結(jié)直腸癌患者血清miR-92a水平測定的臨床意義

仇俊蘭 奉林

結(jié)直腸癌患者血清miR-92a水平測定的臨床意義

仇俊蘭 奉林

目的探討血清miR-92a在結(jié)直腸癌(CRC)診斷和預(yù)后判斷中的價值。方法78例結(jié)直腸癌患者, 分別為無轉(zhuǎn)移組40例和肝轉(zhuǎn)移組38例, 同時募集40例健康志愿者為健康對照組。應(yīng)用實時熒光定量PCR法檢測miR-92a水平。結(jié)果結(jié)直腸癌患者血清miR-92a水平顯著高于健康對照組(P＜0.01), 用于結(jié)直腸癌診斷時的靈敏度為75.3%, 特異度為88.3%；結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移組血清miR-92a水平顯著高于無轉(zhuǎn)移組 (P＜0.05), 鑒別轉(zhuǎn)移性與無轉(zhuǎn)移性CRC患者的敏感性為78.6%, 特異性為86.6%。結(jié)論血清miR-92a可能是一種新的生物學(xué)標(biāo)記物用于結(jié)直腸癌患者的早期診斷, 其水平上調(diào)與結(jié)直腸癌患者預(yù)后有關(guān)。

結(jié)直腸癌；血清；微小RNA；生物學(xué)標(biāo)記

結(jié)直腸癌(colorectal cancer, CRC)是較常見的胃腸道惡性腫瘤, 在世界范圍內(nèi)經(jīng)濟發(fā)達(dá)國家的發(fā)病率較高, 我國結(jié)直腸癌的發(fā)病率近年逐年上升, 且有年輕化的趨勢。早期結(jié)直腸癌多無癥狀, 大多數(shù)患者確診時已屬晚期。影響CRC預(yù)后的最主要因素是病期的早晚［1］, 結(jié)直腸癌的早期診斷和治療能夠明顯延長患者的生存期和生存質(zhì)量, 明顯減少社會醫(yī)療成本, 提高腫瘤早期診斷率顯得尤為重要。

微小RNA(microRNA, miRNA)由長約21～25核苷酸的雙鏈RNA分子構(gòu)成, 是非編碼小RNA大家族中的成員, 與腫瘤的轉(zhuǎn)移、凋亡有關(guān)［2］。與蛋白質(zhì)標(biāo)志物相比, miRNA更早出現(xiàn)異常表達(dá), 且檢測準(zhǔn)確率高, 更利于早期診斷［3］。本文應(yīng)用實時熒光定量PCR技術(shù)測定結(jié)直腸癌患者及對照組血清微小RNA(miR-92a)的水平, 為miR-92a用于結(jié)直腸癌的早期診斷和預(yù)后判斷提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1一般資料 收集本院2010年1月～2013年5月診治的結(jié)直腸癌患者78例, 男41例, 女37例, 年齡35～72歲,平均年齡54.01歲。其中無轉(zhuǎn)移組40例, 肝轉(zhuǎn)移組38例,所有患者均經(jīng)手術(shù)及術(shù)后病理確診, 無其他腫瘤病史, 近3個月未接受抗腫瘤治療。健康對照組為本院體檢中心提供的年齡、性別均匹配的40例健康志愿者, 男20例, 女20例,年齡34～68歲, 平均年齡52.96歲。樣本采集前均獲得知情同意。

1.2檢測方法 采集肘靜脈血2 ml, 室溫放置半小時, 吸取血清, 應(yīng)用mirVanaTM PARISTM 試劑盒抽提總RNA, NanoDrop ND-1000 spectrophotometer儀測定RNA濃度, miScript Reverse Transcription反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行血清總RNA 反轉(zhuǎn)錄, miScript SYBR Green PCR試劑盒進(jìn)行PCR反應(yīng)。血清miR-92a擴增引物為：5’-TATTGCACTTGTCCCGGCCTGT 3’, 內(nèi)參照［4］采用U6snRNA, 引物為 5'-TTCGTGAAGCGTTCCATATTTT 3'。所有引物由上海歐易生物醫(yī)學(xué)科技有限公司合成。PCR反應(yīng)條件為：預(yù)變性95℃15 min, (94℃15 s, 55℃30 s, 70℃34 s), 40個循環(huán)。每個miRNA的相對表達(dá)量用2-△△Ct表示, 其中△Ct=CtmiRNA-CtU6。以上實驗重復(fù)3次。

1.3統(tǒng)計學(xué)方法 血清miR-92a測定結(jié)果通過Medcalc軟件進(jìn)行Mann-Whitney U檢驗和Kruskal-Wallis檢驗；應(yīng)用受試者工作特征曲線(ROC)分析其用于結(jié)直腸癌診斷時的靈敏度和特異度, P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

結(jié)直腸癌患者的血清miR-92a水平顯著高于健康對照者(P＜0.01), 結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移組血清miR-92a水平顯著高于無轉(zhuǎn)移患者(P＜0.05), 見表1。ROC曲線分析顯示, 血清miR-92a相對定量值(臨界值為0.105)用于結(jié)直腸癌診斷時的靈敏度為75.3%, 特異度為88.3%, 曲線下面積(AUC)為0.863, 差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。在臨界值為0.173時, 區(qū)分轉(zhuǎn)移性與無轉(zhuǎn)移性患者的敏感性為78.6%, 特異性為86.6%, AUC為0.896, 差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。

