利用EGSB反應(yīng)器富集高純度厭氧氨氧化菌

黃曉麗，高大文，叢巖，王小龍

1 哈爾濱工業(yè)大學(xué) 城市水資源與水環(huán)境國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江 哈爾濱 150090

2 中核能源科技有限公司，北京 100193

利用EGSB反應(yīng)器富集高純度厭氧氨氧化菌

黃曉麗1，高大文1，叢巖2，王小龍1

1 哈爾濱工業(yè)大學(xué) 城市水資源與水環(huán)境國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江 哈爾濱 150090

2 中核能源科技有限公司，北京 100193

黃曉麗, 高大文, 叢巖, 等. 利用EGSB反應(yīng)器富集高純度厭氧氨氧化菌. 生物工程學(xué)報(bào), 2014, 30(12): 1845–1853.

Huang XL, Gao DW, Cong Y, et al. Enrichment of anaerobic ammonium oxidation bacteria by expanded-granular sludge bed reactor. Chin J Biotech, 2014, 30(12): 1845–1853.

以?xún)?chǔ)存60 d的ANAMMOX污泥為種泥，采用EGSB反應(yīng)器富集高活性、高純度的ANAMMOX菌富集培養(yǎng)物，考察反應(yīng)器的脫氮能力，同時(shí)采用分子生物學(xué)方法鑒定培養(yǎng)前后ANAMMOX富集培養(yǎng)物中的優(yōu)勢(shì)菌種及ANAMMOX菌的相對(duì)豐度。在反應(yīng)器運(yùn)行的185 d中，最高氮負(fù)荷達(dá)3.0 kg N/(m3·d)，氨氮與亞硝酸鹽氮的去除效率均大于85%。培養(yǎng)后ANAMMOX富集培養(yǎng)物中的優(yōu)勢(shì)菌種由待定熒光布羅卡地菌Candidatus Brocadia fulgid和待定巴西布羅卡地菌Candidatus Brocadia brasiliensis變?yōu)榇▉喼藿芴厥暇鶦andidatus Jettenia asiatica。FISH結(jié)果表明ANAMMOX菌所占總細(xì)菌的相對(duì)豐度明顯增加，由 (57.69±4.79)%提高到(83.32±4.40)%。定量PCR結(jié)果證實(shí)了培養(yǎng)后的富集培養(yǎng)物內(nèi)ANAMMOX菌的拷貝數(shù)由1.14×1011拷貝/g濕重提高到3.69×1011拷貝/g濕重。

ANAMMOX，待定亞洲杰特氏菌，熒光原位雜交，定量PCR，EGSB，富集培養(yǎng)

厭氧氨氧化(Anaerobic Ammonium oxidation，簡(jiǎn)稱(chēng)ANAMMOX) 菌是一類(lèi)在厭氧(或缺氧) 條件下以亞硝酸鹽為電子受體氧化銨鹽的浮霉菌門(mén)細(xì)菌[1]。20多年的研究證實(shí)該菌在全球氮循環(huán)中發(fā)揮重要作用，廣泛存在于自然界的各個(gè)系統(tǒng) (海洋[2-3]、湖泊[4-5]、濕地[6]等) 中?；贏(yíng)NAMMOX過(guò)程開(kāi)發(fā)的脫氮工藝是目前已知的最為經(jīng)濟(jì)的新型生物脫氮技術(shù)[7]，具有需氧量低、節(jié)約曝氣成本、運(yùn)行費(fèi)用低、污泥產(chǎn)量少等優(yōu)點(diǎn)。因此，ANAMMOX工藝在高氨氮廢水處理領(lǐng)域有著廣闊的市場(chǎng)需求和應(yīng)用前景。然而，ANAMMOX菌對(duì)環(huán)境因素敏感，生長(zhǎng)速度緩慢，倍增時(shí)間較長(zhǎng) (8?11 d)，難以維持較高生物濃度[8-9]。特別是，ANAMMOX菌發(fā)現(xiàn)20多年以來(lái)，至今未實(shí)現(xiàn)純培養(yǎng)。這些不僅限制了ANAMMOX工藝的進(jìn)一步應(yīng)用，還影響了對(duì)該菌生理生化特性的深入研究。研究表明ANAMMOX菌在細(xì)胞密度達(dá)到 1010個(gè)/mL 以上時(shí)才能顯現(xiàn)活性[10]，所以傳統(tǒng)的微生物分離純化的方法并不能獲得ANAMMOX菌的純培養(yǎng)。有研究人員利用密度梯度離心技術(shù)分離出了純度高達(dá)99.6%的ANAMMOX菌[11]，前提是獲得具有較高純度的ANAMMOX富集培養(yǎng)物。因此，利用反應(yīng)器富集高密度、高活性及高純度的ANAMMOX菌，可為后續(xù)的進(jìn)一步分離培養(yǎng)及生理生化研究提供種源，對(duì)ANAMMOX技術(shù)的應(yīng)用具有重要意義。

