CRISPR/Cas9 系統(tǒng)：構(gòu)建非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物疾病模型的新技術(shù)

楊偉莉，涂著池，李曉江

(中國(guó)科學(xué)院遺傳與發(fā)育學(xué)生物學(xué)研究所，北京 100101)

綜述與專論

CRISPR/Cas9 系統(tǒng)：構(gòu)建非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物疾病模型的新技術(shù)

楊偉莉，涂著池，李曉江

(中國(guó)科學(xué)院遺傳與發(fā)育學(xué)生物學(xué)研究所，北京 100101)

動(dòng)物疾病模型在研究人類疾病致病機(jī)理和藥物篩選中起到了關(guān)鍵作用。非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物由于與人類更為接近，在探究人類神經(jīng)退行性疾病、神經(jīng)精神疾病及人類認(rèn)知功能、神經(jīng)環(huán)路等方面具有巨大的優(yōu)勢(shì)可成為研究和藥物篩選的重要疾病模型。然而，由于缺乏大動(dòng)物的胚胎干細(xì)胞系，傳統(tǒng)的基因打靶技術(shù)難于用來建立靈長(zhǎng)類動(dòng)物疾病模型。最近發(fā)展的基因編輯新技術(shù)CRISPR/Cas9系統(tǒng)在定向?qū)蜻M(jìn)行修飾上展現(xiàn)出了巨大的潛力。本文將介紹CRISPR/Cas9技術(shù)的發(fā)展和應(yīng)用，以及非靈長(zhǎng)類動(dòng)物作為神經(jīng)退行性疾病模型的優(yōu)勢(shì)和意義。

CRISPR/Cas9系統(tǒng)；非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物；神經(jīng)退行性疾病

神經(jīng)退行性疾病是由神經(jīng)元或其髓鞘的喪失所致，隨著年齡老化而惡化，導(dǎo)致功能障礙，如肌肉萎縮性側(cè)索硬化癥、額顳葉癡呆、老年性癡呆阿爾茨海默癥、亨廷頓舞蹈癥、帕金森癥等。隨著人類生活水平的提高與壽命的延長(zhǎng)，老年人比例不斷增加，神經(jīng)退行性疾病逐漸增多，也越來越受到社會(huì)的關(guān)注。然而，該類疾病大多發(fā)病機(jī)制尚不明確，無有效的治療措施。因此，要篩選和檢測(cè)出有效的藥物和治療方法，成功建立出能夠模擬出人類神經(jīng)退行性疾病癥狀的有效動(dòng)物模型成為關(guān)鍵。非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物和人類在遺傳學(xué)基礎(chǔ)上和生理病理上高度相似，被公認(rèn)為是理想的疾病研究動(dòng)物模型?；蚪M編輯技術(shù)在疾病模型建立過程中發(fā)揮了重要作用，尤其是最新發(fā)現(xiàn)的CRISPER/cas9技術(shù)因簡(jiǎn)單、方便且能夠精確的對(duì)基因進(jìn)行修飾，使得用CRISPER/cas9技術(shù)建立基因修飾猴來模擬人類重大疾病成為可能。

1 CRISPR/Cas9系統(tǒng)

建立動(dòng)物模型的基因編輯方法主要有轉(zhuǎn)基因和基因打靶。轉(zhuǎn)基因即用人工方法將外源基因?qū)牖蛘系交蚪M內(nèi)，并能夠穩(wěn)定傳給下一代。動(dòng)物轉(zhuǎn)基因技術(shù)的操作方法主要有顯微注射法，胚胎干細(xì)胞法和逆轉(zhuǎn)錄病毒感染法等。轉(zhuǎn)基因技術(shù)的發(fā)展在生物醫(yī)學(xué)研究及農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中發(fā)揮了相當(dāng)重要的作用。而基因打靶技術(shù)是指通過內(nèi)源性DNA定點(diǎn)重組，改變基因組中的某一特定基因從而在生物活體內(nèi)研究該基因的功能，包括基因敲除和敲入[1]。傳統(tǒng)的基因打靶技術(shù)依賴于胚胎干細(xì)胞系，首先在胚胎干細(xì)胞系中進(jìn)行基因打靶，然后移植打靶后的胚胎干細(xì)胞入動(dòng)物母體，讓其發(fā)育成帶有突變基因的動(dòng)物。由于缺乏大動(dòng)物的胚胎干細(xì)胞系，此傳統(tǒng)的基因打靶技術(shù)難于用來建立靈長(zhǎng)類動(dòng)物疾病模型。最近發(fā)展的定向基因組編輯方法CRISPR/Cas9技術(shù)能在胚胎細(xì)胞中直接打靶，已廣泛用于不同種屬中來進(jìn)行基因組改造和基因修飾。

