橡膠樹半胱氨酸蛋白酶基因HbCP2的克隆與表達(dá)特性分析

鄒 智 劉建汀 莊美露 楊禮富

(中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院橡膠研究所，農(nóng)業(yè)部儋州熱帶作物科學(xué)觀測(cè)實(shí)驗(yàn)站，海南 儋州 571737)

橡膠樹半胱氨酸蛋白酶基因HbCP2的克隆與表達(dá)特性分析

鄒 智 劉建汀 莊美露 楊禮富

(中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院橡膠研究所，農(nóng)業(yè)部儋州熱帶作物科學(xué)觀測(cè)實(shí)驗(yàn)站，海南 儋州 571737)

根據(jù)EST和基因組序列設(shè)計(jì)引物，應(yīng)用RT-PCR技術(shù)從橡膠樹的根組織中分離到1條長(zhǎng) 1 056 bp的cDNA，該序列包含了 1 023 bp的開放讀碼框(ORF)，17 bp的5’ UTR和16 bp的3’ UTR；ORF預(yù)測(cè)編碼340個(gè)氨基酸，理論分子量為37.52 kD，等電點(diǎn)為5.25，屬于液泡定位的分泌型蛋白；蛋白含有1個(gè)Inhibitor_I29和1個(gè)Peptidase_C1A結(jié)構(gòu)域，隸屬于木瓜蛋白酶C1家族；蛋白與蓖麻、楊樹中同源蛋白的相似性均在80%以上，將基因命名為HbCP2。表達(dá)分析顯示，在所分析的根、樹皮、木質(zhì)部、芽、葉片、葉柄和乳管等組織中，HbCP2僅在根中被檢測(cè)到，表現(xiàn)出明顯的組織特異性。

橡膠樹；半胱氨酸蛋白酶；根特異性表達(dá)

半胱氨酸蛋白酶是一類活性位點(diǎn)含有親核半胱氨酸殘基的蛋白水解酶，也稱為巰基蛋白酶。根據(jù)蛋白的結(jié)構(gòu)特征和進(jìn)化關(guān)系，半胱氨酸蛋白酶可分為木瓜蛋白酶C1、天冬氨酸內(nèi)肽酶C13、胱冬肽酶C14、鈣依賴半胱氨酸蛋白酶C2、泛素C端水解酶C12和泛素特異蛋白酶C19六大家族，其中以木瓜蛋白酶研究較多[1]。在植物中，半胱氨酸蛋白酶廣泛參與種子萌發(fā)、幼苗發(fā)育、組織分化、衰老、細(xì)胞程序性死亡和各種脅迫應(yīng)答等生物學(xué)過程[1-2]。橡膠樹(HeveabrasiliensisMuell.Arg.)是一種原產(chǎn)于亞馬遜河流域的熱帶雨林喬木，鑒于其重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值而在東南亞,中國和非洲等部分國家和地區(qū)廣為種植。迄今，橡膠樹中僅報(bào)道了1個(gè)半胱氨酸蛋白酶編碼基因——HbCP1(DQ642886)，該基因在乳管中的表達(dá)豐度明顯高于樹皮和葉片，且受割膠和乙烯利誘導(dǎo)[3]?；贓ST和基因組序列，本研究從橡膠樹的根中克隆到一個(gè)根表達(dá)的HbCP2基因，通過對(duì)其序列特征和表達(dá)特性進(jìn)行分析，以期為下一步的功能研究與利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料來源

1.1.1 基因克隆與表達(dá)分析所用材料 橡膠樹無性系熱研7-33-97的組培苗由中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院橡膠研究所育種課題組提供，裝袋栽于大棚，選擇長(zhǎng)勢(shì)一致、均具有4個(gè)葉蓬、且最上層葉片完全綠化的植株，待下層葉片出現(xiàn)明顯黃化后(即用SPAD-502便攜式葉綠素測(cè)定儀測(cè)得最底層葉片的葉綠素含量約降為最上層葉片的1/2)，分別采集根、樹皮、木質(zhì)部、芽、4個(gè)葉蓬的葉片、最上層葉片的葉柄和葉柄的膠乳(乳管細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)成分)作為試驗(yàn)材料。