表1血清miR-92a的相對定量值

3 討論

目前發(fā)現(xiàn), 在腫瘤中miRNA與腫瘤代謝相關(guān)因子如細(xì)胞凋亡因子、生長因子、生長因子受體等靶基因結(jié)合而參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程, 各種不同的腫瘤組織、正常組織, 甚至分化水平相同的不同腫瘤細(xì)胞均具有各自特異的miRNA表達(dá)譜［5］, 因而可根據(jù)不同腫瘤特征性的miRNA對其作出準(zhǔn)確診斷。研究表明, 血清中miRNA可作為腫瘤細(xì)胞存在的直接證據(jù), 能有效區(qū)分腫瘤患者和健康人群［6］, 與組織中miRNA相比較, 血清檢測的優(yōu)勢在于無創(chuàng)便捷和水平穩(wěn)定,且血清或血漿中的miRNA于常溫孵育24 h或以上、反復(fù)凍融樣本多次或強酸強堿、甚至煮沸均不影響穩(wěn)定性［7］, 相反,外源性miRNA在加入血漿后則很快被降解, 因此, 血液是理想的miRNA的檢測樣本。

腫瘤的早期診斷, 除了正確選擇生物學(xué)標(biāo)記物和合適的檢測樣本外, 理想的檢測方法也是提高腫瘤檢測特異性的重要方面。血清miRNA的檢測方法, 目前主要有熒光定量聚合酶鏈反應(yīng) (RT-PCR)、熒光原位雜交(FISH)等。本研究應(yīng)用實時熒光定量PCR法測定血清miR-92a水平, 應(yīng)用ROC曲線分析其用于結(jié)直腸癌診斷時的靈敏度為75.3%, 特異度為88.3%, AUC為0.863, 差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)；CRC兩亞組間比較亦有顯著差異, 鑒別肝轉(zhuǎn)移性與無轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌患者的敏感性為78.6%, 特異性為86.6%, AUC為0.896。本研究結(jié)果提示血清miR-92a作為結(jié)直腸癌的生物學(xué)標(biāo)志物有一定的準(zhǔn)確性和可行性, 能有效區(qū)分健康人和CRC患者,可鑒別診斷肝轉(zhuǎn)移性與無轉(zhuǎn)移性的結(jié)直腸癌, 其表達(dá)水平上調(diào)與CRC患者的預(yù)后有關(guān), 與熊青等［8］報道一致。然而,本實驗病例數(shù)尚少, 且血清中miRNA濃度低, PCR反應(yīng)所需循環(huán)次數(shù)多, 持續(xù)時間較長, miRNA檢測方法的標(biāo)準(zhǔn)化和標(biāo)準(zhǔn)化的miRNA診斷閾值的確定以及組織特異miRNA的確定等仍是血清miRNA診斷應(yīng)用中的難題, 不能排除抽樣誤差,故血清miR-92a能否成為結(jié)直腸癌診斷和預(yù)后的新的生物學(xué)標(biāo)記物, 可進(jìn)一步擴大樣本量探究。

［1］ 孫燕.臨床腫瘤學(xué)高級教程.北京：人民軍醫(yī)出版社, 2011: 531-550.

［2］ Babashah S, Soleimani M.The oncogenic and tumour suppressive roles of microRNAs in cancer and apoptosis.Eur J Cancer, 2011, 47(8):1127-1137.

［3］ 徐怡, 陳光明, 宓現(xiàn)強.miRNA在腫瘤早期診斷中的價值及其檢測技術(shù)進(jìn)展.檢驗醫(yī)學(xué), 2013, 28(3):248-251.

［4］ 劉寒梢, 馬越云, 肖華勝.血清微小RNA(miR-129-3p、miR-767-3p和miR-877*)在結(jié)直腸癌診斷中的價值.腫瘤, 2012, 32(1):42-48.

［5］ Catuogno S, Cerchia L, Romano G, et al.miR-34c may protect lung cancer cells from paclitaxel-induced apoptosis.Oncogene, 2013, 32(3):341-351.

［6］ Maitra A, Hruban RH.Pancreatic cancer.Annu Rev Pathol, 2008(3):157-188.

［7］ 奉林, 龐智, 沙莎, 等.結(jié)直腸癌患者血清miR-29a水平測定的臨床意義.航空航天醫(yī)學(xué)雜志, 2012, 23(12):1414-1416.

［8］ 熊青, 徐龍.血清microRNAs在胃腸道疾病中的意義.世界華人消化雜志, 2012, 20(22):2043-2049.

Clinical significance of serum miR-92a in colorectal cancer patients

QIU Jun-lan, FENG Lin.
Department of Oncology, North District of Suzhou Municipal Hospital, Suzhou 215008, China

ObjectiveTo investigate the value of serum miR-92a in the diagnosis and prognosis prediction of colorectal cancer (CRC).MethodsA total of 78 cases of CRC were divided into non-metastasis group (n=40) and liver metastasis group (n=38), and 40 healthy volunteers were put into health control group.The level of miR-92a was detected by real-time RT-PCR.ResultsThe level of serum miR-92a was significantly higher in CRC patients than in the control group (P＜0.01).The sensitivity was 75.3% and the specificity was 88.3% in discriminating CRC.The liver metastasis group had higher level of serum miR-92a than the nonmetastasis group, (P＜0.05).The sensitivity was 78.6% and the specificity was 86.6% in discriminating metastatic or non-metastatic CRC.ConclusionSerum miR-92a can become a new biomarker for early diagnosis of CRC patients, and its level is associated with prognosis of CRC patients.

Colorectal cancer; Serum; MicroRNA; Biomarker

2014-07-08］

215008 蘇州市立醫(yī)院北區(qū)腫瘤內(nèi)科