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    病毒核酸檢測對降低輸血傳播疾病殘余風(fēng)險的分析研究

    2014-07-18 01:56:00周麗君郭偉鵬譚湘濤王麗鴻
    關(guān)鍵詞:磁珠獻血者核酸

    周麗君, 郭偉鵬, 譚湘濤, 姚 華, 王麗鴻, 李 旭

    (1烏魯木齊市血液中心, 烏魯木齊 830000; 2新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院, 烏魯木齊 830054)

    輸血相關(guān)傳播病原體的預(yù)防和控制特別是預(yù)防經(jīng)輸血傳播病毒已經(jīng)成為全世界關(guān)注的焦點。輸血傳播疾病殘余風(fēng)險是由于現(xiàn)行的血清學(xué)檢測技術(shù)(ELISA)檢測的是抗原或/和抗體,不能直接檢測病毒核酸,存在“窗口期”、病毒變異、免疫沉默等原因[1],ELISA血液篩檢檢測模式很難達到預(yù)期的效果,因此仍不能完全杜絕輸血傳染病的發(fā)生,使血液質(zhì)量尚存在隱患。核酸擴增技術(shù)(NAT)是在分子生物學(xué)水平基礎(chǔ)上直接對病原體核酸進行檢測,是血液中病原體存在的最直接證據(jù),作為對ELISA檢測的補充,大大縮短檢測窗口期。國外很多國家,如美國、德國、荷蘭、新加坡等很早就開展了NAT檢測,降低輸血傳播疾病殘余風(fēng)險[2]。

    新疆位于祖國西北,經(jīng)濟相對落后,各族人民大雜居、小聚居,人員素質(zhì)參差不齊,對傳染性疾病的預(yù)防和控制相關(guān)知識匱乏,是乙型肝炎、艾滋病高發(fā)地區(qū),而且艾滋病感染者向一般人群傳染呈上升趨勢[3],存在較高的輸血風(fēng)險。烏魯木齊血液中心是第二批核酸檢測試點單位,本研究通過對ELISA檢測陰性、NAT檢測陽性的標本定期進行追蹤分析,觀察其有無血清學(xué)轉(zhuǎn)換,以探究NAT檢測對降低輸血傳播疾病殘余風(fēng)險的可行性。

    1 資料與方法

    1.1 研究對象

    觀察對象為2011年3-10月在烏魯木齊血液中心6個采血點無償獻血者14 696例,其中男性8 692例,女性6 004例,年齡18~55歲,平均27.7歲。按照國標(GB18467-2001) 獻血者健康檢查要求合格方可獻血,為保護獻血者隱私,所有樣本均采用13位數(shù)條碼,不出現(xiàn)姓名,條碼50年不重復(fù)。

    1.2 標本的采集和運送

    每位獻血者采血后留取2管血液,第1管采用EDTA 3K真空抗凝管留取5 mL,用于ELISA血液檢測;第2管采用 EDTA 2K帶分離膠真空抗凝管留取5 mL,用于NAT血液檢測。運送時標本放置于冷藏儲存箱,溫度控制在2~8℃,3 h內(nèi)離心,24 h內(nèi)檢測。

    1.3 主要試劑、儀器

    試劑盒均有中國生物制品研究所批檢及防偽標簽,質(zhì)控品來自衛(wèi)生部臨床檢驗中心。ELISA用不同試劑廠家檢測2遍。HBsAg:上??迫A(批號201011031、201101041、201105011)、北京金豪(201012166、201102016、201103033);抗-HCV:北京萬泰(C20101001、C20110101、C20110305)、北京金豪(201008121、201012165、201101003);抗-HIV:北京萬泰(I20100813、I20101001、I201012060)、生物梅里埃(A62AA、20110204、20110205),HBV-HCV-HIV 熒光PCR試劑盒(上??迫A)。儀器經(jīng)過強檢合格確認后方可使用,維護包括日維護、周維護、月維護,出現(xiàn)故障及時聯(lián)系工程師。主要儀器:生物安全柜、離心機、STAR全自動加樣儀、FAME全自動酶免分析儀、核酸提取儀器、熒光PCR儀、冷藏柜。

    1.4 實驗方法

    1.4.1 血清學(xué)檢測 獻血者血液標本按照衛(wèi)生部要求乙肝病毒表面抗原(HBsAg)、丙肝抗體(抗-HCV)、艾滋病抗體(抗-HIV)用ELISA方法檢測。在采血前為減少血液報廢,預(yù)先作HBsAg膠體金快速篩檢,預(yù)篩合格方可采血;ELISA法前處理用全自動加樣儀(STAR)進行加樣本、陰性對照、陽性對照、標準質(zhì)控品,使用一次性加樣尖,避免污染;后處理用全自動酶免分析儀(FAME)檢測,所有試劑均采用掃描條碼的方式。為保證實驗質(zhì)量,同時用2種試劑檢測,結(jié)果均陽性,或1種試劑檢測結(jié)果陽性用該種試劑雙孔復(fù)測試管和血辮,仍至少1孔陽性、HBsAg、抗-HCV設(shè)立80%的灰區(qū),抗-HIV設(shè)立70%的灰區(qū),均按照反應(yīng)性處理。