目前用于富集ANAMMOX菌的反應(yīng)器主要有序批式反應(yīng)器 (SBR)，膜生物反應(yīng)器(MBR)[9]及附著生長(zhǎng)型反應(yīng)器[12-13]。EGSB (Expanded-granular sludge bed，膨脹顆粒污泥床) 反應(yīng)器具有高效的污泥持留能力，屬于懸浮生長(zhǎng)型富集裝置，培養(yǎng)的微生物具有良好的物理結(jié)構(gòu)、生態(tài)結(jié)構(gòu)和沉降性能，且利于使培養(yǎng)物達(dá)到高密度及高活性，在富集相對(duì)較純的ANAMMOX富集培養(yǎng)物方面具有一定優(yōu)勢(shì)。目前，EGSB反應(yīng)器多應(yīng)用于考察ANAMMOX反應(yīng)器的啟動(dòng)性能及脫氮效能[14-16]，關(guān)于利用其富集較高純度ANAMMOX菌方面鮮有報(bào)道。

本研究以短期儲(chǔ)存的ANAMMOX污泥為種源，利用EGSB反應(yīng)器進(jìn)一步富集高活性、高純度的ANAMMOX菌，考察反應(yīng)器的運(yùn)行效能，同時(shí)采用分子生物學(xué)方法鑒定培養(yǎng)前后ANAMMOX富集培養(yǎng)物中的優(yōu)勢(shì)菌種及相對(duì)豐度。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)裝置與操作條件

實(shí)驗(yàn)采用的EGSB反應(yīng)器結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖1。反應(yīng)器主體結(jié)構(gòu)采用透明有機(jī)玻璃制成，有效容積為1.38 L，反應(yīng)區(qū)容積為1 L，反應(yīng)器壁設(shè)3個(gè)取樣口。由加熱套及溫控儀 (XMTD-2002，上海項(xiàng)力實(shí)業(yè)有限公司) 控制溫度，利用遮光布避光。反應(yīng)器運(yùn)行過(guò)程中控制溫度為 (33±2) ℃，進(jìn)水pH為7.2±0.3，回流比為6∶1。通過(guò)利用高純氮?dú)庠谶M(jìn)水中間歇曝氣驅(qū)除進(jìn)水中的溶解氧，保持進(jìn)水溶解氧濃度 (DO) 低于0.8 mg/L。

1.2 接種污泥與試驗(yàn)廢水

本研究中使用的ANAMMOX接種污泥取自于生產(chǎn)性規(guī)模厭氧氨氧化反應(yīng)器的顆粒態(tài)ANAMMOX污泥，該反應(yīng)器位于荷蘭鹿特丹市政污水處理廠(chǎng)內(nèi)[7]，進(jìn)水為Sharon 反應(yīng)器的污泥硝化液。此污泥在4 ℃下經(jīng)過(guò)60 d的短期儲(chǔ)存，起始接種量為150 mL。實(shí)驗(yàn)中采用人工模擬廢水，主要組成[17]：KHCO31 000 mg/L， KH2PO450 mg/L，MgSO4·7H2O 200 mg/L，CaCl2·2H2O 151 mg/L。微量元素與維生素溶液分別為0.5 mL，0.3 mL。氨氮與亞硝酸鹽氮分別由 (NH4)2SO4和NaNO2提供，進(jìn)水濃度比為1∶1.2，通過(guò)提高進(jìn)水基質(zhì)濃度或縮短HRT來(lái)提高反應(yīng)器容積負(fù)荷。

圖1 試驗(yàn)裝置示意圖Fig. 1 The reactor system.

