大豆子葉節(jié)遺傳轉(zhuǎn)化受體體系的建立

曲靜　劉思言　姚丹　淑艷　丕武　佳鑫

摘要：以3個(gè)大豆品種為試材，研究了種子消毒方法、叢生芽誘導(dǎo)和生根階段不同的激素濃度對大豆子葉節(jié)再生的影響，以求建立一個(gè)高效的再生體系用于大豆的遺傳轉(zhuǎn)化。結(jié)果表明，大豆種子消毒的最佳方法為：70%酒精消毒30 s后，HgCl2消毒7 min，無菌水清洗3～5次。吉農(nóng)28的最佳叢生芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS+1.5 mg/L 6-BA+0.5 mg/L IBA；而對于吉農(nóng)27和九農(nóng)21，MS+2.0 mg/L 6-BA+0.8 mg/L IBA為最佳叢生芽培養(yǎng)基。在叢生芽誘導(dǎo)生根階段，三種不同的基因型最佳的生根培養(yǎng)基均為1/2MS+2.0 mg/L IBA。

關(guān)鍵詞：大豆；激素；叢生芽誘導(dǎo)；生根

中圖分類號：S565.104.3文獻(xiàn)標(biāo)識號：A文章編號：1001-4942（2014）05-0026-03

大豆（Glycine max L.）既是糧食作物，又是油料和飼料作物。自1988年Hinchee等[1]和McCabe等[2]獲得轉(zhuǎn)基因大豆植株以來，國內(nèi)外學(xué)者開展了大量的大豆遺傳轉(zhuǎn)化研究工作，并取得一些突破性進(jìn)展。以大豆無菌苗子葉節(jié)、莖尖、初生葉節(jié)、未成熟子葉、上胚軸和下胚軸等為外植體都獲得了再生植株[2～9]。目前大豆的遺傳轉(zhuǎn)化多數(shù)以子葉節(jié)再生體系作為受體系統(tǒng)，但子葉節(jié)再生體系也存在諸如叢生芽少、不易伸長等缺點(diǎn)。因此迄今為止，大豆仍是公認(rèn)的難轉(zhuǎn)化的植物之一。

大豆子葉節(jié)穩(wěn)定高效遺傳轉(zhuǎn)化受體體系的建立是提高大豆遺傳轉(zhuǎn)化效率的基礎(chǔ)。本試驗(yàn)旨在篩選大豆種子消毒的最佳方法以及叢生芽誘導(dǎo)和生根的最佳培養(yǎng)基，完善目前大豆子葉節(jié)遺傳轉(zhuǎn)化受體體系，獲得高效的再生體系，為轉(zhuǎn)基因大豆的研究奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

供試材料為吉農(nóng)28、九農(nóng)21、吉農(nóng)27三個(gè)大豆品種，均由吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院副教授張君提供。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1種子消毒方法的研究選擇健康飽滿的大豆種子，自來水清洗干凈，70%的酒精表面消毒30 s，采用三種不同的消毒方法對大豆種子進(jìn)行消毒：①用6% NaClO進(jìn)行消毒，消毒時(shí)間分別為12、15、18 min；②用0.1% HgCl2進(jìn)行消毒，消毒時(shí)間分別為5、7、9 min；③用6% NaClO + 20% HCl進(jìn)行消毒，消毒時(shí)間分別為120、240、360 min。然后用無菌水清洗3～5次，接種到MS培養(yǎng)基上，5 d后統(tǒng)計(jì)發(fā)芽率及污染率。