1.1.2 菌株和質(zhì)粒 大腸桿菌菌株JM109由本實(shí)驗(yàn)室保存，克隆載體pMD18-T購自Takara公司。

1.1.3 酶、試劑盒及生化試劑 膠回收試劑盒購自Promega公司；小型質(zhì)粒提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、TaKaRa LATaq、T4-DNA連接酶、限制性內(nèi)切酶及其他工具酶均購自大連寶生物工程有限公司和基因公司；IPTG、X-Gal等生化試劑為進(jìn)口或國產(chǎn)分析純，PCR引物的合成和基因的序列測(cè)定委托北京三博遠(yuǎn)志生物有限責(zé)任公司完成。

1.2 分析方法

1.2.1 總RNA的提取和cDNA第一鏈的合成 葉柄膠和其他組織總RNA的提取分別參照鄒智等的研究方法[4-5]；cDNA第一鏈的合成參照PrimeScript?RT reagent Kit With gDNA Eraser試劑盒說明書。

1.2.2 基因克隆 以從根轉(zhuǎn)錄組文庫(未發(fā)表)中篩選到的EST作為查詢序列，應(yīng)用BLASTn程序[6]同源搜索橡膠樹的基因組序列(RY7-33-97品系為，未發(fā)表)，然后根據(jù)序列信息，采用Primer 5在基因編碼區(qū)的兩側(cè)設(shè)計(jì)引物對(duì)HbCP2F(5’AGCTACCACCATTCCTCATGGAG 3’)和HbCP2R(5’ACTGCTATCTTGAAC TTCATGCAGTGG 3’)。以反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板進(jìn)行PCR 反應(yīng)，反應(yīng)體系為：1 μL cDNA模板，5 μL 10×PCR buffer，5 μL 25 mmol/L MgCl2，8 μL 2.5 mmol/L dNTP，0.5 μL 20 μmol/L HbCP2F，0.5 μL 20 μmol/L HbCP2R，0.5 μL 5 U/μL LATaq，加ddH2O至50 μL。用PE9700 PCR 儀進(jìn)行PCR 反應(yīng)，反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性3 min，然后94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1.0 min，35個(gè)循環(huán)，最后72 ℃延伸5 min。吸取5 μL PCR產(chǎn)物與1 μL 6×loading buffer混勻后用1.0%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳后，經(jīng)溴化乙錠(EB)染色，再紫外成像檢測(cè)。PCR產(chǎn)物挖膠回收后連接到pMD18-T上，用熱擊法導(dǎo)入JM109感受態(tài)細(xì)胞后，進(jìn)行藍(lán)白斑篩選、PCR驗(yàn)證、質(zhì)粒酶切電泳后，取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的陽性菌液1 mL用400 μL 4℃預(yù)冷的50%甘油保存，委托北京三博遠(yuǎn)志生物有限責(zé)任公司用M13+/M13-進(jìn)行雙向測(cè)序。

1.2.3 基因序列的生物信息學(xué)分析 多序列比對(duì)和進(jìn)化樹的構(gòu)建采用ClustalW2[7]和MEGA 4.0[8](用Neighbor-Joing法，bootstrap值設(shè)為 1 000)；蛋白的一級(jí)結(jié)構(gòu)分析采用ProtParam和ProtScale( http://web.expasy.org/)；保守結(jié)構(gòu)域分析采用SMART(http://smart.embl-heidelberg.de/)；翻譯后修飾采用MotifScan(http://myhits.isb-sib.ch/cgi-bin/motif_scan)；亞細(xì)胞定位分析采用TargetP 1.1軟件(http://www.cbs.dtu.dk/services/)和SignalP 4.1軟件(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)；跨膜結(jié)構(gòu)域的預(yù)測(cè)采用TMHMM 2.0軟件(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)。

1.2.4 基因的表達(dá)特性分析 根據(jù)測(cè)序結(jié)果，設(shè)計(jì)引物對(duì)HbCP2Fq(5’GCCTAACGACTGGGGCTAAT 3’)和HbCP2Rq(5’GCGACAGCCTTCATTAGTGC 3’)；以18SrRNA(18SF:5’GCTCGAAGACGATCAGATACC 3’；18SR: 5’TTCAGCCTTGCGACCATAC 3’)作為參照基因，進(jìn)行半定量分析，72 ℃延伸時(shí)間設(shè)為20 s，目的基因和18S的擴(kuò)增循環(huán)數(shù)分別設(shè)為25個(gè)和18個(gè)。

