo)準(zhǔn)曲線,計算樣本含量。

    1.7 心肌組織BNP免疫組織化學(xué)實驗

    采用免疫組織化學(xué)SABC法進(jìn)行BNP免疫組織化學(xué)檢測。制作常規(guī)石蠟切片,切片脫蠟至水;3%過氧化氫室溫10 min;滴加復(fù)合消化液10 min;室溫血清封閉20 min;滴加一抗(兔抗鼠1∶100,博奧森公司)4℃濕盒內(nèi)孵育過夜;滴加生物素標(biāo)記的二抗(羊抗兔IgG,武漢博士德公司)濕盒孵育20 min;滴加SABC試劑37℃濕盒內(nèi)孵育20 min;DAB室溫顯色;蘇木精復(fù)染;常規(guī)脫水透明封片;用PBS代替一抗,并以相鄰切片做陰性對照。

    1.8 組織學(xué)圖像處理

    HBFP染色、C-2R染色和BNP免疫組織化學(xué)結(jié)果在Olympus顯微鏡下觀察并進(jìn)行圖像采集。每個實驗組隨機(jī)選取5張組織切片,每張切片隨機(jī)采集5個視野(×400),每組切片共測25個視野。應(yīng)用圖像分析軟件Image-Pro Plus 6.0對每個視野進(jìn)行圖像分析,測定每個視野的陽性表達(dá)面積和積分光密度(Integral Optical Density,IOD)。

    1.9 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

    2 結(jié)果

    2.1 大鼠血漿cTnI含量

    與C組相比,HE組血漿cTnI濃度水平明顯升高,具有顯著性差異(P<0.05);而EEP組、LEP組則無較大變化,差異不具有顯著性。與HE組相比,EEP+HE組和LEP+HE組大鼠血漿cTnI濃度水平明顯偏低,具有顯著性差異(P<0.05)。EEP組與LEP組相比、EEP+HE組和LEP+HE組相比,差異不具顯著性(表1)。

    表 1 本研究大鼠血漿cTnI水平變化一覽表

    2.2 大鼠心肌組織HE、缺血缺氧染色和圖像分析

    C組與EEP組、LEP組大鼠心肌纖維形態(tài)結(jié)構(gòu)正常,著色均勻,細(xì)胞排列緊密整齊;細(xì)胞核呈卵圓形,位于細(xì)胞中央,略見橫紋(圖1-A、圖1-B、圖1-C)。HE組大鼠心肌纖維可見形態(tài)異常,著色不均勻,細(xì)胞邊界模糊不清,細(xì)胞排列不整齊(圖1-D)。EEP+HE組、LEP+HE組大鼠心肌纖維無明顯形態(tài)結(jié)構(gòu)改變,但存在少量空泡,細(xì)胞排列間隙增大(圖1-E、圖1-F)。

    正常心肌組織經(jīng)HBFP染色及C-2R染色后分別呈黃色和綠色,細(xì)胞核呈藍(lán)黑色;缺血缺氧心肌組織呈紅色。C組細(xì)胞胞漿分別呈黃色和綠色,藍(lán)紫色細(xì)胞核位于細(xì)胞中央,細(xì)胞排列規(guī)則,兩種染色均未見明顯鮮紅色缺血缺氧染色結(jié)果(圖2-A1、圖2-B1)。HE組細(xì)胞界限模糊,在兩種染色中均出現(xiàn)大面積片狀鮮紅色染色(圖2-A4、圖2-B4)。EEP組與LEP組細(xì)胞界限清晰,兩種染色結(jié)果相一致,均僅有少量斑塊狀鮮紅色染色(圖2-A2、圖2-A3、圖2-B2、圖2-B3)。在HBFP染色中,EEP+HE組僅有少量鮮紅色染色(圖2-A5);LEP+HE組細(xì)胞結(jié)構(gòu)基本完整,出現(xiàn)一定量的鮮紅色染色(圖2-A6),并且C-2R染色結(jié)果與HBFP染色結(jié)果相一致(圖2-B5、圖2-B6)。

