白樺開花調(diào)控相關(guān)基因FLC、LFY和SOC1的克隆及表達(dá)分析

王子佳 姜 靜 劉桂豐 劉菲菲 李慧玉

(林木遺傳育種國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 (東北林業(yè)大學(xué))，黑龍江 哈爾濱 150040)

白樺開花調(diào)控相關(guān)基因FLC、LFY和SOC1的克隆及表達(dá)分析

王子佳 姜 靜 劉桂豐 劉菲菲 李慧玉

(林木遺傳育種國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 (東北林業(yè)大學(xué))，黑龍江 哈爾濱 150040)

為研究LFY、FLC及SOC1開花調(diào)控關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)基因在白樺花時(shí)調(diào)控中的作用，從白樺轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中獲得了LFY和FLC的全長cDNA序列，分別命名為BpLFY和BpFLC。獲得的BpLFY基因編碼區(qū)長1 215 bp，編碼405個(gè)氨基酸，分子量為45.3 kD。BpFLC基因cDNA編碼區(qū)長627 bp，編碼209個(gè)氨基酸，分子量為11.4 kD，這2個(gè)基因分別屬于FLO-LFY和MADS超家族。對(duì)3個(gè)基因的啟動(dòng)子進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)3個(gè)基因啟動(dòng)子區(qū)均含有2個(gè)花粉特異表達(dá)的順式作用元件。通過實(shí)時(shí)定量PCR對(duì)BpLFY、BpFLC及BpSOC1在白樺莖尖、葉片、雄花序和葉腋中表達(dá)模式的分析結(jié)果表明，BpSOC1和BpFLC在白樺各個(gè)組織部位均表達(dá)，而BpLFY只在雄花序和發(fā)育中的腋芽中表達(dá)，且在葉片中BpFLC可抑制BpSOC1的表達(dá)。

白樺；FLC；LFY；SOC1；啟動(dòng)子分析；基因表達(dá)

在植物的生長發(fā)育周期中，開花是被子植物最重要的發(fā)育過程[1]。MADS-box基因在顯花植物花器官的分化、花時(shí)調(diào)節(jié)以及果實(shí)的發(fā)育與成熟等過程中均起著重要的調(diào)控作用。通過30多年的擬南芥遺傳分析，目前已經(jīng)得出了4條復(fù)雜的開花誘導(dǎo)調(diào)控途徑：光周期途徑、春化途徑、自主途徑以及赤霉素途徑[2-4]。這4種途徑通過對(duì)一些關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)基因的控制，如FLC(FloweringLocusC)、LFY(LEAFY)、SOC1(SuppressorofOverexpressionofConstans1)等，從而調(diào)控植物開花過程[5-6]。FLC、SOC1是2個(gè)最重要的開花調(diào)控基因，除此之外的MADS-box基因和非MADS-box基因通過調(diào)節(jié)FLC和SOC1，影響植物開花時(shí)間。4條擬南芥(Arabidopsisthaliana)開花相關(guān)的調(diào)節(jié)途徑中，F(xiàn)LC和CO(Constans)對(duì)SOC1表達(dá)的抑制和促進(jìn)均是通過與其啟動(dòng)子區(qū) (2個(gè)相鄰的CArG基序列)的結(jié)合實(shí)現(xiàn)的，并且前者的結(jié)合會(huì)對(duì)后者與SOC1的結(jié)合產(chǎn)生阻礙。同時(shí)，SOC1 在莖頂端表達(dá)的編碼產(chǎn)物能直接和AGL24結(jié)合，并激活LFY的表達(dá)，從而促進(jìn)植物開花[1,5-6]。因此FLC、LFY、SOC1是植物成花過程中具有代表性的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)基因。

LFY與AP1基因通過ABC模型共同調(diào)控花器官生長發(fā)育。Yamaguchi等研究發(fā)現(xiàn)LFY基因可抑制花梗發(fā)育,通過花梗長度和方向(角度)影響花序結(jié)構(gòu)的多樣性[7]。近幾年的研究中發(fā)現(xiàn)LFY與DNA結(jié)合具有促進(jìn)腋分生組織生長的能力[8]。

