SREBP-1c基因多態(tài)性與非酒精性脂肪性肝病的關(guān)系研究

張海英，高燕翔，馮曉凡，張乾勇，糜漫天

·論著·

SREBP-1c基因多態(tài)性與非酒精性脂肪性肝病的關(guān)系研究

張海英，高燕翔，馮曉凡，張乾勇，糜漫天

目的 研究固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白-1c(SREBP-1c)基因多態(tài)性與非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)的關(guān)系。方法 選取152例NAFLD患者和146例未患脂肪肝人員，收集血液樣本檢測(cè)血脂水平，采用聚合酶鏈反應(yīng)-限制線片段長(zhǎng)度多態(tài)性(PCR-RFLP)技術(shù)分析SREBP-1c基因18號(hào)外顯子54G/C多態(tài)性。結(jié)果 NAFLD病例組TC、TG和LDL-C水平均明顯高于對(duì)照組(P<0.05)。兩組的SREBP-1c18號(hào)外顯子54G/C單核苷酸多態(tài)性均以GG型的比例最高，兩組基因型頻率分布有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(χ2=6.1096，P<0.05)，NAFLD病例組中C等位基因頻率明顯高于對(duì)照組(χ2=6.2520，P<0.05)。C等位基因攜帶者患NAFLD的風(fēng)險(xiǎn)是G等位基因的1.6484倍(OR=1.6484，95%CI：1.3233～10.0984)。結(jié)論 研究對(duì)象的血脂水平異常與NAFLD的患病有顯著相關(guān)性，參與糖代謝、脂代謝的SREBP-1c基因18號(hào)外顯子54G/C呈現(xiàn)多態(tài)性，其C等位基因可能會(huì)使個(gè)體的NAFLD發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)增加。

固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白-1c；非酒精性脂肪性肝??；基因多態(tài)性；等位基因

近年來我國(guó)非酒精性脂肪性肝病(non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD)的患病率呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，已經(jīng)成為主要的公共衛(wèi)生問題之一[1-2]。NAFLD的病因和發(fā)病機(jī)理一直爭(zhēng)論不休，有學(xué)者曾用“盲人摸象”來形容人們對(duì)NAFLD 的認(rèn)識(shí)[3]。目前，“二次打擊”學(xué)說占主導(dǎo)地位，這一理論認(rèn)為：胰島素抵抗(IR)作為初次打擊，使得肝內(nèi)脂肪蓄積，導(dǎo)致肝細(xì)胞脂肪變性；氧應(yīng)激及脂質(zhì)過氧化損傷作為第二次打擊，導(dǎo)致脂肪變的肝臟發(fā)生炎性反應(yīng)、壞死和纖維化[4]。脂代謝紊亂與NAFLD發(fā)病密切相關(guān)，而固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白(sterol-regulatory element-binding proteins，SREBPs)參與機(jī)體的糖、脂代謝[5-8]，其中SREBP-1c主要參與脂肪合成相關(guān)基因的表達(dá)調(diào)控，并受胰島素、葡萄糖等因素的調(diào)控，是代謝綜合征中重要的基因調(diào)控連結(jié)點(diǎn)[9]。SREBP-1c基因18號(hào)外顯子54G/C單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism，SNP)與2型糖尿病以及肥胖的發(fā)生有關(guān)[10-11]，但其與NAFLD的關(guān)系如何還缺乏相關(guān)報(bào)道。本研究應(yīng)用聚合酶鏈反應(yīng)-限制線片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析(PCR-RFLP)，對(duì)SREBP-1c基因18號(hào)外顯子54G/C多態(tài)性進(jìn)行分析，研究其多態(tài)性對(duì)血脂水平的影響及其與NAFLD發(fā)病的關(guān)系。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象 2012年9～11月，在重慶西南醫(yī)院體檢中心征集B超檢查診斷的NAFLD病例152例(其中男性96例，女性56例)，同時(shí)，按照年齡、性別、身高以及居住地等信息配比在前來體檢的人群中選擇未患脂肪肝的對(duì)象146例作為對(duì)照。排除標(biāo)準(zhǔn)為：(1)經(jīng)常過量飲酒的人員，男性飲酒折合乙醇量>140 g/w(女性>70 g/w)；(2)年齡超過60歲；(3)有慢性肝炎病史；(4)非重慶市常住居民；(5)血糖高于7.8 mmol/L、嚴(yán)重高血壓(>160/110 mmHg)、腎功能嚴(yán)重異常等患者。

1.2 方法

1.2.1 基本信息的調(diào)查 調(diào)查者與研究對(duì)象簽知情同意書，調(diào)查其個(gè)人基本信息、健康狀況和生活方式等，測(cè)量身高和體重。