    圖 1 本研究大鼠心肌組織切片HE染色結(jié)果 ×400

    在圖像分析結(jié)果中,HBFP染色與C-2R染色所顯示的結(jié)果意義相一致。與C組相比,EEP組和LEP組缺血缺氧面積和IOD無顯著性差異,而HE組顯著增加,差異具有顯著性;與HE組相比,EEP+HE組和LEP+HE組缺血缺氧面積和IOD均顯著減少(P<0.05);EEP組與LEP組相比、EEP+HE組與LEP+HE相比,缺血缺氧面積和IOD均無顯著性差異(P<0.05,表2)。

    圖 2 本研究大鼠心肌組織切片缺血缺氧染色結(jié)果 ×400

    表 2 本研究大鼠心肌組織缺血缺氧染色結(jié)果圖像分析一覽表

    2.3 大鼠血漿BNP含量

    圖 3 本研究大鼠血漿BNP水平變化柱狀圖

    與C組相比,HE組、EEP組血漿BNP濃度水平明顯升高,具有顯著性差異(P<0.05);而LEP組則無顯著性變化。與HE組相比,LEP+HE組大鼠血漿BNP濃度水平明顯升高,具有顯著性差異(P<0.05);但EEP+HE卻無顯著性變化。與LEP組相比,EEP組血漿BNP顯著上升(P<0.05)。與LEP+HE組相比,EEP+HE組血漿BNP顯著性下降(P<0.05,圖3)。

    2.4 大鼠心肌組織BNP免疫組織化學(xué)觀察

    通過免疫組織化學(xué)實驗后,BNP免疫陽性反應(yīng)呈棕褐色,細(xì)胞核由蘇木精染為藍(lán)紫色。C組心肌組織BNP陽性表達(dá)極少,藍(lán)紫色細(xì)胞核散亂分布在細(xì)胞中央及細(xì)胞間隙(圖4-A);HE組心肌組織BNP陽性表達(dá)明顯增強,陽性反應(yīng)呈塊狀無序分布于胞漿內(nèi)(圖4-B);EEP組和LEP組免疫陽性反應(yīng)區(qū)域較多,但不如HE組表達(dá)明顯(圖4-C、圖4-D);EEP+HE組和LEP+HE組BNP陽性反應(yīng)呈片狀或塊狀大量分布于心肌組織中,陽性反應(yīng)顏色較深(圖4-E、圖4-F),在所對應(yīng)的陰性相鄰切片中,用PBS代替一抗,切片中并未出現(xiàn)BNP陽性反應(yīng)。

    圖 4 本研究大鼠心肌組織

    BNP免疫陽性反應(yīng)圖像分析結(jié)果顯示,與C組相比,HE組、EEP組和LEP組陽性反應(yīng)面積增加,IOD增強,差異具有顯著性(P<0.05);與HE組相比,EEP+HE組與LEP+HE組免疫陽性面積增加,IOD增強,差異具有顯著性(P<0.05)。EEP組與LEP組相比,免疫陽性面積和IOD均無顯著性差異。EEP+HE組的免疫陽性面積和IOD要比LEP+HE組高,差異具有顯著性。(P<0.05,圖5、圖6)。