白樺(BetulaplatyphyllaSuk.)是東北主要造林樹種，花期為5月，果熟期7月，在前期研究中已克隆獲得SOC1基因[9]。本研究成功克隆了重要的開花調(diào)控節(jié)點(diǎn)基因FLC和LFY，并研究了FLC、LFY、SOC1在不同組織中的時(shí)序表達(dá)，為深入了解林木成花分子機(jī)理，尋找關(guān)鍵基因提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試材取自東北林業(yè)大學(xué)林木遺傳育種試驗(yàn)基地多年生已開花結(jié)實(shí)的白樺。由于白樺雌花在第1年的6月初開始雌花芽發(fā)育，并以花原基方式越冬，第2年早春(4月下旬)繼續(xù)發(fā)育，成熟一般在5月初并在此階段授粉；而雄花發(fā)育是在當(dāng)年的6月開始，所以根據(jù)白樺花序發(fā)育過程特點(diǎn)，從6月末到8月中旬選取6月25日、7月10日、7月25日和8月10日4個(gè)時(shí)間點(diǎn)，分別摘取30株白樺莖尖、葉片、雄花序、腋芽混樣， -80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

PrimeScript?RT-PCR Kit購自寶生物工程(大連)有限公司，BioEasy SYBR Green I Real Time PCR Kit購自TOYOBO，引物由上海生工生物技術(shù)服務(wù)公司合成。OPTICON 2實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(MJ Research?)上進(jìn)行。

1.2 分析方法

1.2.1 白樺BpLFY和BpFLC基因的獲得及序列分析 從白樺二倍體、四倍體、頂芽6個(gè)白樺轉(zhuǎn)錄組(未公布)中獲得的Unigenes進(jìn)行拼接得到全長序列，通過BLASTX和BLASTN比對(duì)分析對(duì)基因功能進(jìn)行注釋，最終獲得全長LFY和FLC，命名為BpLFY，BpFLC。用NCBI ORF Finder 程序查找序列的ORF ；用ProtParam(http://au.expasy.org /tools/ protparam.html)計(jì)算蛋白分子的分子量以及理論P(yáng)I；用BLASTP預(yù)測保守區(qū)；用軟件MEGA 4.0進(jìn)行多序列比對(duì)及系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹的構(gòu)建。

1.2.2BpSOC1、BpLFY和BpFLC基因啟動(dòng)子分析 根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)獲得的白樺基因組數(shù)據(jù)(未公布)，獲得了BpSOC1、BpLFY和BpFLC基因ORF區(qū)上游 2 000 bp的啟動(dòng)子序列。通過PLACE在線分析軟件(http://www.dna.affrc.go.jp/PLACE/)對(duì)3個(gè)基因的啟動(dòng)子序列進(jìn)行分析[10]。

1.2.3BpSOC1、BpLFY和BpFLC基因在不同組織部位的表達(dá)分析 采用CTAB法分別提取白樺莖尖、葉片、雄花序、腋芽的總RNA，并通過RNA的反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA序列，將之稀釋10倍，-20℃保存，用于定量PCR。

根據(jù)3個(gè)節(jié)點(diǎn)基因的開放閱讀框設(shè)計(jì)實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物(表1)。以不同組織(莖尖、葉片、雄花序、腋芽)和時(shí)間(6月25日、7月10日、7月25日和8月10日)的白樺RNA為模板，分別擴(kuò)增3個(gè)節(jié)點(diǎn)基因和2個(gè)內(nèi)參基因α-tublin、18SrRNA，每個(gè)基因進(jìn)行3次重復(fù)試驗(yàn)。實(shí)時(shí)定量PCR方法及體系參見文獻(xiàn)[9]。使用Opticon Monitor 2.02分析擴(kuò)增數(shù)據(jù)，并采用Duncan法和IBM SPSS Statistics 19軟件對(duì)其進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。根據(jù)公式X=2-ΔΔCT(X表示目標(biāo)基因的相對(duì)內(nèi)參基因的表達(dá)量；CT表示熒光信號(hào)達(dá)到設(shè)定閾值需要的循環(huán)數(shù)；ΔCT表示目標(biāo)基因相對(duì)內(nèi)參基因的差異；ΔΔCT表示目標(biāo)基因與參照基因的ΔCT差異)確定3個(gè)基因在不同組織的時(shí)序表達(dá)情況[11]。

表1 3個(gè)節(jié)點(diǎn)基因及內(nèi)參基因?qū)崟r(shí)熒光定量PCR的引物序列

2 結(jié)果與分析

2.1BpLFY和BpFLC基因的序列分析

從6個(gè)白樺轉(zhuǎn)錄組的Unigene序列拼接后獲得BpLFY和BpFLC基因全長cDNA序列。獲得的BpLFY基因cDNA為 1 514 bp，其中5’UTR 103 bp，3’UTR 196 bp，編碼區(qū)長 1 215 bp，編碼405個(gè)氨基酸，分子量為45.3 kD，理論等電點(diǎn)為6.52。BpFLC基因cDNA為 1 005 bp, 其中5’UTR 193 bp，3’UTR 185 bp，編碼區(qū)長627 bp，編碼209個(gè)氨基酸，分子量為11.4 kD，理論等電點(diǎn)為9.89(表2)。通過BLASTP比對(duì)，這2個(gè)基因分屬于FLO-LFY超家族和MADS超家族(圖1)。