CRISPR/Cas9是一種來源于細(xì)菌獲得性免疫的由RNA指導(dǎo)Cas蛋白對(duì)基因進(jìn)行編輯和修飾的新技術(shù)。早在1987年，日本大阪大學(xué)(Osaka University)在對(duì)一種細(xì)菌編碼的堿性磷酸酶(alkaline phosphatase)基因進(jìn)行研究時(shí)，發(fā)現(xiàn)該基因編碼區(qū)域附近存在一小段不同尋常的DNA片段，這些片段由簡(jiǎn)單的重復(fù)序列組成，而且在片段的兩端還存在一段不太長(zhǎng)的特有序列，并在2002年正式命名為CRISPR序列[2]。CRISPR，或稱為規(guī)律成簇間隔短回文重復(fù)(clustered regularly interspaced short palindromic repeats)是一個(gè)特殊的DNA重復(fù)序列家族，廣泛分布于細(xì)菌和古菌基因組中的重復(fù)結(jié)構(gòu)[2, 3]。CRISPR 位點(diǎn)通常由高度保守的短重復(fù)序列(repeats)組成, 重復(fù)序列之間被間隔序列(spacer)隔開。在CRISPR位點(diǎn)附近，存在一系列CRISPR相關(guān)(CRISPR-associated, Cas)基因，如圖1[29]。研究表明，CRISPR與一系列相關(guān)蛋白、前導(dǎo)序列一起構(gòu)成一套保守且完整的系統(tǒng)，為原核生物提供對(duì)抗噬菌體等外源基因的獲得性免疫能力[4]。

圖1 CRISPR位點(diǎn)結(jié)構(gòu)[29]Fig.1 The struscture of CRISPR System[29]

圖2 CRISPR/Cas9 系統(tǒng)的模式圖[7]Fig.2 Schematic of CRISPR/Cas9 mediated DNA double-strand break[7]