    1.4.2 NAT檢測 病毒核酸提取采用磁珠分離、純化技術(shù),擴增檢測采用熒光TaqMan PCR探針技術(shù),HBV-HCV-HIV單人份檢測。主要包括3個步驟:(1)樣本制備以分離HBV DNA、HCV RNA、HIV RNA;(2)RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA;(3)cDNA的PCR擴增及特異性熒光探針的檢測。操作自動化始終閉管,防止氣溶膠產(chǎn)物污染。

    1.4.3 病毒核酸提取 病毒核酸提取采用磁珠法。在加有去抑制劑磁珠溶液混合物的核酸提取模板1各孔加入100 μL待測標本,再加入130 μL已加入內(nèi)標的裂解液,將板1~5按照程序提示放入KHB DP-1000 磁珠分離儀,進行分離、清洗和洗脫。裂解:破碎病毒蛋白外殼釋放核酸;分離純化:將模板從裂解液中分離提純,去除雜質(zhì)。加入裂解液釋放樣本中的核酸后,核酸會和包裹有二氧化硅的磁珠微粒相結(jié)合,通過特制的磁棒吸附、試劑溶液置換和釋放磁珠,從而實現(xiàn)核酸的純化。

    1.4.4 擴增檢測 核酸擴增利用體外合成的方法,把待檢基因大批量復(fù)制后檢測,取試劑盒中HBV、HCV、HIV項目的PCR反應(yīng)液A、PCR反應(yīng)液B、PCR反應(yīng)液C,按A∶B∶C=8∶6∶1,用移液器分裝至PCR反應(yīng)板各孔中,每孔15 μL,再加入15 μL已處理好的模板標本,貼上蓋膜后轉(zhuǎn)移到擴增檢測區(qū),使用A7500熒光PCR擴增儀進行擴增檢測,指導(dǎo)特定的DNA序列合成,并使該區(qū)段迅速得到大量擴增,利用溫度的升降來控制DNA的變性和復(fù)性;變性(92~94℃),高溫使DNA變性,即雙鏈DNA解鏈為單鏈;退火(40~60℃)溫度降低,使引物和DNA片段結(jié)合復(fù)性;延伸(72℃),以引物片段為啟動片段,在DNA聚合酶和dNTPs存在下完成基因片段的延伸,一般進行25~40個循環(huán),每1個循環(huán)可以使靶序列增加1倍。

    1.4.5 ELISA陰性、NAT陽性標本的追蹤 及時與獻血者取得聯(lián)系,重新采集血樣檢測NAT、乙肝病毒表面抗體(HBsAb)、丙肝抗體(抗-HCV)、人類免疫缺陷病毒抗體(抗-HIV)、乙肝病毒e抗原(HBeAg)、乙肝病毒e抗體(HBeAb)、乙肝病毒核心抗體(HBcAb)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT),標本送至上??迫A再次確定。并進行定期采樣追蹤,監(jiān)測血清學(xué)的轉(zhuǎn)換和感染的狀態(tài)。

    2 結(jié)果

    2.1 ELISA與NAT檢測結(jié)果

    篩查無償獻血者14 696例,陽性標本共154例,陽性率1.05%(154/14 696)。ELISA檢測陽性共152例(2份標本HBsAg、抗-HCV同時陽性):HBsAg陽性率為0.52%(76/14 696),抗-HCV陽性率為0.37%(55/14 696),抗-HIV陽性率為0.16%(23/14 696);NAT檢測陽性共71例(2份標本HBV DNA、HCV RNA同時陽性):HBV DNA陽性率0.22%(32/14 696),HCV RNA陽性率為0.18%(27/14 696),HIV RNA陽性率為0.10%(14/14 696);14 544例ELISA檢測陰性標本中,NAT檢測沒有檢出HCV RNA、HIV RNA陽性標本,檢出2例HBV DNA陽性標本,見表1。

    表1 2遍ELISA篩查及NAT檢測結(jié)果/例

    2.2 ELISA陰性、NAT陽性標本追蹤分析

    對2份HBsAg陰性、HBV DNA陽性樣本,通知獻血者采樣檢測,送至上??迫A確認結(jié)果為乙肝五項陰性、HBV DNA 陽性。對獻血者定期采血追蹤檢測:第1例獻血者追蹤結(jié)果:第0天乙肝五項為陰性;第7天追蹤HBcAb陽性;第14天追蹤HBsAg結(jié)果弱陽性(OD值為0.251)、HBcAb陽性;第21天追蹤HBsAg結(jié)果陽性(OD值為1.055)、HBeAg陽性、HBcAb陽性,結(jié)果為大三陽;第30天因為獻血者有事,追蹤時間間隔為10 d,HBsAg結(jié)果陽性(OD值為3.000)、HBeAg陽性、HBcAb陽性,結(jié)果為大三陽,并且ALT升高明顯,追蹤期間HBV DNA為陽性并且CT值一直降低,說明病毒載量持續(xù)增高,本例追蹤結(jié)果為“窗口期”感染;第2例獻血者信息追蹤結(jié)果:第0天、第7天、第14天、第21天、第30天、第60天、6個月、10個月分別進行采血追蹤的熒光PCR結(jié)果均為HBsAg陰性、HBV DNA陽性,未出現(xiàn)血清學(xué)轉(zhuǎn)換,但是HBcAb持續(xù)陽性,為隱匿性乙型肝炎。