1.2.2叢生芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基激素濃度篩選大豆種子萌發(fā)培養(yǎng)5～6 d后，取出萌發(fā)的種子，剝?nèi)シN皮，保留2～3 mm下胚軸，將子葉從下胚軸處切開，除去頂芽及腋芽，置于不同的叢生芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基上。芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基分別為：①M(fèi)S+1.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L IBA；②MS+1.5 mg/L 6-BA+0.5 mg/L IBA；③MS+2.0 mg/L 6-BA+0.8 mg/L IBA；④MS+2.5 mg/L 6-BA+1.0 mg/L IBA。每個(gè)三角瓶約3～4個(gè)子葉節(jié)，于26℃、光照條件下培養(yǎng)，2周后對叢生芽誘導(dǎo)的情況進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.2.3叢生芽生根培養(yǎng)基激素濃度篩選將分化出的叢生芽切下，以每瓶5個(gè)外植體接種于叢生芽生根培養(yǎng)基上，生根培養(yǎng)基以1/2MS為基本培養(yǎng)基，IBA濃度分別為0、0.5、1.0、1.5、2.0 mg/L，培養(yǎng)15 d，重復(fù)3次。培養(yǎng)條件與叢生芽誘導(dǎo)培養(yǎng)條件相同，每2天觀察一次，記錄生根的快慢、根形、生根率，篩選最佳濃度。

2結(jié)果與分析

2.1不同消毒方法消毒效果比較

以NaClO作為消毒劑時(shí)，種子發(fā)芽大多受到抑制，發(fā)芽率極低，可能是因?yàn)橄緞B透到浸泡之后的種子內(nèi)部，對其造成了嚴(yán)重傷害。HgCl2和NaClO+HCl處理的種子萌發(fā)速度一致，2 d之后開始萌發(fā)，發(fā)芽率也一致，從試驗(yàn)操作的簡便性方面考慮應(yīng)選擇HgCl2。在消毒時(shí)間方面可以看出7 min為最佳消毒時(shí)間，污染率為零（表1）。因此，HgCl2消毒7 min為最佳消毒方法。

2.2不同激素配比對叢生芽誘導(dǎo)的影響

接種約1周后，可見子葉節(jié)處有小芽長出，2周后對叢生芽誘導(dǎo)情況進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，結(jié)果見表2?？梢钥闯?，吉農(nóng)28在激素濃度為1.5 mg/L 6-BA+0.5 mg/L IBA時(shí)的誘導(dǎo)率最高，達(dá)到89%；九農(nóng)21在激素濃度為2.0 mg/L 6-BA+0.8 mg/L IBA時(shí)的誘導(dǎo)率最高，達(dá)到91%；吉農(nóng)27在激素濃度為2.0 mg/L 6-BA+0.8 mg/L IBA時(shí)的誘導(dǎo)率最高，達(dá)到94%。

2.3不同IBA濃度對叢生芽生根的影響

大豆叢生芽誘導(dǎo)生根常采用的植物生長調(diào)節(jié)劑為IBA，這已被大多數(shù)研究者認(rèn)同，本試驗(yàn)結(jié)果（表3）顯示，三種基因型的大豆生根的最佳培養(yǎng)基均為1/2 MS + 2.0 mg/L IBA。

3結(jié)論與討論

種子的消毒處理是建立大豆子葉節(jié)高效再生體系的前提和基礎(chǔ)，消毒徹底的同時(shí)又要盡可能減少對種子的傷害。消毒時(shí)間長，可降低污染率，但對種子傷害較大，進(jìn)而影響了種子的萌發(fā)。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，用0.1% HgCl2消毒種子7、9 min的污染率均為零，發(fā)芽率比消毒5 min低，這與曲桂芹教授研究的影響大豆體細(xì)胞胚誘導(dǎo)因素的結(jié)果一致[10]。

本試驗(yàn)研究結(jié)果表明，大豆種子消毒的最佳方法為70%酒精消毒30 s后，HgCl2消毒7 min，再用無菌水清洗3～5次。不同品種對叢生芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基的要求存在差異，吉農(nóng)28的最佳叢生芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS+1.5 mg/L 6-BA + 0.5 mg/L IBA；而吉農(nóng)27、九農(nóng)21的最佳培養(yǎng)基為MS+2.0 mg/L 6-BA + 0.8 mg/L IBA。在叢生芽誘導(dǎo)生根階段，吉農(nóng)28、吉農(nóng)27、九農(nóng)21的最佳生根培養(yǎng)基均為1/2 MS + 2.0 mg/L IBA。

