MSC治療小鼠OB模型排斥反應(yīng)的作用研究

史乾 李靜 范慧敏

·論著·

MSC治療小鼠OB模型排斥反應(yīng)的作用研究

史乾 李靜 范慧敏

目的研究間充質(zhì)干細(xì)胞(MSC)免疫抑制功能在治療小鼠閉塞性細(xì)支氣管炎(OB)中的作用。方法分離C57BL/6小鼠骨髓MSC, 建立小鼠氣管移植后OB反應(yīng)模型, 移植當(dāng)天給予MSC, 30 d后處死小鼠, 移植氣管HE染色, 觀察移植氣管急性排斥反應(yīng)的發(fā)生情況。并用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測移植排斥相關(guān)炎癥因子的含量。結(jié)果MSC治療移植組與異系移植組相比, 排斥反應(yīng)得到緩解, 與無排斥反應(yīng)的同系移植對(duì)照組相似, 移植氣管管腔阻塞程度緩解。移植氣管ELISA檢測發(fā)現(xiàn), MSC治療移植組小鼠體內(nèi)炎癥因子IFN-g下降, 而抑炎因子白細(xì)胞介素-10(IL-10)上升。結(jié)論MSC能緩解小鼠氣管移植后OB反應(yīng), 并調(diào)節(jié)體內(nèi)免疫狀態(tài), 抑制炎癥。

間充質(zhì)干細(xì)胞；閉塞性細(xì)支氣管炎；白細(xì)胞介素-10

肺移植和心肺聯(lián)合移植是治療多種終末期心肺疾病的重要措施, 盡管免疫抑制劑的廣泛使用能較為有效的防治急性期排斥, 然而其對(duì)慢性排斥的作用卻收效甚微。肺移植排斥最主要的慢性排斥反應(yīng)表現(xiàn)為閉塞性細(xì)支氣管炎(obliterative bronchiolitis, OB), 是限制肺移植患者長期存活的主要原因［1,2］。

間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells, MSC)被認(rèn)為不但能分化成不同類型的細(xì)胞系, 而且具有免疫調(diào)節(jié)功能［3,4］。由于MSC具有低免疫原性等特點(diǎn), 因此同種異體的MSC可逃逸宿主的免疫清除, 在細(xì)胞移植方面頗具優(yōu)勢。因此本課題將利用小鼠原位氣管移植模型探討MSC干預(yù)肺移植后OB的作用?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組 近交系雄性C57BL/6小鼠, 體重20～25 g；近交系雄性BALB/c小鼠, 體重20～25 g。均購于上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司［許可證號(hào)SCXK(滬)2007-0005］。飼養(yǎng)于同濟(jì)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心無特定病原體(SPF)動(dòng)物房。該實(shí)驗(yàn)得到同濟(jì)大學(xué)附屬上海市東方醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。分組為同系移植對(duì)照組：C57BL/6→C57BL/6, 8例；異系移植組：BALB/C→C57BL/6, 8例；MSC治療移植組：BALB/C→C57BL/6 + MSC輸注, 8例。

1.2小鼠原位氣管移植模型的建立

1.2.1供體手術(shù) 術(shù)前12 h禁食、禁水。1%戊巴比妥鈉溶液, 0.1 ml/10 g腹腔注射小鼠麻醉。供體頸前正中切口, 游離氣管, 取6個(gè)軟骨環(huán)長度氣管一段, 置4℃生理鹽水備用。

1.2.2受體手術(shù) 同供者, 頸前正中切口, 游離氣管。紗布吸干供體氣管后縫合尾側(cè), 將供體氣管尾側(cè)同受體尾側(cè)氣管膜部正中處縫合打結(jié), 分別于尾側(cè)氣管3、9、12點(diǎn)方位各縫合一針并打結(jié), 對(duì)合整齊。相同方法縫合頭側(cè)氣管。將兩側(cè)頸部肌肉覆被移植氣管后縫合, 縫合皮膚。

1.3標(biāo)本收集 移植術(shù)后30 d處死小鼠。取移植氣管約5個(gè)氣管環(huán), HE染色后, 顯微鏡下觀察小鼠氣管病理切片, 通過QWin軟件分析組織圖片數(shù)據(jù)。