2 結(jié)果與分析

2.1 基因克隆結(jié)果分析

在前期構(gòu)建的橡膠樹的根轉(zhuǎn)錄組文庫中(未發(fā)表)，獲得了1條 1 238 bp的EST，該序列包含 1 023 bp的ORF，其編碼蛋白與其他植物的半胱氨酸蛋白酶同源。通過將序列及原始Read比對(duì)到橡膠樹的基因組(未發(fā)表)上，發(fā)現(xiàn)基因的轉(zhuǎn)錄區(qū)全長(zhǎng) 1 317 bp(其與先前報(bào)道的RRIM600基因組的對(duì)應(yīng)區(qū)域存在8個(gè)SNP差異)，含有1個(gè)長(zhǎng)度為90 bp的內(nèi)含子，而EST 的3’端存在8 bp的多A加尾序列。

以HbCP2F和HbCP2R為引物、根反轉(zhuǎn)錄的cDNA作為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，成功獲得1條近1 000 bp的清亮條帶(圖1)。測(cè)序結(jié)果表明，除不含內(nèi)含子序列外，PCR擴(kuò)增到的序列與基因組的對(duì)應(yīng)區(qū)域僅存在2個(gè)堿基的差異(圖2)，但均沒有影響編碼蛋白。

2.2 基因序列的生物信息學(xué)分析

2.2.1HbCP2基因及其編碼蛋白的一級(jí)結(jié)構(gòu)分析 序列分析表明，HbCP2編碼區(qū)的GC含量為46.53%，預(yù)測(cè)編碼340個(gè)氨基酸，理論分子量(Mw)為37.52 kD，等電點(diǎn)(pI)為5.25，pH 7.0時(shí)的帶點(diǎn)荷數(shù)(ch)為-8.49；就氨基酸組成而言，在構(gòu)成該蛋白的20種氨基酸中，丙氨酸(Ala)含量最高(10.9%)，甘氨酸(Gly)次之(10.0%)，組氨酸(His)含量最低(1.5%)；就構(gòu)成氨基酸的理化特性而言，該蛋白包含36個(gè)強(qiáng)堿性氨基酸(K,R)，45個(gè)強(qiáng)酸性氨基酸(D,E)，108個(gè)疏水氨基酸(A,I,L,F,W,V)和94個(gè)極性氨基酸(N,C,Q,S,T,Y)，脂肪族指數(shù)(AI)為62.65，不穩(wěn)定系數(shù)(Ⅱ)為20.00；該蛋白的總平均親水性(GRAVY)為-0.451，除N-端外，蛋白的其他區(qū)域主要表現(xiàn)為親水性。

2.2.2 HbCP2蛋白保守結(jié)構(gòu)域分析 結(jié)構(gòu)域搜索顯示，HbCP2含有1個(gè)Inhibitor_I29(39～96位，PF08246，E值為6.55×10-24)和1個(gè)Peptidase_C1( 123～339 位，PF00112，E值為9.23×10-122，包含保守的半胱氨酸、組氨酸和天冬氨?；钚晕稽c(diǎn))結(jié)構(gòu)域(圖3)。

2.2.3 HbCP2蛋白翻譯后修飾、亞細(xì)胞定位及跨膜結(jié)構(gòu)域分析 MotifScan分析顯示，HbCP2蛋白的19～24、133～138、142～147、186～191、204～209、215～220、272～277位和307～312位為N-豆蔻酰化位點(diǎn)；54～60位為酪氨酸磷酸化位點(diǎn)；29～32、34～37、92～95、125～128、169～172、180～183、222～225、240～243位和280～283位為酪氨酸蛋白激酶II磷酸化位點(diǎn)；98～100、164～166位和222～224位為蛋白激酶C磷酸化位點(diǎn)；119～122位為天冬氨酰糖基化位點(diǎn)；141～152位為巰基蛋白酶半胱氨酸活性位點(diǎn)；282～292位為巰基蛋白酶組氨酸活性位點(diǎn)；299～318位為巰基蛋白酶天冬氨?；钚晕稽c(diǎn)。

TMHMM顯示，HbCP2蛋白的N端含有1個(gè)跨膜螺旋，其中7～26位為跨膜區(qū)。TargetP和SignalP分析表明,HbCP2是一個(gè)分泌型蛋白，其中1～27位信號(hào)肽，其酶切位點(diǎn)在26和27位之間(圖3)。

2.2.4 HbCP2蛋白的同源比對(duì)與進(jìn)化分析 同源分析表明，HbCP2與蓖麻(Ricinuscommunis，XP_002531151，XP_002531152)、楊樹(Populustrichocarpa，XP_002306369)中同源蛋白的相似性均在80%以上，而與擬南芥(Arabidopsisthaliana)SAGH12(AT5G45890)和橡膠樹CP1(BG33750)的相似性也分別為61%和50%，顯示出較高的保守性(圖3～4)。