    圖 5 本研究大鼠心肌組織BNP免疫反應(yīng)面積柱狀圖

    3 討論

    3.1 BNP生物學(xué)特性

    心肌產(chǎn)生結(jié)構(gòu)相關(guān)的肽類激素家族,稱之為鈉尿肽家族,其主要成員有心鈉素、B型鈉尿肽和C型鈉尿肽。BNP廣泛分布于腦、脊髓、心、肺等組織,但其中以心臟含量最高。人體BNP的分子結(jié)構(gòu)和其他鈉尿肽家族成員一樣,都含有一個由17個氨基酸構(gòu)成的環(huán)狀結(jié)構(gòu),此環(huán)狀結(jié)構(gòu)由兩個半胱氨酸殘基之間的二硫鍵連接而成,在不同鈉尿肽之間具有高度同源性,并且,此結(jié)構(gòu)被認(rèn)為是鈉尿肽生物活性和介導(dǎo)與受體結(jié)合的核心因素[33]。與心鈉素相比,BNP在心肌特殊顆粒中儲存量極少,但當(dāng)心肌受到刺激時,BNP呈爆發(fā)式快速合成,所以BNP的調(diào)控主要基于細(xì)胞的基因轉(zhuǎn)錄水平。研究表明,多種因素可促進(jìn)BNP基因的轉(zhuǎn)錄,例如機(jī)械張力、心肌缺血缺氧、內(nèi)皮素和血管緊張素Ⅱ等[22]。當(dāng)心肌受到刺激后,首先,BNP基因編碼出含有134個氨基酸的Prepro-BNP,在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)快速切去含有26個氨基酸的信號肽后成為proBNP,之后,進(jìn)一步被激素原轉(zhuǎn)化酶切割為具有生物活性的BNP和不具有生物活性的NT-proBNP。BNP發(fā)揮其生理作用需要與其受體相結(jié)合,鈉尿肽家族主要有3型受體,其中,BNP主要與受體A結(jié)合發(fā)揮效用,而受體A主要分布在心臟、大血管及腎臟。當(dāng)BNP與受體結(jié)合后,cGMP被激活增多,作為第二信使激活下游信號通路,通過介導(dǎo)離子通道、蛋白激酶和磷酸二酯酶等發(fā)揮BNP的生物效能。BNP不但可以抗交感神經(jīng)興奮,還被認(rèn)為是腎素-血管緊張素-醛固酮(RAAS)系統(tǒng)的天然拮抗劑,因此BNP具有舒張血管以及利尿、利鈉的作用,從而調(diào)節(jié)體內(nèi)水鹽的動態(tài)平衡,以達(dá)到緩解心臟負(fù)荷的作用。鑒于BNP如此強大的生理作用,BNP已作為藥物治療應(yīng)用于臨床[12],并且其綜合效用要優(yōu)于硝酸甘油[30]。

    圖 6 本研究大鼠心肌組織BNP免疫反應(yīng)IOD值柱狀圖

    3.2 運動預(yù)適應(yīng)誘導(dǎo)心肌保護(hù)效應(yīng)

    Murry等人于1986年發(fā)現(xiàn)缺血預(yù)適應(yīng)(ischemic preconditioning,IP)現(xiàn)象,即反復(fù)短時間的心肌缺血/再灌注可以使心肌耐受隨后更長時間的缺血[26]。IP是一種強有力的內(nèi)源性心肌保護(hù)效應(yīng)。隨著對IP的不斷深入研究,人們發(fā)現(xiàn)運動、低氧、高溫、快速起搏和藥物等方式也可以誘導(dǎo)IP樣保護(hù)效應(yīng)。目前運動預(yù)適應(yīng)、低氧預(yù)適應(yīng)等已成為運動心臟保護(hù)的研究熱點。Domenech等人在實驗中讓狗以6 km/h的速度進(jìn)行跑臺運動,運動5 min,休息5 min,如此重復(fù)5次,在運動結(jié)束后即刻和24 h時,結(jié)扎冠脈前降支1 h,發(fā)現(xiàn)心肌梗死面積分別減小了78%和46%[13]。提示EP可以有效的減少梗死面積,且其保護(hù)效應(yīng)期分為早期保護(hù)效應(yīng)和晚期保護(hù)效應(yīng)。本課題組[10]前期的研究結(jié)果表明,大鼠在28~30 m/min的跑臺速度下,進(jìn)行連續(xù)3天的跑臺運動,每天運動60 min,其中運動15 min,休息5 min,重復(fù)3次,EP可以有效的減少心肌缺血缺氧的面積,提示EP可以成功誘導(dǎo)出心肌保護(hù)效應(yīng)。其中對EP機(jī)制中的多種物質(zhì)進(jìn)行了系統(tǒng)的研究[2,6,7],但還未涉及心臟內(nèi)分泌相關(guān)物質(zhì)。據(jù)此本實驗EP動物模型誘導(dǎo)其保護(hù)效應(yīng),從而探討EP及其保護(hù)效應(yīng)中BNP的水平變化及其作用機(jī)制。