外植體褐變是組織培養(yǎng)過程中常見的現(xiàn)象，為避免因外植體褐變造成培養(yǎng)材料的損失，本試驗(yàn)在子葉節(jié)外植體接種后，將外植體每隔7 d向新鮮培養(yǎng)基中轉(zhuǎn)移一次，以減輕褐變造成的影響。同時(shí)在培養(yǎng)基中添加適量VC來減少褐變發(fā)生，效果比較理想。

參考文獻(xiàn)：

[1]Hinchee M A W， Connor-Ward D V，Newell C A， et al.Production of transgenic soybean plants using Agrobacterium—mediated DNA transer[J].Nature Biotechnology，1988，6（8）：915-922.

[2]McCabe D E， Swain W F， Martinell B J， et al.Stable transformation of soybean（Glycine max）by particle acceleration[J].Nature Biotechnology，1988，6（8）：923-926.

[3]Cheng T Y， Saka H， Voqui-Dinh T H. Plant regeneration from soybean cotyledonary node segments in culture[J]. Plant ScienceLetters， 1980， 19（2）： 91-99.

[4]Kartha K K， Pahl K， Leung N L， et al. Plant regeneration from meristems of grain legumes： soybean， cowpean， peanut， chickpea and bean[J]. Can J. Bot. 1981，59（9）：1671-1679.

[5]Kim J， LaMotte C E， Hack E. Plant regeneration in vitro from primary leaf nodes of soybean （Glycine max） seedlings[J]. Journal of Plant Physiology， 1990， 136（6）： 664-669.

[6]Barwale U B， Kenms H R， Widholm J M. Plant regeneration from callus cultures of several soybean genotypes via embrogenesis and organogenesis[J].Planta， 1986，167（4）：473-481.

[7]Wright M S， Williams M H， Pierson P E， et al.Initiation and propagation of Giycine max L. Merr.：Plants：from tissue-cultured epicotyls[J].Plant Cell Cult.，1987， 8（1）：83-90.

[8]Dan Y， Reighceri N A. Organogenic regeneration of soybean from hypocotyl explants[J]. In Vitro Cellular & Developmental Biology-Plant， 1998， 34（1）： 14-21.

[9]Yoshida T. Adventitious shoot formation from hypocotyls sections of mature soybean seeds[J]. Breeding Science， 2002， 52（1）： 1-8.

[10]曲桂芹，張賢澤，霍俊偉. 影響大豆體細(xì)胞胚誘導(dǎo)因素的研究[J].植物研究，2001，21（2）：210-215.

外植體褐變是組織培養(yǎng)過程中常見的現(xiàn)象，為避免因外植體褐變造成培養(yǎng)材料的損失，本試驗(yàn)在子葉節(jié)外植體接種后，將外植體每隔7 d向新鮮培養(yǎng)基中轉(zhuǎn)移一次，以減輕褐變造成的影響。同時(shí)在培養(yǎng)基中添加適量VC來減少褐變發(fā)生，效果比較理想。

參考文獻(xiàn)：

[1]Hinchee M A W， Connor-Ward D V，Newell C A， et al.Production of transgenic soybean plants using Agrobacterium—mediated DNA transer[J].Nature Biotechnology，1988，6（8）：915-922.

[2]McCabe D E， Swain W F， Martinell B J， et al.Stable transformation of soybean（Glycine max）by particle acceleration[J].Nature Biotechnology，1988，6（8）：923-926.

[3]Cheng T Y， Saka H， Voqui-Dinh T H. Plant regeneration from soybean cotyledonary node segments in culture[J]. Plant ScienceLetters， 1980， 19（2）： 91-99.