1.3 分析項(xiàng)目及方法

氨氮濃度采用納氏試劑分光光度法測(cè)定，亞硝酸鹽氮濃度采用N-(1-萘基)-乙二胺分光光度法測(cè)定，硝酸鹽氮濃度采用麝香草酚分光光度法測(cè)定，pH值和DO利用德國(guó)WTW (pH/Oxi 340i) 手提式多參數(shù)測(cè)試儀進(jìn)行測(cè)定。

1.4 DNA提取、PCR擴(kuò)增及克隆測(cè)序

DNA 提取采用細(xì)菌DNA提取試劑盒 (北京天恩澤基因科技有限公司)。16S rRNA基因的PCR反應(yīng)采用ANAMMOX菌特異性引物Pla46F/Amx820R (表1)[18]，PCR擴(kuò)增程序：95 ℃預(yù)變性8 min；95 ℃變性40 s，59 ℃退火40 s，72 ℃延伸2 min，共進(jìn)行30個(gè)循環(huán)；最后在72 ℃下延伸10 min。

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物使用柱式DNA膠回收試劑盒(北京天恩澤基因科技有限公司) 進(jìn)行純化。利用連接轉(zhuǎn)化試劑盒 (上海生工生物工程股份有限公司) 將純化的DNA產(chǎn)物與質(zhì)粒載體pUCm-T進(jìn)行連接后，轉(zhuǎn)入到大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞中 (Trans5α，北京全式金生物技術(shù)有限公司)，最后進(jìn)行藍(lán)白斑篩選。陽(yáng)性克隆的檢驗(yàn)使用引物M13±。隨機(jī)挑取30個(gè)陽(yáng)性克隆子進(jìn)行測(cè)序 (上海生工生物工程股份有限公司)。將獲得的序列輸入GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)，并使用MEGA5.2序列分析軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

1.5 定量PCR

利用1.4中提取的總DNA，進(jìn)行定量PCR實(shí)驗(yàn)。ANAMMOX功能基因引物hzocl1F1-hzocl1R2定量ANAMMOX菌hzo基因的數(shù)量(表1)[19-20]。通過(guò)分析富集培養(yǎng)物中hzo基因拷貝數(shù)的含量判斷ANAMMOX菌富集的情況。定量PCR反應(yīng)體系包括：10 μL 2×SGExcel Fast SYBR Mixture預(yù)混體系 (含ROX校正染料) (上海生工生物工程股份有限公司)，3 μL DNA模板，0.5 μL正向引物 (10 mmol/L)，0.5 μL反向引物(10 mmol/L)。qPCR定量分析儀采用ABI7500 (Foster City, CA, USA)，使用icycleriQ5熱循環(huán)儀和實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)系統(tǒng)。反應(yīng)程序?yàn)閇20]：95 ℃預(yù)變性30 min；95 ℃下變性30 s，94 ℃下30 s，55 ℃下退火1 min，共進(jìn)行40個(gè)循環(huán)；最后在72 ℃下延伸1 min。ANAMMOX標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)采用已知濃度的質(zhì)粒DNA (北京閱微基因技術(shù)有限公司)，以10倍稀釋的方式獲得系列濃度(1.90×101?1.90×109copies/mL)。樣品中細(xì)菌及ANAMMOX菌相對(duì)DNA濃度以循環(huán)閾值表征。定量PCR擴(kuò)增的特異性采用溶解曲線(xiàn)及凝膠電泳檢驗(yàn)。每個(gè)樣品做3個(gè)平行。

1.6 熒光原位雜交檢測(cè) (FISH)