    本實驗采用HE、缺血缺氧染色及血漿cTnI檢測的方法,從組織和血液兩個方面綜合評價運動致心肌損傷的程度。HE染色是組織形態(tài)基本的觀察方法;HBFP染色是檢測早期心肌缺血缺氧較為敏感的方法之一,當(dāng)心肌缺血缺氧時,會分泌一種蛋白-磷脂復(fù)合物,與堿性復(fù)紅相結(jié)合,從而將缺血缺氧細(xì)胞染成鮮紅色;C-2R染色根據(jù)缺血缺氧細(xì)胞和正常細(xì)胞對不同色素的著色程度不同,而成為心肌特異性缺血缺氧染色。此兩種染色方法不但可以有效的評價心肌損傷情況,還可以清楚的標(biāo)記心肌組織的損傷區(qū)域,以及細(xì)胞損傷后的結(jié)構(gòu)變化,通過圖片對比,可較為直觀地觀察到細(xì)胞損傷的變化。cTnI作為心臟損傷標(biāo)志物已經(jīng)應(yīng)用于臨床多年。心肌細(xì)胞中大量cTnI位于肌球蛋白的細(xì)肌絲上,當(dāng)心肌受到損傷時,胞質(zhì)中的游離cTnI首先透過細(xì)胞膜進(jìn)入血液,隨著心肌損傷的不斷加深,大量cTnI從肌原纖維上裂解下來。由于其高度的心肌特異性、心肌損傷高敏感性以及較長的窗口期,使其成為診斷心肌損傷、心肌梗死的“金標(biāo)準(zhǔn)”[4]。與此同時,cTnI也是評價EP動物模型的常用指標(biāo)[2]。缺血缺氧染色和血漿cTnI這兩種評價方式相比較,cTnI檢測特異性更高,而缺血缺氧染色可將損傷細(xì)胞定位,并進(jìn)行半定量統(tǒng)計。本課題組前期研究曾采用cTnI檢測和HBFP染色作為心肌損傷的評價指標(biāo),并能夠較好的評價EP保護(hù)效應(yīng)及運動損傷[10,34,35],此次實驗配合HE、C-2R染色更能較為全面的綜合評價運動心肌損傷。實驗結(jié)果顯示,與C組相比,EEP組、LEP組缺血缺氧面積及IOD以及血漿cTnI均無顯著性變化,進(jìn)一步證實EP是一種無損傷性預(yù)適應(yīng)方式[2,10,34];HE組缺血缺氧面積、IOD和血漿cTnI均顯著提高,提示大強度運動導(dǎo)致心肌造成較大損傷。與HE組相比,EEP+HE組和LEP+HE組心肌缺血缺氧面積、IOD以及血漿cTnI均有明顯下降,差異具有顯著性。提示EP所誘導(dǎo)的內(nèi)源性心肌保護(hù)效應(yīng)在心肌遭受損傷時發(fā)揮了保護(hù)作用。與LEP+HE組相比,EEP+HE組血漿cTnI和缺血缺氧染色結(jié)果雖無顯著性差異,但卻有下降的趨勢,提示在本次實驗中EP保護(hù)效應(yīng)的早期效果和晚期效果無顯著性差異,但具有早期保護(hù)效果較晚期保護(hù)效果更為明顯的趨勢。