1.4ELISA檢測 取移植氣管約5個(gè)軟骨環(huán), 加入500 μl PBS, 勻漿后離心取上清液, 使用eBioscience IL-10、IFN-g ELISA kit, 分別在酶標(biāo)儀450 nm及570 nm處讀取吸光度。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 所得所有數(shù)據(jù)均采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件處理。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差)表示, 采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1體外分離培養(yǎng)MSC 骨髓培養(yǎng)法從C57BL/6小鼠的骨髓中分離MSC。骨髓細(xì)胞接種于塑料培養(yǎng)瓶后, 細(xì)胞在培養(yǎng)瓶散在分布, 呈圓形。24 h后就見有細(xì)胞貼壁。72 h首次全量換液去除未貼壁細(xì)胞, 此時(shí)貼壁細(xì)胞胞體明顯增大并開始分裂增殖, 細(xì)胞形態(tài)漸變?yōu)樗笮位蚣忓N形。流式細(xì)胞術(shù)檢測各分子的表達(dá)水平, CD105(96.1±8.5)%、CD29(97.7±9.5)%、SCA-1(96.3±10.7)%, CD45(2.34±1.5)%, CD11b(1.41±0.7)%。該群細(xì)胞不表達(dá)CD45和CD11b, 高表達(dá)CD105、CD29和SCA-1。符合小鼠骨髓來源間充質(zhì)干細(xì)胞的表型特點(diǎn)。進(jìn)而在分化功能檢測中, 作者發(fā)現(xiàn)這些細(xì)胞可以分化成為脂肪細(xì)胞和成骨細(xì)胞。

2.2MSC輸注治療OB模型排斥反應(yīng)效果 各標(biāo)本可見各組小鼠氣管吻合口均愈合良好, 無嚴(yán)重狹窄。同系移植對(duì)照組小鼠移植氣管與周圍結(jié)締組織粘連較輕, 氣管形態(tài)接近正常, 管壁可見柱狀上皮細(xì)胞及纖毛, 管壁內(nèi)未見炎性細(xì)胞浸潤或管腔閉塞。而異系移植組小鼠移植氣管與周圍結(jié)締組織粘連較重, 可見黏膜水腫、糜爛, 及上皮纖毛脫失, 內(nèi)膜增厚明顯, 伴隨大量中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞浸潤, 提示存在免疫排斥反應(yīng)。術(shù)后30 d病理學(xué)染色結(jié)果顯示體外培養(yǎng)的MSC培養(yǎng)2代后進(jìn)行過繼輸入作為MSC治療移植組, 與異系移植組對(duì)比, MSC治療移植組炎性細(xì)胞浸潤明顯減輕, 內(nèi)膜增厚程度明顯輕于異系移植組。見圖1。

圖1 小鼠原位氣管移植1個(gè)月后氣管病理切片

2.3MSC對(duì)移植模型體內(nèi)炎癥狀態(tài)影響 為分析MSC如何緩解OB排斥反應(yīng), 作者檢測各組模型體內(nèi)的炎癥因子水平,評(píng)價(jià)MSC對(duì)免疫系統(tǒng)的作用。通過ELISA方法檢測移植物局部抑炎因子IL-10和促炎因子IFN-g水平, 作者發(fā)現(xiàn)MSC治療移植組IL-10水平與其他兩組比較明顯升高(P＜0.05), 而IFN-g水平下降(P＜0.05)。見圖2。

圖2 各組移植氣管炎癥因子檢測分析結(jié)果

3 討論

肺移植是治療終末期肺臟疾病唯一有效的方法［5］。盡管近些年來新的抗移植排斥藥物的應(yīng)用, 以及外科技術(shù)的改進(jìn)使得肺移植術(shù)成功率明顯增加, 但肺移植術(shù)后患者的長期存活率依然很低, 而肺移植后的慢性排斥反應(yīng)是患者長期生存的主要障礙, 使肺移植患者5年生存率低于50%。因此,探索有效的預(yù)防和治療肺移植術(shù)后OB的策略尤為重要。

近年的研究發(fā)現(xiàn), 除了多向分化潛能之外, 免疫調(diào)節(jié)功能也是MSC的重要功能之一。體內(nèi)研究［6］發(fā)現(xiàn)MSC能通過改變T淋巴細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞(DC)的遷移能力改善急性移植物抗宿主病(GVHD)。同時(shí), MSC能有力地下調(diào)其表面CD11c、CD80、CD86及CD40的表達(dá), 上調(diào)CD11C的表達(dá),細(xì)菌脂多糖(LPS)不能逆轉(zhuǎn)此改變, 而且這種MSC處理的DC具有較高的胞吞能力、低免疫源性和較強(qiáng)的免疫調(diào)節(jié)功能［7］。