2.3HbCP2基因的表達(dá)特性分析

以相同濃度的反轉(zhuǎn)錄cDNA(包括根、樹皮、木質(zhì)部、芽、葉片、葉柄和乳管，由于HbCP2在擬南芥中的同源基因AtSAGH12主要在衰老葉片中特異表達(dá)，因而,本研究專門分析了不同時(shí)期的衰老葉片)作為模板，用內(nèi)參基因18SrRNA及目標(biāo)基因HbCP2的定量引物分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果顯示，18S的表達(dá)比較穩(wěn)定，而HbCP2僅在根組織中被檢測(cè)到(圖5顯示了基因在根和4個(gè)葉蓬葉片中的轉(zhuǎn)錄水平)。

3 結(jié)論與討論

半胱氨酸蛋白酶廣泛存于各類動(dòng)物、植物和微生物中，因其在蛋白質(zhì)降解及氮素循環(huán)利用中的重要作用而備受關(guān)注。本研究報(bào)道了1個(gè)全新的橡膠樹半胱氨酸蛋白酶基因——HbCP2，雖然該基因在核酸水平與已經(jīng)報(bào)道的HbCP1[3]無明顯同源，但在蛋白水平上，兩者的相似性高達(dá)50%。與HbCP1蛋白一樣，HbCP2包含1個(gè)Inhibitor_I29和1個(gè)Peptidase_C1A結(jié)構(gòu)域，隸屬于木瓜(Chaenomeles sinensis)蛋白酶C1家族，但HbCP2的序列長(zhǎng)度(340aa)比HbCP1(457aa)短，同時(shí)缺乏HbCP1N端的RTX和C端的GRAN結(jié)構(gòu)域。進(jìn)化分析表明，HbCP2與擬南芥半胱氨酸蛋白酶中AtSAGH12的相似性最高。AtSAGH12是一個(gè)典型的衰老相關(guān)基因[9-10]，主要在擬南芥的衰老葉片和花中表達(dá)，然而，HbCP2的表達(dá)模式與AtSAGH12明顯不同，顯示出根特異表達(dá)特性：首先，研究試圖以基因克隆引物HbCP2F和HbCP2R對(duì)來源于根、樹皮、木質(zhì)部、芽、葉片(考慮到基因可能只在衰老葉片中表達(dá)，研究特異選取了具有4個(gè)葉蓬的植株，分析了完全綠化的葉片、葉綠素已減半的衰老葉片以及居于中間的2蓬葉片)、葉柄和乳管組織的cDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果只有在根組織中得到了擴(kuò)增。然后，研究又以定量引物HbCP2Fq和HbCP2Rq進(jìn)行PCR，得到類似的結(jié)果；最后，研究又同源搜索了橡膠樹已公布的芽、膠乳、樹皮、葉片的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)[11-14]，同樣未能找到同源讀段(read)，這表明HbCP2確實(shí)是一個(gè)根特異表達(dá)的基因(至少在本研究所分析的各種組織中)。生物信息學(xué)分析顯示，HbCP2蛋白的不穩(wěn)定系數(shù)<40，總平均親水性<0，且N端含有一段與AtSAGH12類似分泌型的信號(hào)肽，而AtSAGH12為液泡定位蛋白[15]，這表明HbCP2為液泡定位、穩(wěn)定的親水性蛋白?？傊?，雖然HbCP2極有可能行使AtSAGH12類似的功能，但其組織特異性進(jìn)化是否賦予其新的功能或生物學(xué)意義還有待進(jìn)一步研究。

[1]GrudkowskaM,ZagdańskaB.Multifunctionalroleofplantcysteineproteinases[J].ActaBiochimPol,2004,51(3):609-624.

[2] 閆龍鳳,楊青川,韓建國,等.植物半胱氨酸蛋白酶研究進(jìn)展[J].草業(yè)學(xué)報(bào),2005,14(5):11-19.

[3]PengSQ,ZhuJH,LiHL,etal.Cloningandcharacterizationofanovelcysteineproteasegene(HbCP1)fromHevea brasiliensis[J].JBiosci,2008,33(5):681-690.

[4] 鄒智,楊禮富.巴西橡膠樹鐵硫簇支架蛋白cDNA的克隆與分析[J].熱帶作物學(xué)報(bào),2010,31(10):1752-1756.