[4]Kartha K K， Pahl K， Leung N L， et al. Plant regeneration from meristems of grain legumes： soybean， cowpean， peanut， chickpea and bean[J]. Can J. Bot. 1981，59（9）：1671-1679.

[5]Kim J， LaMotte C E， Hack E. Plant regeneration in vitro from primary leaf nodes of soybean （Glycine max） seedlings[J]. Journal of Plant Physiology， 1990， 136（6）： 664-669.

[6]Barwale U B， Kenms H R， Widholm J M. Plant regeneration from callus cultures of several soybean genotypes via embrogenesis and organogenesis[J].Planta， 1986，167（4）：473-481.

[7]Wright M S， Williams M H， Pierson P E， et al.Initiation and propagation of Giycine max L. Merr.：Plants：from tissue-cultured epicotyls[J].Plant Cell Cult.，1987， 8（1）：83-90.

[8]Dan Y， Reighceri N A. Organogenic regeneration of soybean from hypocotyl explants[J]. In Vitro Cellular & Developmental Biology-Plant， 1998， 34（1）： 14-21.

[9]Yoshida T. Adventitious shoot formation from hypocotyls sections of mature soybean seeds[J]. Breeding Science， 2002， 52（1）： 1-8.

[10]曲桂芹，張賢澤，霍俊偉. 影響大豆體細(xì)胞胚誘導(dǎo)因素的研究[J].植物研究，2001，21（2）：210-215.

外植體褐變是組織培養(yǎng)過程中常見的現(xiàn)象，為避免因外植體褐變造成培養(yǎng)材料的損失，本試驗(yàn)在子葉節(jié)外植體接種后，將外植體每隔7 d向新鮮培養(yǎng)基中轉(zhuǎn)移一次，以減輕褐變造成的影響。同時(shí)在培養(yǎng)基中添加適量VC來減少褐變發(fā)生，效果比較理想。

參考文獻(xiàn)：

[1]Hinchee M A W， Connor-Ward D V，Newell C A， et al.Production of transgenic soybean plants using Agrobacterium—mediated DNA transer[J].Nature Biotechnology，1988，6（8）：915-922.

[2]McCabe D E， Swain W F， Martinell B J， et al.Stable transformation of soybean（Glycine max）by particle acceleration[J].Nature Biotechnology，1988，6（8）：923-926.

[3]Cheng T Y， Saka H， Voqui-Dinh T H. Plant regeneration from soybean cotyledonary node segments in culture[J]. Plant ScienceLetters， 1980， 19（2）： 91-99.

[4]Kartha K K， Pahl K， Leung N L， et al. Plant regeneration from meristems of grain legumes： soybean， cowpean， peanut， chickpea and bean[J]. Can J. Bot. 1981，59（9）：1671-1679.

[5]Kim J， LaMotte C E， Hack E. Plant regeneration in vitro from primary leaf nodes of soybean （Glycine max） seedlings[J]. Journal of Plant Physiology， 1990， 136（6）： 664-669.

[6]Barwale U B， Kenms H R， Widholm J M. Plant regeneration from callus cultures of several soybean genotypes via embrogenesis and organogenesis[J].Planta， 1986，167（4）：473-481.

[7]Wright M S， Williams M H， Pierson P E， et al.Initiation and propagation of Giycine max L. Merr.：Plants：from tissue-cultured epicotyls[J].Plant Cell Cult.，1987， 8（1）：83-90.

[8]Dan Y， Reighceri N A. Organogenic regeneration of soybean from hypocotyl explants[J]. In Vitro Cellular & Developmental Biology-Plant， 1998， 34（1）： 14-21.

[9]Yoshida T. Adventitious shoot formation from hypocotyls sections of mature soybean seeds[J]. Breeding Science， 2002， 52（1）： 1-8.

[10]曲桂芹，張賢澤，霍俊偉. 影響大豆體細(xì)胞胚誘導(dǎo)因素的研究[J].植物研究，2001，21（2）：210-215.