1.2.2 DNA提取 采集NAFLD組及對(duì)照組人群抗凝血液樣本，每份血液約600 μl，裝入1.5 ml的離心管，采用BioFlux公司的Biospin全血基因組DNA提取試劑盒提取DNA，經(jīng)紫外分光光度計(jì)測(cè)試樣本DNA濃度符合試驗(yàn)要求，放入-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 PCR擴(kuò)增 運(yùn)用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)SREBP-1c的引物，上游為5'-CCTGTGCTACTTTGCCTTTT-3'，下游是5'-GGACAGAGCTGGGAGGTG-3'，由上海賽百盛基因技術(shù)有限公司合成。PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系：依次加入DNA模板3.0 μl，10×PCR buffer 2.5 μl，Mg2+1.5 μl，2.5 mmol/L dNTPs 2.5 μl，上、下游引物各1 μl，下游引物1 μl，Taq DNA聚合酶1 μl，加雙蒸水至25 μl。PCR擴(kuò)增條件：95 ℃預(yù)變性3 min，94 ℃變性50 s，62 ℃退火40 s，72 ℃延伸55 s，循環(huán)32次，最后72 ℃延伸5 min。

1.2.4 XmnⅠ酶切及基因型判定 酶切反應(yīng)體系31 μl：PCR產(chǎn)物10 μl，DEPC處理水18 μl，10×Tango緩沖液2 μl，XmnⅠ限制性內(nèi)切酶1 μl(Thermo 公司)，37 ℃恒溫過夜(12 h)。酶切產(chǎn)物、PCR產(chǎn)物及DNA Marker(TIANGEN公司)經(jīng)2%瓊脂糖凝膠110 V電泳40 min，經(jīng)計(jì)算機(jī)軟件成像。將酶切產(chǎn)物、PCR產(chǎn)物與DNA Marker比較以確定基因型：GG型為164 bp和206 bp；GC型為164 bp、206 bp和370 bp；CC型為370 bp。

1.2.5 血脂水平測(cè)定 血清總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)用奧林巴斯AU2700大型全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定。

2 結(jié)果

2.1 兩組基本情況 NAFLD病例組和對(duì)照組的年齡、身高基本一致，病例組的體重、BMI卻顯著高于對(duì)照組(P<0.05，表1)。

2.2 兩組血脂水平分析 NAFLD病例組TC、TG和LDL-C明顯高于對(duì)照組，而HDL-C顯著低于對(duì)照組(P<0.05，表2)。

2.3 SREBP-1c基因18號(hào)外顯子54G/C多態(tài)性 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物片段長(zhǎng)度為370 bp。GG型基因的擴(kuò)增產(chǎn)物可被XmnⅠ酶切，可見164 bp和206 bp兩個(gè)片段；GC基因型屬于雜合子，有164 bp、206 bp和370 bp三個(gè)片段；而CC基因型不能被XmnⅠ酶切，僅見370 bp一個(gè)片段(圖1)。

圖1 SREBP-1c基因18號(hào)外顯子54G/C PCR產(chǎn)物及各基因型酶切片段

1、2：GC型；3、5、6、7：GG型；4:空白；8：CC型；P:未酶切PCR產(chǎn)物；M：DNA Marker

2.4 兩組SREBP-1c基因型頻率及等位基因頻率分布情況 兩組均以GG型的比例最高，等位基因頻率均以G為優(yōu)勢(shì)。NAFLD病例組和對(duì)照組基因型頻率分布有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(χ2=6.1096，P<0.05)；等位基因頻率在NAFLD病例組和對(duì)照組中的分布也有顯著差異(χ2=6.2520，P<0.05)，C等位基因攜帶者患NAFLD的風(fēng)險(xiǎn)是G等位基因的1.6484倍(OR=1.6484，95%CI：1.3233～10.0984)。見表3。

2.5 不同SREBP-1c基因型間血脂水平比較 NAFLD病例組TC、TG和LDL-C水平均以CC基因型患者較高，但與病例組組內(nèi)GC、GG基因型患者的差異不顯著(P>0.05)。對(duì)照組TG、LDL-C水平CC基因型明顯高于對(duì)照組組內(nèi)的GG、GC基因型(P<0.05)，而TC、HDL-C水平則在對(duì)照組組內(nèi)各基因型間無(wú)明顯差異(P>0.05)。見表4。

表1 兩組的基本情況比較

注：與對(duì)照組比較，①P<0.05

表2 兩組血脂檢測(cè)結(jié)果(mmol/L)

注：與對(duì)照組比較，①P<0.05

表3 兩組SREBP-1c基因18號(hào)外顯子多態(tài)性分布

注：①χ2=6.1096，P<0.05；②χ2=6.2520,P<0.05

表4 SREBP-1c基因18號(hào)外顯子不同基因型血脂水平分析(mmol/L)