表2 白樺BpLFY和BpFLC的序列特征

經(jīng)BLASTX序列比對(duì)， BpLFY與胡桃(Juglansregia)、 山核桃(Caryacathayensis)LFY的同源性分別為91%和88%；BpFLC與葡萄(Vitisvinifera)、咖啡(Coffeaarabica)FLC的同源性分別為74%和52%。并通過系統(tǒng)進(jìn)化樹進(jìn)一步驗(yàn)證了克隆的2個(gè)基因?yàn)長FY和FLC(圖2)。

2.2 3個(gè)節(jié)點(diǎn)基因的功能分析

通過使用在線軟件PLACE對(duì)3個(gè)節(jié)點(diǎn)基因的啟動(dòng)子進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)3個(gè)基因的啟動(dòng)子區(qū)除了啟動(dòng)子保守序列CAAT-box和TATA-box外，均含有不同數(shù)量的花粉特異表達(dá)的順式作用元件POLLEN1LELAT52(AGAAA)和花粉晚期基因啟動(dòng)元件GTGANTG10(GTGA)，其中前者在BpSOC1、BpLFY和BpFLC基因中的數(shù)量分別為3個(gè)、3個(gè)和4個(gè)；后者為5個(gè)、7個(gè)和5個(gè)。除此之外還含有一些脅迫應(yīng)答元件，如干旱響應(yīng)元件(MYB1AT、MYBCORE、MYCATRD22、MYB2CONSENSUSAT)、傷害響應(yīng)元件(WBOXNTERF3、WBOXATNPR1、DOFCOREZM)、脫落酸響應(yīng)元件(WRKY71OS、CGCGBOXAT)、低溫響應(yīng)元件(MYCCONSENSUSAT)及熱休克響應(yīng)元件(CCAAT-box)(表3)。

表3 BpSOC1、BpLFY和BpFLC基因啟動(dòng)子區(qū)域主要順式作用元件

2.3 4個(gè)節(jié)點(diǎn)基因在白樺不同組織中的表達(dá)分析

在對(duì)擬南芥等模式植物的研究中發(fā)現(xiàn)，在花時(shí)調(diào)控路徑中FLC作為SOC1的抑制因子作用于SOC1的上游，LFY是SOC1的直接靶基因，是花時(shí)調(diào)控路徑的下游基因，同時(shí)也是最重要的花分生組織決定基因之一[12-13]。為研究這3個(gè)節(jié)點(diǎn)基因在白樺不同組織部位的作用關(guān)系，以6月25日的白樺莖尖中各基因各自的表達(dá)量為對(duì)照，分別研究其在白樺不同組織部位(莖尖、葉片、雄花序和腋芽)中的時(shí)序表達(dá)。

2.3.1BpSOC1在白樺不同組織中的表達(dá)分析 從6月末至8月中旬，BpSOC1在莖尖、葉片和雄花序中的表達(dá)趨勢(shì)基本一致，即在7月末達(dá)到一個(gè)高峰，從7月末到8月中旬表達(dá)量呈下降趨勢(shì)(圖3)。在這3個(gè)組織部位中表達(dá)量最高的時(shí)期均為7月末，表達(dá)量最低的時(shí)期均為8月中旬。在莖尖中BpSOC1在7月末的表達(dá)量為8月中旬的6倍，在葉片中BpSOC1在7月末的表達(dá)量為8中旬的2倍，在雄花序中BpSOC1在7月末的表達(dá)量為8月中旬的4倍。然而在腋芽中BpSOC1從6月末至8月中旬4個(gè)時(shí)期中的表達(dá)量為極顯著的下降趨勢(shì)，其中表達(dá)量最高的時(shí)期為6月末，表達(dá)量最低的時(shí)期為8月中旬?？梢姡谙嗤瑫r(shí)期，BpSOC1在白樺的不同組織部位中表達(dá)存在差異。