    3 討論

    本研究14 544例ELISA檢測陰性標本中,NAT檢測沒有發(fā)現(xiàn)HCV RNA、HIV RNA陽性標本,本地區(qū)的HIV感染率在全國較高,盡管如此,在ELISA檢測合格獻血者中也沒有檢測出HIV RNA陽性標本,說明本地區(qū)無償獻血者血液的HCV及HIV檢測水平已達到了相當高的安全性和可靠性;但是發(fā)現(xiàn)有2例HBV DNA陽性標本,說明ELISA有漏檢,存在輸血傳播疾病殘余風(fēng)險,并且高于尚桂芳等[3]研究的輸血殘余風(fēng)險評估結(jié)果,但該文獻中殘余風(fēng)險評估所使用的數(shù)據(jù)為經(jīng)過HBsAg初篩合格后的獻血者的檢測結(jié)果,而導(dǎo)致低估殘余風(fēng)險;低于Luo等[4]的研究結(jié)果。主要有以下原因:(1)本研究使用的試劑中國產(chǎn)試劑占主流,其靈敏度有待進一步提高,從而直接導(dǎo)致檢出率偏低;(2)有研究發(fā)現(xiàn)乙型肝炎的主要傳播方式由非垂直傳播轉(zhuǎn)化為垂直傳播,垂直傳播所檢測的HBsAg的滴度較高,在獻血前已被“金標法”淘汰,導(dǎo)致獻血者中乙肝的整體流行率下降,降低ELISA陰性、NAT陽性的獻血者;(3)NAT檢測在本地區(qū)尚處于起步階段,留樣、離心、檢測、分析各方面經(jīng)驗不夠豐富,有可能導(dǎo)致檢出率偏低;但是高于國內(nèi)的遼寧、上海等地的檢測結(jié)果[5-6],與乙型肝炎感染的地區(qū)感染率和樣本量有關(guān)。此外,與國內(nèi)某些血站調(diào)查的數(shù)據(jù)較為接近[7];與美國國立衛(wèi)生研究所提供的數(shù)據(jù)相差較大,也與德國、英國等國家和日本等亞洲國家發(fā)表的文獻數(shù)據(jù)相差較大[8]。

    本研究成功攔截了2位獻血者血液,獻血者獻血之后將血液分離為血漿、手工血小板、懸浮紅細胞,若沒有NAT檢測則會發(fā)放到臨床,這些血液制品會分別輸給至少6例病人,使這些患者均有感染乙型肝炎的機率,而且機率很大,后果不堪設(shè)想。為了獻血者健康狀況和用血者安全,NAT作為對ELISA血檢的補充,開展NAT檢測對降低輸血殘余風(fēng)險和提高臨床輸血安全的價值無疑是非常巨大的。我國部分地區(qū)開展NAT檢測的數(shù)據(jù)表明,ELISA漏檢的HBV比較多,因為我國屬乙肝高發(fā)區(qū)[9],所以獻血者HBV陽性率必然會相對較高[10]。由于歐美國家HBV感染率很低,因此使用NAT主要是檢測HCV、HIV。國內(nèi)已經(jīng)有經(jīng)過追蹤確認的HCV、HIV窗口期檢出實例和報道,其NAT檢出率與Offergeld等[11]的研究數(shù)據(jù)相當。衛(wèi)生部規(guī)定的采用ELISA試劑篩查血液傳染病指標,由于該方法本身的局限性,使臨床輸血傳播疾病殘余風(fēng)險比較大。NAT對降低因輸血感染病毒而引起經(jīng)血液傳播傳染病的風(fēng)險起著重要作用,磁珠法提取核酸具有操作簡便、所需時間短、易于自動化、對核酸標本的回收率高和純度好等優(yōu)勢。NAT在發(fā)達國家已經(jīng)成為對獻血者篩查的必要手段。袁曉華等[12]報道血液NAT與ELISA具有互補性,只要有效結(jié)合這2種方法的檢測結(jié)果,建立適合我國國情的血液病毒篩查模式,既能減少經(jīng)濟的投入,又能最大限度地降低輸血殘余風(fēng)險,保證血液安全。我國血液剩余感染風(fēng)險差異性很大,其原因值得進一步研究、分析和澄清,進一步采取相應(yīng)的策略。因此,開展NAT檢測,以降低現(xiàn)存的傳播疾病的殘余風(fēng)險、進一步提高血液的安全性意義較大。

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