    3.3 運動預(yù)適應(yīng)促進(jìn)心肌BNP的分泌及其可能機(jī)制

    BNP的含量不但與心室壓力、神經(jīng)激素調(diào)節(jié)系統(tǒng)有關(guān),還與年齡、生理周期及運動有關(guān)。Ohba H等人發(fā)現(xiàn),在一次100 km超長距離馬拉松過后,人體血漿BNP含量顯著上升[28]。國內(nèi)相關(guān)報道顯示,大鼠跑臺耐力運動11周后,心室BNPmRNA表達(dá)顯著上升[5]。隨著研究的不斷深入,短暫大強度運動也可以導(dǎo)致BNP含量的上升。有學(xué)者對伴有冠狀動脈疾病的患者進(jìn)行布魯斯運動試驗,平均運動時間為5~7 min,運動后即刻,血漿BNP含量較運動前有顯著性提升[15,32]。Huang[19]等人和Krupicka[21]等人也通過運動試驗及其他負(fù)荷遞增的運動方式證實健康人群中,在短時間大強度運動后,人體BNP含量會急劇升高。因此,心臟病患者及健康人群,運動后BNP水平均會升高。在本實驗的結(jié)果中,與C組相比,HE組大鼠心肌組織BNP和血漿BNP含量都發(fā)生顯著性上升,提示一次長時間大強度運動可促進(jìn)BNP的分泌水平,這與其他學(xué)者研究結(jié)果相一致。EEP組和LEP組大鼠的免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示,這兩組BNP含量無顯著性差異,但與C組相比,這兩組均發(fā)生了顯著性上升。但血漿BNP結(jié)果卻有所不同,EEP組BNP水平顯著高于LEP組;與C組相比,僅EEP組發(fā)生了顯著性上升,而LEP組雖有上升趨勢,但差異卻不具有顯著性。這可能是由于BNP在血漿中的半衰期較短而導(dǎo)致的,在EP結(jié)束后的24 h中,血漿中的BNP在經(jīng)過神經(jīng)內(nèi)切酶的降解以及與受體C的結(jié)合后,血液中的BNP水平逐漸恢復(fù)到正常水平,因此,LEP組中血漿BNP含量較少。EEP組和LEP組BNP免疫組織化學(xué)和血漿結(jié)果,提示除一次短暫大強度運動可以提升BNP含量外,EP這種運動方式也可以顯著有效的促進(jìn)心肌BNP的分泌水平。

    EP誘導(dǎo)心肌組織產(chǎn)生BNP的機(jī)制可能與心肌機(jī)械張力及神經(jīng)激素系統(tǒng)有關(guān)。在心肌致密顆粒中不含有BNP,因此,BNP的調(diào)節(jié)主要發(fā)生在基因水平。影響B(tài)NP轉(zhuǎn)錄啟動因子的途徑主要涉及GATA、AP-1和M-CAT這三條信號傳導(dǎo)通路,其中GATA起到重要作用。有研究表明,在機(jī)械張力作用下,激活p38 MAPK信號通路,從而提高GATA-4的活性,進(jìn)而提高BNP基因的表達(dá),這可能是BNP表達(dá)的一種機(jī)制[20]。也有研究表明,增加心臟壓力負(fù)荷或室壁張力,可以顯著上調(diào)GATA-4和BNPmRMA的表達(dá),但內(nèi)皮素受體阻斷劑可以抑制這種表達(dá),表明ET-1(內(nèi)皮素-1)可能參與了GATA-4的調(diào)控[17,18]。提示BNP轉(zhuǎn)錄的另一條分子通路可能是,神經(jīng)激素ET-1上調(diào)GATA-4活性,從而加強BNP的轉(zhuǎn)錄水平。在EP過程中,間歇性短暫大強度運動使得大鼠心率上升,心室壁張力增加,心臟負(fù)荷過重,引起ET-1的過量表達(dá),在與機(jī)械張力的雙重刺激下,GATA-4活性增強,從而激活BNP轉(zhuǎn)錄啟動因子,進(jìn)而調(diào)控了BNP的轉(zhuǎn)錄表達(dá)。