在6月末，BpSOC1在腋芽中的表達(dá)遠(yuǎn)高于其他3個(gè)部位，均高出3個(gè)部位表達(dá)量的4倍以上；在7月中旬，BpSOC1在葉片中的表達(dá)量相對(duì)最高，其次是在腋芽和莖尖中，BpSOC1相對(duì)表達(dá)量最低的部位為雄花序，僅是葉片中表達(dá)量的0.24倍；在7月末，BpSOC1在白樺不同組織中的表達(dá)量差異并不明顯，其中BpSOC1在莖尖和葉片中相對(duì)較高，在雄花序和腋芽中相對(duì)較低；在8月中旬，BpSOC1在白樺不同組織部位中的表達(dá)量均顯著低于其他3個(gè)時(shí)期，但其中表達(dá)量相對(duì)較高的部位為葉片，約為此時(shí)期其他組織BpSOC1表達(dá)量的3～4倍。

2.3.2BpLFY在白樺不同組織中的表達(dá)分析 從6月末至8月中旬，BpLFY在莖尖、葉片、雄花序和腋芽中的表達(dá)有相似的趨勢(shì)，即在6月末表達(dá)量最高，而8月中旬表達(dá)量最低。在4個(gè)部位中，表達(dá)最低的部位是莖尖和葉片，并在整個(gè)生長季呈現(xiàn)下降的趨勢(shì)。LFY在雄花序和腋芽的表達(dá)量明顯高于其他2個(gè)部位，在腋芽中LFY的表達(dá)呈逐漸下降的趨勢(shì)，即表達(dá)量最高的時(shí)期為6月末，其次為7月中旬和7月末，表達(dá)量最低的為8月中旬。而BpLFY在6月末雄花序中具有較高的表達(dá)水平，其在6月末表達(dá)量是8月中旬的29.6倍，后期表達(dá)量明顯下降。這說明BpLFY基因的表達(dá)也具有組織特異性，且主要表達(dá)部位為6月份的雄花序和腋芽(圖4)。

2.3.3BpFLC在白樺不同組織中的表達(dá)分析BpFLC在白樺不同組織部位的表達(dá)模式明顯不同(圖5)。在7月末BpFLC的表達(dá)量最高，而其他時(shí)期的表達(dá)量基本一致；BpFLC在葉片中的表達(dá)趨勢(shì)與莖尖中相反，BpFLC在7月末的表達(dá)量最低，其他時(shí)期的表達(dá)量相對(duì)較高，其中最高峰出現(xiàn)在8月中旬，為7月末表達(dá)量的3.8倍；BpFLC在雄花序中的表達(dá)隨著白樺生長季的推移呈現(xiàn)極顯著上升的趨勢(shì)，即BpFLC表達(dá)在6月末到8月中旬這4個(gè)時(shí)期中逐漸增加，BpFLC在8月中旬的表達(dá)量是6月末表達(dá)量的7.2倍；然而BpFLC在腋芽中的表達(dá)趨勢(shì)與雄花序中正好相反，即從6月末到8月中旬逐漸減少，BpFLC在6月的表達(dá)量是8月中旬的4.7倍。

在相同時(shí)期，BpFLC在白樺不同組織部位的表達(dá)量存在差異。由圖5可看出，6月末、7月中旬和7月末，BpFLC在白樺腋芽中的表達(dá)量均高于其他部位。在6月末和7月中旬，BpFLC表達(dá)量最低的部位均在雄花序，表達(dá)量為腋芽中的0.06倍和0.17倍，其次為莖尖，表達(dá)量為腋芽中的0.17倍和0.25倍；在7月末，BpFLC在葉片中的表達(dá)量最低，為腋芽中的0.26倍，而在莖尖和雄花序中的表達(dá)量與腋芽中相差不大；在8月中旬，BpFLC在白樺雄花序中的表達(dá)量相對(duì)最高，其次為葉片，在莖尖和腋芽中的表達(dá)量相對(duì)最低。可見，BpFLC在白樺不同組織部位的表達(dá)模式各不相同。

3 結(jié)論與討論

通過對(duì)BpFLC蛋白結(jié)構(gòu)分析，發(fā)現(xiàn)該蛋白含有豐富的精氨酸和谷氨酸，同時(shí)含有大量DNA結(jié)合位點(diǎn)保守的MADS結(jié)構(gòu)域，表明該基因蛋白屬于典型的MADS-box轉(zhuǎn)錄因子。通過NCBI的Blast X比對(duì)，發(fā)現(xiàn)BpLFY與胡桃的氨基酸序列相似度達(dá)到91%，與山核桃、栗樹和葡萄的同類基因相似度達(dá)到80%以上，說明LFY基因在進(jìn)化上是高度保守的。