注：與同組GC、GG基因型比較，①P<0.05

3 討論

SREBP是一類膜連接蛋白，分別由SREBP-1和SREBP-2基因編碼，有SREBP-1a、SREBP-1c和SREBP-2三種同工型，分布于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和核膜上。其中SREBP-1a、SREBP-1c主要調(diào)節(jié)脂肪酸(FFA)、TG和葡萄糖代謝相關(guān)酶基因的表達(dá)，因此與FFA、TG和葡萄糖代謝有明顯關(guān)系[9]。研究發(fā)現(xiàn)，SREBP-1c基因18號(hào)外顯子54G/C多態(tài)性與法國(guó)人的肥胖癥及2型糖尿病的發(fā)生有關(guān)[10-11]。其與NAFLD的關(guān)系報(bào)道很少。

本研究結(jié)果顯示，NAFLD組血脂TC、TG和LDL-C水平均明顯高于對(duì)照組(P<0.05)。本研究中NAFLD組與對(duì)照組的SREBP-1c 18號(hào)外顯子54G/C單核苷酸多態(tài)性均以GG型所占比例最高，C等位基因攜帶者患NAFLD的風(fēng)險(xiǎn)是G等位基因的1.6484倍(OR=1.6484，95%CI：1.3233～10.0984)。研究結(jié)果顯示，SREBP-1c第54位堿基G同義突變?yōu)镃(GGG→GGC)，其表達(dá)的調(diào)節(jié)主要在mRNA水平，雖然沒有引起第952位的氨基酸甘氨酸(Gly)的變化，但是該突變可能影響SPEBP-1c mRNA 的二級(jí)結(jié)構(gòu)及其穩(wěn)定性[12]，從而導(dǎo)致蛋白質(zhì)表達(dá)發(fā)生微小變化，使NAFLD的患病風(fēng)險(xiǎn)增加。

NAFLD組和對(duì)照組內(nèi)基因型的TC、TG、HDL-C、LDL-C水平均以CC型為高，但除對(duì)照組內(nèi)TG、LDL-C這兩項(xiàng)CC基因型明顯高于GC、GG型以外(P<0.05)，其他組間CC型與GC、GG型血脂水平的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。提示C等位基因可能會(huì)使個(gè)體的NAFLD發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)增加。但關(guān)于基因型對(duì)血脂的影響，鑒于CC型人群數(shù)量樣本較少，從本次研究中還難以判斷基因型的不同是否是NAFLD患者血脂異常的易感因素，需要加大樣本量進(jìn)一步研究。

綜上所述，人群的血脂水平異常與NAFLD的患病有顯著相關(guān)性[13-14]，而參與糖代謝、脂代謝的SREBP-1c基因18號(hào)外顯子54G/C呈現(xiàn)多態(tài)性，其C等位基因可能會(huì)使個(gè)體的NAFLD發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)增加。

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Research on correlation between gene polymorphism of sterol regulatory element binding protein 1c and non-alcoholic fatty liver disease

Zhang Haiying1,2,Gao Yanxiang1,Feng Xiaofan2,Zhang Qianyong1,Mi Mantian1

1.Research Center for Nutrition and Food Safety,the Third Military Medical University/Chongqing Key Laboratory of Nutrition and Food Satety,Chongqing 400038,China;2.Chengdu Ommay Health Examination Hospital,Chengdu,Sichuan,610041,China

Objective To study the correlation between gene polymorphism of sterol regulatory element binding protein 1c(SREBP-1c)and non-alcoholic fatty liver disease(NAFLD).Methods 152 patients with NAFLD and 146 persons without fatty liver were selected as the subjects.Their blood samples were collected,and the blood fat levels were detected.Polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism(PCR-RFLP)was used to analyze the polymorphism of NO.18 exon 54G/C of SREBP-1c gene.Results The levels of TC,TG,and LDL-C in the NAFLD group were significantly higher than those in the control group(P<0.05).The proportion of GG type was the highest in the mononucleotide polymorphism of SREBP-1c NO.18 exon 54G/C in both groups.There were significant differences in the genotypic frequency between the two groups(χ2=6.1096,P<0.05).The frequency of C allele genotype in NAFLD group was significantly higher than that in the control group(χ2=6.2520,P<0.05).The onset risk degree of NAFLD in the carriers of C allele was 1.6484 times of that in the carriers of G allele(OR=1.6484,95%CI:1.3233-10.0984).Conclusion There is a significant correlation between the abnormal blood fat level and the NAFLD morbidity in the subjects.The No.18 exon 54G/C of SREBP-1c which takes part in the glycometabolism and lipid metabolism presents polymorphism.The C allele may increase the onset risk of NAFLD.

sterol regulatory element binding protein 1c;non-alcoholic fatty liver disease;gene polymorphism;allele

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(30972469)

400038 重慶，第三軍醫(yī)大學(xué)營(yíng)養(yǎng)與食品安全研究中心、重慶市營(yíng)養(yǎng)與食品安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(張海英，高燕翔，張乾勇，糜漫天)；成都安生美健康體檢醫(yī)院(張海英，馮曉凡)

張乾勇，電話：023-68752643；E-mail：zqianyong@yahoo.com

R 575.29

A

1004-0188(2014)02-0117-04

10.3969/j.issn.1004-0188.2014.02.001

2013-06-03)