取自EGSB反應(yīng)器的微生物樣品 (第3天、第185天)經(jīng)清洗及固定后，采用冷凍包埋液包埋 (ES-LDB-003，EYSIN，日本) 并利用冷凍切片機(jī) (Cryo-Star HM 560MV，MICROM，德國(guó)) 對(duì)包埋后的顆粒樣品進(jìn)行切片，約10 μm，切片放置在處理后的載玻片上。然后，切片樣品經(jīng)乙醇梯度脫水后雜交，進(jìn)行FISH分析[21]。針對(duì)ANAMMOX菌，采用Cy3標(biāo)記的Amx-368 (CCTTTCGGGCATTGCGAA) 探針 (上海生工生物工程股份有限公司)；細(xì)菌使用DAPI (上海生工生物工程股份有限公司) 染色。在熒光顯微鏡 (BX2U-MWU2，Olympus，日本) 下觀(guān)察并拍照，利用Image J軟件分析FISH圖片并計(jì)算樣品中厭氧氨氧化菌的相對(duì)豐度。圖片中紅色熒光為ANAMMOX菌，藍(lán)色熒光為全菌。

表1 本研究中使用的探針序列Table 1 Probe sequences used in this study

2 結(jié)果與分析

2.1 EGSB反應(yīng)器脫氮效果及ANAMMOX效能

基質(zhì)去除率和產(chǎn)物生成量的變化可以指示EGSB反應(yīng)器中ANAMMOX菌的活性。本研究中，通過(guò)調(diào)整進(jìn)水濃度與HRT來(lái)逐漸提高反應(yīng)器的總氮負(fù)荷，進(jìn)而不斷富集ANAMMOX菌。反應(yīng)器運(yùn)行初期氨氮與亞硝酸鹽氮進(jìn)水濃度均為70 mg N/L，去除效率分別為50%與70%，容積總氮負(fù)荷0.76 kg N/(m3·d) (圖2)。由于接種污泥為ANAMMOX污泥，雖然經(jīng)過(guò)2個(gè)月的低溫儲(chǔ)存 （4 ℃），但仍具有一定的ANAMMOX活性，因此適應(yīng)環(huán)境后很快進(jìn)入活性提高期 (12?56 d)[22]。但由于基質(zhì)濃度過(guò)高會(huì)影響ANAMMOX菌的活性并對(duì)其生長(zhǎng)產(chǎn)生抑制作用[23-24]，特別是亞硝酸鹽[25]，因此實(shí)驗(yàn)中平均進(jìn)水氨氮、亞硝酸鹽氮濃度提升一定濃度后不再繼續(xù)提高，而通過(guò)逐漸降低HRT提高進(jìn)水負(fù)荷。在反應(yīng)器穩(wěn)定運(yùn)行階段 (57?185 d)，ANAMMOX富集培養(yǎng)物的活性較高，平均進(jìn)水氨氮、亞硝酸鹽氮濃度分別為(146.67±15.04) mg N/L，(183.48±14.02) mg N/L，氨氮與亞硝酸鹽氮去除率分別為(86.39±8.33)%、(83.26±7.69)%。在運(yùn)行期間(185 d) 中，最高總氮負(fù)荷為3.80 kg N/(m3·d) 時(shí)，最大容積總氮去除負(fù)荷為3.00 kg N/(m3·d) (圖2B)。

圖2 EGSB反應(yīng)器脫氮效果Fig. 2 Performance of EGSB reactor.

EGSB反應(yīng)器內(nèi)ANAMMOX菌能夠形成顆粒污泥，獲得具有較高密度的ANAMMOX富集培養(yǎng)物，從而獲得高厭氧氨氧化活性。同時(shí)，顆粒污泥沉降性能良好，能夠持留于反應(yīng)器內(nèi)。然而，與污泥持留效率很高的序批式反應(yīng)器 (SBR) 相比[23]， EGSB反應(yīng)器除了具有較強(qiáng)的抗基質(zhì)濃度沖擊的性能外，還具有承受更高容積氮負(fù)荷的潛力[14]。