通過對(duì)BpLFY、BpFLC和BpSOC1基因啟動(dòng)子序列的分析，推測3個(gè)基因可能參與花發(fā)育的過程。從BpFLC、BpSOC1和BpLFY在白樺不同組織部位的時(shí)序表達(dá)中也可以看到，BpSOC1、BpLFY和BpFLC在雄花序中均呈現(xiàn)出較高的表達(dá)量，說明3個(gè)基因與雄花發(fā)育有關(guān)。BpSOC1和BpFLC在白樺莖尖、葉片、雄花序和葉片中均有表達(dá)，在擬南芥中SOC1在各個(gè)部位均表達(dá)，其表達(dá)量隨著營養(yǎng)生長的進(jìn)程而增加[14-15]，并且不僅作用于植物開花時(shí)間的調(diào)控，還在花分生組織的決定和成花圖譜中具有作用[14-16]。BpLFY雖然只在雄花序中大量表達(dá)，但在腋芽中也具有相對(duì)較高的表達(dá)量，表明該基因參與了翌年白樺花芽的形成。

在葉片中BpFLC和BpSOC1的表達(dá)趨勢(shì)剛好相反，即隨著白樺生長季的進(jìn)行，BpFLC的表達(dá)量是先下降后上升，在7月末達(dá)到一個(gè)表達(dá)低谷，而BpSOC1則是先上升后下降，在7月末達(dá)到一個(gè)表達(dá)高峰。表明白樺中BpFLC和BpSOC1在葉片中存在一個(gè)上下調(diào)控關(guān)系，F(xiàn)LC在擬南芥葉片中表達(dá)，能夠通過抑制SOC1來調(diào)控(推遲)開花[17]。值得一提的是，BpLFY在雄花序中6月末到7月10日之間相對(duì)于白樺其他時(shí)期和組織具有非常高的表達(dá)水平，而BpFLC和BpSOC1在此時(shí)的表達(dá)量均顯著低于白樺其他時(shí)期和部位，這與Lee等[13]報(bào)道的BpLFY作為花分生組織特異基因和花器官?zèng)Q定基因在花器官形成過程中通過抑制成花計(jì)時(shí)基因(BpSOC1)的表達(dá)來保證花組織的正常發(fā)育一致。對(duì)于BpLFY、BpFLC和BpSOC1這3個(gè)轉(zhuǎn)錄因子之間深層的分子調(diào)控機(jī)制，尚有待于進(jìn)一步研究。

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(責(zé)任編輯 張 坤)

Cloning and Expression Analysis of Flowering Regulation Related GenesFLC、LFYandSOC1 ofBetulaplatyphylla

WANG Zi-jia, JIANG Jing, LIU Gui-feng, LIU Fei-fei, LI Hui-yu

(State Key Laboratory of Tree Genetics and Breeding(Northeast Forestry University), Harbin Heilongjiang 150040, China)

LFY,FLCandSOC1 genes are key node genes in flowering regulation network. To characterize their function in birch, complete cDNA sequences ofLFYandFLCwere obtained from transcriptome datas ofBetulaplatyphylla, namedBpLFYandBpLFY, respectively.BpLFYwas 1 215 bp in length, encoding a protein of 405 amino acid residues with the molecular mass of 45.3 kD. The length ofBpLFYgene cDNA was 627 bp, encoding 209 amino acid residues with the molecular mass of 11.4 kD, the two genes belonged to FLO-LFY and MADS superfamily, respectively. Analysis of promoters of these genes showed that promoters of all these genes contained two cis-acting elements of pollen specific expression. In different tissues (shoot tip, leaf, male inflorescence and axillary), gene expression ofBpLFY,BpFLCandBpSOC1 genes were investigated by using real-time quantitative RT-PCR. The results showed thatBpSOC1 andBpFLCwere expressed in various tissues of birch, however,BpLFYwas expressed only in the male inflorescence and axillary, andBpFLCcan inhibitBpSOC1 expression in the leaves.

Betulaplatyphylla;FLC；LFY；SOC1；analysis of promoter；gene expression

2014-01-13

“十二五”農(nóng)村領(lǐng)域國家科技計(jì)劃課題(2013AA102704)資助。

李慧玉(1978—)，女，博士，副教授。研究方向：林木遺傳育種。Email:lihuiyu0519@aliyun.com。

10.3969/j.issn.2095-1914.2014.04.004

S722

A

2095-1914(2014)04-0020-06

第1作者：王子佳(1989—)，男，碩士生。研究方向：林木遺傳育種。Email:773615635@qq.com。