    3.4 運動預(yù)適應(yīng)保護(hù)效應(yīng)中BNP的保護(hù)作用及其可能機(jī)制

    BNP是鈉尿肽家族控制血壓和體液平衡的重要成員之一,它持續(xù)不斷的分泌以適應(yīng)、緩解心室容積擴(kuò)張和壓力負(fù)荷的增加。BNP可以調(diào)節(jié)血壓,減少體循環(huán)和肺循環(huán)的血管阻力,降低全身動脈血壓和靜脈回流,同時,還具有利尿、利鈉、抑制縮血管活性肽產(chǎn)生的作用[23]。有研究表明,將大鼠左冠狀動脈結(jié)扎30 min再灌120 min,在缺血/再灌注前10 min進(jìn)行BNP靜脈注射,可有效抑制心肌梗塞面積[14]。另有研究表明,不管是培養(yǎng)的心肌細(xì)胞還是在體的大鼠心肌,在缺血/再灌注的過程中進(jìn)行BNP干預(yù),都可有效減少心肌因缺血/再灌注所導(dǎo)致的細(xì)胞凋亡或心肌梗塞[31,37]。本實驗結(jié)果中,在EP誘導(dǎo)的早期和晚期保護(hù)效應(yīng)中進(jìn)行大強度運動,BNP免疫組化結(jié)果顯示,在組織中,EEP+HE組BNP水平要顯著高于LEP+HE組;但在血漿中,EEP+HE組BNP水平要顯著低于LEP+HE組。導(dǎo)致這一結(jié)果不一致的原因可能是,在EP保護(hù)效應(yīng)的早期,BNP主要保留在組織中,這在心肌遭受缺血缺氧時可以更好的起到保護(hù)效應(yīng);在EP保護(hù)效應(yīng)的晚期,雖然EP誘導(dǎo)的BNP在血漿中已恢復(fù)到正常水平,但EP所誘導(dǎo)的BNP啟動因子仍處于高位,一旦受到大強度運動的刺激,BNP即可快速達(dá)到較高水平。與HE組相比,EEP+HE組和LEP+HE組大鼠心肌組織BNP表達(dá)均顯著上升,而HBFP染色結(jié)果和血漿cTnI結(jié)果顯示這兩組大鼠心肌并未發(fā)生顯著性損傷,提示在EP所誘導(dǎo)的心肌保護(hù)效應(yīng)中,BNP發(fā)揮了保護(hù)作用。在血漿BNP結(jié)果中,與HE組相比,LEP+HE組的BNP表達(dá)水平顯著性升高,血漿結(jié)果與免疫組織化學(xué)結(jié)果相一致;但EEP+HE組卻無顯著性變化,可能的原因是在EP保護(hù)效應(yīng)的早期,心肌BNP以自分泌為主,因此入血較少,組織中EEP+HE組BNP水平高于LEP+HE組,也間接證實了這種可能。EEP+HE組和LEP+HE組BNP免疫組織化學(xué)和血漿結(jié)果,提示在EP保護(hù)效應(yīng)中,BNP發(fā)揮了保護(hù)心肌的作用。

    BNP發(fā)揮其生理作用主要是通過與受體相結(jié)合的方式實現(xiàn)的。當(dāng)BNP分泌入血與受體結(jié)合后,激活鳥苷酸環(huán)化酶活性,從而促進(jìn)鳥苷三磷酸轉(zhuǎn)化為環(huán)磷酸尿苷(cyclic guanosine monophosphate,cGMP)。cGMP具有強大的舒張血管作用,可以介導(dǎo)蛋白激酶以及離子通道等發(fā)揮BNP的生物活性。有研究表明,對心肌細(xì)胞進(jìn)行缺血缺氧處理,加入BNP的心肌細(xì)胞死亡率顯著降低,但加入蛋白激酶G抑制劑后,這種BNP的保護(hù)作用被廢除[16]。另有研究表明,對豬心左前降支血管進(jìn)行BNP處理,其血管環(huán)產(chǎn)生了明顯的舒張效應(yīng),但分別加入鳥苷酸環(huán)化酶抑制劑和ATP敏感鉀離子通道抑制劑后,BNP的血管舒張作用均發(fā)生明顯下降[3]。以上研究結(jié)果提示,在BNP發(fā)揮其效用的過程中,蛋白激酶G、鳥苷酸環(huán)化酶以及ATP敏感鉀離子通道均發(fā)揮了重要作用。通過EP促進(jìn)心肌BNP表達(dá)上升,在心肌遭受損傷時,BNP與心肌組織中的受體相結(jié)合,激活cGMP活性,進(jìn)而舒張冠狀動脈及外周血管,減輕心臟后負(fù)荷,促進(jìn)血液循環(huán),以達(dá)到緩解心肌缺血缺氧的保護(hù)作用;同時,進(jìn)入血液的BNP通過循環(huán)系統(tǒng)與腎臟中的受體相結(jié)合,可增加腎小球的濾過面積和有效濾過率,減少集合管對鈉的重吸收和轉(zhuǎn)運,進(jìn)而達(dá)到利尿、利鈉的作用,降低靜脈回流,減輕心臟前負(fù)荷,降低心肌耗氧量。