2.2 ANAMMOX富集培養(yǎng)物中優(yōu)勢(shì)菌種系統(tǒng)發(fā)育分析

通過(guò)對(duì)接種ANAMMOX污泥的生物學(xué)性狀分析，發(fā)現(xiàn)所獲得的有效基因序列與Candidatus Brocadia fulgid (B. fulgid) 和Candidatus Brocadia brasiliensis (B. brasiliensis)的序列高度相似 (相似度大于99%) (圖3)。經(jīng)過(guò)185 d培養(yǎng)后得ANAMMOX培養(yǎng)物所獲得的所有有效序列均與Candidatus Jettenia asiatica (J. Asiatica) 的序列高度相似 (相似度大于97%，序列提交至NCBI，編號(hào)分別為KJ002641) (圖3)。B. fulgid與B. brasiliensis是污水處理系統(tǒng)中較常見(jiàn)的優(yōu)勢(shì)ANAMMOX菌[26]，而J. asiatica最先發(fā)現(xiàn)于亞洲ANAMMOX顆粒污泥反應(yīng)器及無(wú)紡布生物膜反應(yīng)器中[27]。在培養(yǎng)前后，反應(yīng)器內(nèi)ANAMMOX富集培養(yǎng)物中的優(yōu)勢(shì)菌種發(fā)生了改變。這是由于接種污泥取自于市政污水處理廠(chǎng)，反應(yīng)器進(jìn)水為污泥消化液，而本實(shí)驗(yàn)采用人工配水，僅含有氨氮、亞硝酸鹽氮、部分無(wú)機(jī)鹽類(lèi)及微生物生長(zhǎng)所必需的微量元素與維生素，某些生長(zhǎng)因子的變化導(dǎo)致了反應(yīng)器內(nèi)優(yōu)勢(shì)菌種的改變。由此可見(jiàn)，生長(zhǎng)因子對(duì)ANAMMOX菌的生長(zhǎng)具有重要作用[28-29]。

2.3 富集培養(yǎng)物中ANAMMOX菌的純度分析

圖3 富集培養(yǎng)物中ANAMMOX菌系統(tǒng)發(fā)育分析Fig. 3 Phylogenetic neighbour-joining tree between the ANAMMOX based on 16S rRNA genes.

圖4 富集培養(yǎng)物FISH圖片F(xiàn)ig. 4 The FISH photos of ANAMMOX enrichment culture.

對(duì)富集培養(yǎng)前后的微生物樣品取樣，用于FISH分析。結(jié)果表明在經(jīng)過(guò)培養(yǎng)后，富集培養(yǎng)物中的ANAMMOX菌所占總細(xì)菌的比例明顯增加(圖4)，相對(duì)豐度由 (57.69±4.79)%提高到(83.32±4.40)%。富集培養(yǎng)物呈明顯的顆粒狀，ANAMMOX菌主要分布在顆粒的內(nèi)部，且分布密度較大，與文獻(xiàn)[30]所報(bào)道一致。由于A(yíng)NAMMOX菌能分泌胞外多聚物[31]，有利于菌體團(tuán)聚生長(zhǎng)，團(tuán)聚體結(jié)構(gòu)是獲得高密度的前提。同時(shí)，與附著生長(zhǎng)型反應(yīng)器相比，如序批式生物膜反應(yīng)器 (SBBR)[12-32]、固定床反應(yīng)器[33]、上流式生物膜反應(yīng)器[34]、膨脹床反應(yīng)器[13]等，利用EGSB反應(yīng)器獲得的懸浮生長(zhǎng)型富集培養(yǎng)物不會(huì)因?yàn)槭艿教盍舷拗飘a(chǎn)生縱向性能差異，富集培養(yǎng)物相對(duì)較純，有利于后續(xù)ANAMMOX菌的進(jìn)一步分離及相關(guān)生理生化特性分析。