[5] 鄒智,楊禮富,安峰,等.橡膠樹AtCAB1同源基因的克隆及其在穩(wěn)定與衰老期葉片中的差異分析[J].熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué),2013,33(4):30-35.

[6]AltschulSF,MaddenTL,Sch?fferAA,etal.GappedBLASTandPSI-BLAST:anewgenerationofproteindatabasesearchprograms[J].NucleicAcidsRes,1997,25(17):3389-3402.

[7]ThompsonJD,HigginsDG,GibsonTJ.CLUSTALW:improvingthesensitivityofprogressivemultiplesequencealignmentthroughsequenceweighting,position-specificgappenaltiesandweightmatrixchoice[J].NucleicAcidsRes,1994,22(22):4673-4680.

[8]TamuraK,DudleyJ,NeiM,etal.MEGA4:Molecularevolutionarygeneticsanalysis(MEGA)softwareversion4.0[J].MolBiolEvol,2007,24(8):1596-1599.

[9]LohmanKN,GanSS,JohnMC,etal.MolecularanalysisofnaturalleafsenescenceinArabidopsis thaliana[J].PhysiolPlant,1994,92(2):322-328.

[10] Noh Y S,Amasino R M.Identification of a promoter region responsible for the senescence-specific expression of SAG12[J].Plant Mol Biol,1999,41(2):181-194.

[11] Xia Z,Xu H,Zhai J,et al.RNA-Seq analysis anddenovotranscriptome assembly ofHeveabrasiliensis[J].Plant Mol Biol,2011,77(3):299-308.

[12] Triwitayakorn K, Chatkulkawin P,Kanjanawattanawong S, et al.Transcriptome sequencing ofHeveabrasiliensisfor development of microsatellite markers and construction of a genetic linkage map[J].DNA Res,2011,18(6):471-482.

[13] Chow K S, Mat-Isa M N, Bahari A, et al. Metabolic routes affecting rubber biosynthesis inHeveabrasiliensislatex[J].J Exp Bot,2011,63(5):1863-1871.

[14] Li D,Deng Z,Qin B,et al.Denovoassembly and characterization of bark transcriptome using Illumina sequencing and development of EST-SSR markers in rubber tree(HeveabrasiliensisMuell.Arg.)[J].BMC Genomics,2012,13:192.

[15] Otegui M S, Noh Y S, Martínez D E, et al. Senescence-associated vacuoles with intense proteolytic activity develop in leaves ofArabidopsisand soybean[J].Plant J,2005,41(6):831-844.

(責(zé)任編輯 張 坤)

Molecular Cloning and Expression Analysis of a Cysteine Proteinase Gene (HbCP2) fromHeveabrasiliensis

ZOU Zhi, LIU Jian-ting, ZHUANG Mei-lou, YANG Li-fu

(Danzhou Investigation & Experiment station of Tropical Crops, Ministry of Agriculture/Rubber Research Institute, Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences, Danzhou Hainan 571737, China)

Based on the EST and genome sequences, a 1 056 bp cDNA was isolated from the root tissue ofHeveabrasiliensiswith specific primers via RT-PCR. The sequence contains a 1 023 bp long open reading frame (ORF), 17 bp 5′UTR and 16 bp 3′UTR. The ORF was predicted to encode 340 amino acids with a theoretical molecular weight (Mw) of 37.52 kD and isolectric point (pI) of 5.25; The sequence was predicted to be a secretory protein located to vacuoles; the protein contains one Inhibitor_I29 domain and one Peptidase_C1A domain and can be categoried as the papain C1 family; the protein shares a similarity of more than 80% with the homologues in castor bean (Ricinuscommunis), poplar (Populustrichocarpa), and then this gene was designated asHbCP2. Semi-quantitative RT-PCR analysis showed thatHbCP2 exhibits a root-specific expression pattern in examed tissues, i.e. root, bark, xylem, bud, leaf, petiole and laticifer.

Heveabrasiliensis; cysteine proteinase; root-specific expression

2013-11-13

國家自然科學(xué)資金(31371556)資助；海南省自然科學(xué)基金(312026)資助；中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院橡膠研究所基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)(1630022011014)資助。

楊禮富(1968—)，男，研究員。研究方向：分子生物學(xué)。Email:ylfri@126.com。

10.3969/j.issn.2095-1914.2014.04.005

S718.46

A

2095-1914(2014)04-0026-05

第1作者：鄒智(1982—)，男，助理研究員。研究方向：分子生物學(xué)。Email:zouzhi2008@126.com。