    4 結(jié)論

    EP是一種無損傷性預(yù)適應(yīng)方式,對大強度運動導(dǎo)致的運動性心肌損傷起到保護(hù)作用。早期運動預(yù)適應(yīng)和晚期運動預(yù)適應(yīng)均可以促進(jìn)心肌分泌BNP,但BNP分泌水平的變化在兩者之間無明顯差異。BNP參與了EP對運動性心肌損傷的保護(hù)作用,在早期保護(hù)效應(yīng)和晚期保護(hù)效應(yīng)中均發(fā)揮了重要作用。

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    ChangeofB-typeNatriureticPeptideExpressionduringExercisePreconditioningInducedMyocardialProtectioninRat

    LIU Ze-guang,PAN Shan-shan,HAO Zhe,LU Jiao,YUAN Jian-qi

    Objective:To view the change of B-type natriuretic peptide (BNP) expression during exercise preconditioning and determine whether BNP participated incardioprotective effect of exercise preconditioning.Methods:SD rats were divided into control group (C),HE group,EEP group,LEP group,EEP+HE group,and LEP+HE group.After establishing of EP animal model,high-intensity exercise on treadmill for inducing myocardial injury.Then the lever of cTnI was detected by chemiluminescent immunoassay.HE staining was used to observe the changes in ventricular structure.Hematoxylin-basic-fuchsin-picric acid (HBFP) staining and Chromotrope 2R-brilliant green (C-2R) staining were evaluated the degree of myocardial ischemia/hypoxia.The change of BNP in myocardium and plasma were detected by immunohistoChemistry and enzyme inked immunosorbent assay respectively.Results:As compared with the group C,there was no significant difference in the level of cTnI and the degree of myocardial ischemia/hypoxia,but it has a significant increase in group HE.Compared with the group C,the expression of BNP in myocardium was increased significantly in group HE,group EEP and group LEP,but the level of BNP in plasma significantly increase only in group HE and group EEP,group LEP has no significant difference.As compared with group HE,there was a significant decrease in the level of cTnI and the degree of myocardial ischemia/hypoxia in group EEP+HE and group LEP+HE.Compared with group HE,the expression of BNP in myocardium was increased significantly in group EEP+HE and group LEP+HE,but the level of BNP in plasma significantly increase only in group LEP+HE,group EEP+HE has no significant difference.Conclusion:exercise preconditioning can induce myocardium to produce BNP,and BNP participated in cardioprotective effect of exercise preconditioning.

    B-typenatriureticpeptide;exercisepreconditioning;cardioprotection;myocardialinjury;rat

    1000-677X(2014)09-0031-08

    2013-12-19;

    :2014-08-06

    國家自然科學(xué)基金資助項目(31071031)。

    劉澤廣(1987-),男,河南安陽人,在讀碩士研究生,主要研究方向為運動與心血管形態(tài)和機(jī)能,E-mail:richard_liu2013@163.com;潘珊珊(1957-),女,江蘇常州人,教授,博士研究生導(dǎo)師,主要研究方向為運動與心血管形態(tài)和機(jī)能,Tel(021) 51253252,E-mail:panshanshan20-13@163.com。

    上海體育學(xué)院 運動科學(xué)學(xué)院,上海 200438 School of Kinesiology,Shanghai University of Sport,Shanghai 200438,China.

    G804.5

    :A

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