為進(jìn)一步確定富集培養(yǎng)物中ANAMMOX菌的相對(duì)豐度，利用定量PCR技術(shù)考察了富集培養(yǎng)物中ANAMMOX菌拷貝數(shù)，結(jié)果如圖5所示。與接種污泥相比，培養(yǎng)185 d后的富集培養(yǎng)物中的hzo基因拷貝數(shù)有明顯提高。培養(yǎng)后富集培養(yǎng)物中ANAMMOX菌hzo基因拷貝數(shù)由1.14×1011拷貝/g濕重提高到3.69×1011拷貝/g濕重。通過(guò)以上的分析，可見(jiàn)EGSB反應(yīng)器適合于富集ANAMMOX菌。這種具有較高純度ANAMMOX菌富集培養(yǎng)物的獲得，可以為后續(xù)的進(jìn)一步菌種分離和相關(guān)基礎(chǔ)研究提供種源。

圖5 富集培養(yǎng)物中ANAMMOX菌拷貝數(shù)Fig. 5 ANAMMOX gene copies in enrichment culture

3 結(jié)論

采用EGSB反應(yīng)器，以經(jīng)60 d儲(chǔ)存的ANAMMOX污泥為接種污泥，獲得了具有較高活性的ANAMMOX富集培養(yǎng)物，氨氮與亞硝酸鹽氮去除率均大于85%，運(yùn)行期間最高總氮去除負(fù)荷達(dá)3.0 kg N/(m3·d)。16S rRNA 克隆測(cè)序結(jié)果表明，ANAMMOX富集培養(yǎng)物中的優(yōu)勢(shì)菌種由培養(yǎng)前的B. fulgid與B. brasiliensis變?yōu)镴. asiatica。FISH 及定量PCR分析技術(shù)表明，185 d后的富集培養(yǎng)物中ANAMMOX菌的比例明顯增加，豐度由 (57.69±4.79)%提高到(83.32±4.40)%，且ANAMMOX菌hzo基因由1.14×1011拷貝/g濕重提高到3.69×1011拷貝/g濕重。

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(本文責(zé)編 郝黃芳)

Enrichment of anaerobic ammonium oxidation bacteria by expanded-granular sludge bed reactor

Xiaoli Huang1, Dawen Gao1, Yan Cong2, and Xiaolong Wang1
1 State Key Laboratory of Urban Water Resource and Environment, Harbin Institute of Technology, Harbin 150090, Heilongjiang, China
2 Chinergy Co., Ltd, Beijing 100193, China

An expanded-granular sludge bed (EGSB) reactor was set-up with artificial water by seeding a 60 d stored ANAMMOX sludge. The nitrogen removal efficiency of ANAMMOX enrichment culture in the reactor was determined. In addition, the main microbial populations and the relative abundance of ANAMMOX bacteria were investigated by molecular approaches. Results show that the maximum nitrogen removal rate was 3.0 kg-N·m-3·d-1after 185 d, and the ammonium and nitrite removal efficiencies were all over 85%. Analysis of 16S rRNA gene-cloning indicates that the mainmicrobial population in the ANAMMOX enrichment culture was changed from Candidatus Brocadia fulgid and Candidatus Brocadia brasiliensis (0 day) to Candidatus Jettenia asiatica (185 day). Fluorescence in situ hybridization analysis shows that the relative abundance of ANAMMOX bacteria was increased from (57.69±4.79)% to (83.32±4.40)%. The results of qPCR further indicate that the gene copies of ANAMMOX bacteria in the granules were increased from 1.14×1011copies/g wet weight to 3.69×1011copies/g wet weight.

ANAMMOX, Candidatus Jettenia asiatica, FISH, qPCR, EGSB, enrichment

March 17, 2014; Accepted: July 14, 2014

Dawen Gao. Tel/Fax: +86-451-86289185; E-mail: gaodw@hit.edu.cn

Supported by: National Natural Science Foundation of China (No. 21177033), National Water Pollution Control and Management Technology Major Projects (No. 2013ZX07201007).

國(guó)家自然科學(xué)基金 (No. 21177033)，國(guó)家水體污染控制與治理科技重大專(zhuān)項(xiàng) (No. 2013ZX07201007) 資助。

時(shí)間：2014-08-20 網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/doi/10.13345/j.cjb.140162.html