MSC可通過細(xì)胞接觸, 或者通過其產(chǎn)生的細(xì)胞因子發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)功能［8］。盡管在體內(nèi)研究中, 作者發(fā)現(xiàn)過繼輸入MSC明顯增加了體內(nèi)IL-10的表達(dá)。本研究通過建立小鼠原位氣管移植模型, 于術(shù)后第30天排斥反應(yīng)期檢測移植氣管病理變化及相關(guān)炎癥因子的含量, 探討MSC在移植后OB反應(yīng)中的作用。作者發(fā)現(xiàn)MSC過繼輸入到小鼠OB模型的體內(nèi),可明顯減輕氣管移植物的病理改變, 并緩解移植氣管阻塞的程度。進(jìn)一步對(duì)移植氣管炎癥因子的含量測定發(fā)現(xiàn), MSC治療小鼠后, 移植氣管IL-10明顯升高, IFN-g降低, 提示了MSC能調(diào)節(jié)免疫狀態(tài)抑制排斥。因此, 研究為深入探索MSC發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用的機(jī)制并將這群細(xì)胞用于臨床奠定一定的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。在后續(xù)試驗(yàn)中, 作者將進(jìn)一步在大動(dòng)物OB模型中驗(yàn)證MSC治療排斥反應(yīng)的有效性和可靠性, 為臨床轉(zhuǎn)化應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。

［1］ Hardy JD, Wobb WR , Dalton ML Jr, et al.Lung Homotransplantaion in man.JAMA, 1963:186.

［2］ 范慧敏, 劉中民, 郭建華, 等.心肺聯(lián)合移植治療艾森曼格綜合征4例.中華器官移植雜志, 2006, 27(5):294-296.

［3］ Zappia E, Casazza S, Pedemonte E, et al.Mesenchymal stem cells ameliorate experimental autoimmune encephalomyelitis inducing T-cell anergy.Blood, 2005, 106(5):1755-1761.

［4］ Peister A, Mellad JA, Larson BL, et al.Adult stem cells from bone marrow (MSCs) isolated from different strains of inbred mice vary in surface epitopes, rates of proliferation, and differentiation potential.Blood, 2004,103(5):1662-1668.

［5］ Casiraghi F, Azzollini N, Cassis P, et al.Pretransplant Infusion of Mesenchymal Stem Cells Prolongs the Survival of a Semiallogeneic Heart Transplant through the Generation of Regulatory T cells.Journal of immunology, 2008,181(6):3933-3946.

［6］ Mao F, Xu W, Qian H, et al.Immunosuppressive effects of mesenchymal stem cells in collagen-induced mouse arthritis.Inflamm Res, 2010,59(3): 219-225.

［7］ Cao H, Lan Q, Shi Q, et al.Anti-IL-23 antibody blockade of IL-23/ IL-17 pathway attenuates airway obliteration in rat orthotopic tracheal transplantation.Int Immunopharmacol, 2011, 11(5):569-575.

［8］ Burlingham WJ, Love RB, Jankowska-Gan E, et al.IL-17-dependent cellular immunity to collagen type V predisposes to obliterative bronchiolitis in human lung transplants.The Journal of clinical investigation, 2007,117(11):3498-3506.

Effect study of rejection of MSC in treatment of mice OB model

SHI Qian, LI Jing,
FAN Hui-min.Department of Cardiac surgery, Shanghai East Affiliated Hospital of Tongji University/Institute of Cardiac Failure, Shanghai 200120, China

ObjectiveTo analyze the effect of immunosuppression of mesenchymal stem cell (MSC) in the treatment of mice obliterans bronchiolitis (OB).MethodsMarrow MSC of C57BL/6 mice was separated to set OB reaction model after trachea transplantation of mice.MSC was given on the day of transplantation.The mice were put to death after 30 days.HE staining was used on the transplanted trachea, and the situation of acute rejection of transplanted trachea was observed.Enzyme-linked immuno sorbent assay (ELISA) was applied to detect the content of inflammatory factors related to transplant rejection.ResultsRejection reaction in MSC transplant group was eased, compared with different system transplant group, and degree of lumen obstruction in transplanted trachea was also eased, compared with allografts transplant control group without rejection.ELISA test for transplanted trachea showed that inflammatory factor IFN-g decreased in MSC transplant group, while anti-inflammatory factor interleukin-10 (IL-10) increased.ConclusionMSC can ease the OB reaction after trachea transplantation, adjust immune state and inhibit inflammation.

Mesenchymal stem cell; Obliterans bronchiolitis; Interleukin-10

2014-07-23］

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(項(xiàng)目編號(hào)：81200062, 31200678)；上海市衛(wèi)生局青年科研項(xiàng)目(項(xiàng)目編號(hào)：20114Y148)

200120 同濟(jì)大學(xué)附屬上海市東方醫(yī)院心外科, 心力衰竭研究所

范慧敏