CRISPR/Cas9作為細(xì)菌和古細(xì)菌在長(zhǎng)期演化過程中形成的一種適應(yīng)性免疫防御，可用來對(duì)抗入侵的病毒及外源DNA。即：當(dāng)噬菌體入侵細(xì)菌時(shí)，Cas蛋白復(fù)合物靶向并裂解噬菌體基因組中短的原型間隔序列(proto-spacer)，該序列是與CRISPR 間隔序列同源的噬菌體基因序列，然后這些原型間隔序列整合到CRISPR 位點(diǎn)的5′端[5]，隨后這些間隔序列被轉(zhuǎn)錄成crRNAs(CRISPR RNAs)，當(dāng)噬菌體再次被噬菌體感染時(shí), crRNAs作為模板靶向噬菌體的原型間隔序列并利用cas蛋白進(jìn)行切割，從而對(duì)抗外源基因的入侵[6]。Jinek等對(duì)CRISPR/ Cas9系統(tǒng)進(jìn)行改造,將crRNA和tracrRNA2個(gè)序列通過一個(gè)四堿基的連接環(huán)連接起來,構(gòu)成一個(gè)新的向?qū)NA,相對(duì)于野生型的CRISPR/ Cas9系統(tǒng)(如圖2)[7]，這種新型的系統(tǒng)更加容易構(gòu)建并具有相同的打靶效率[7]。Cas9內(nèi)切酶在向?qū)NA分子的引導(dǎo)下對(duì)特定位點(diǎn)的DNA進(jìn)行切割，形成雙鏈DNA缺口，然后細(xì)胞會(huì)借助同源重組機(jī)制或者非同源末端連接機(jī)制對(duì)斷裂的DNA進(jìn)行修復(fù)。若細(xì)胞通過同源重組機(jī)制進(jìn)行修復(fù)，會(huì)用另外一段DNA片段填補(bǔ)斷裂的DNA缺口，因而會(huì)引入一段“新的”遺傳信息。最近多項(xiàng)研究都表明，RNA介導(dǎo)的Cas9系統(tǒng)能夠成功介導(dǎo)細(xì)菌、小鼠細(xì)胞、斑馬魚胚胎、人類細(xì)胞、植物細(xì)胞、非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物食蟹猴胚胎等的基因組編輯[7-13](圖3)[7-13,17]。Rudolf Jaenisch等利用該技術(shù)成功構(gòu)建了同時(shí)攜帶多個(gè)基因突變的小鼠[14]。中科院李勁松研究組設(shè)計(jì)出一種引導(dǎo)Cas9結(jié)合到一個(gè)發(fā)生單堿基突變的等位基因上的向?qū)NA，在這種等位基因上，Cas9能夠切割發(fā)生突變的DNA序列。他們將野生型等位基因或寡核苷酸注射到發(fā)生單堿基突變的小鼠受精卵中，能夠校正發(fā)生突變的等位基因，得到了無白內(nèi)障小鼠[15]，這是首次在完整動(dòng)物中利用 CRISPR系統(tǒng)糾正致病的突變基因從而治療疾病。與此同時(shí)，Hans Clevers研究組通過CRISPR/Cas9以及一個(gè)包含插入修補(bǔ)序列的供體質(zhì)粒在人類干細(xì)胞中糾正了與囊性纖維化有關(guān)的缺陷，成功培育出了功能正常的微型腸[16]。他們的研究為未來該技術(shù)用于人類遺傳缺陷疾病的治療提供了希望。

圖3 RNA介導(dǎo)的Cas9系統(tǒng)定向[17]基因組修飾作用機(jī)制示意[17]Fig.3 Targeted genome editing with RNA-guided Cas9[17]

圖4 PAM序列在人類基因組中出現(xiàn)頻率統(tǒng)計(jì)[8]Fig.4 The frequency statistics of PAM in the human genome sequence[8]

CRISPR/Cas9作為一種新的基因打靶技術(shù)，在構(gòu)建和使用時(shí)簡(jiǎn)單、方便，只需要靶序列的3′端含有PAM區(qū)即NGG，而在人類基因組中每8 bp就會(huì)出現(xiàn)一個(gè)PAM區(qū)[8]，如圖4。利用該技術(shù)能夠?qū)崿F(xiàn)多基因敲除、敲入或特異性干擾調(diào)控，為研究基因的功能、互作及調(diào)控網(wǎng)絡(luò)機(jī)制提供了便利，而其高效的打靶效率也為改變與特定疾病相關(guān)的基因從而為修復(fù)人類缺陷基因、建立人類重大疾病模型、小分子藥物的靶向治療和定點(diǎn)修復(fù)、動(dòng)植物育種等提供新的途徑。

2 非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物疾病模型的優(yōu)勢(shì)

目前，人類遺傳疾病模型的研究主要集中在果蠅、線蟲、斑馬魚、小鼠、大鼠等小動(dòng)物模型上，這些小動(dòng)物在研究神經(jīng)退行性疾病發(fā)病機(jī)理上發(fā)揮了重要的作用[18, 19]。但是這些小動(dòng)物模型并不能完全模擬人類疾病的病理變化和癥狀，如多數(shù)轉(zhuǎn)基因小鼠的神經(jīng)退行性疾病(AD、 PD和HD)模型并不出現(xiàn)明顯的神經(jīng)元細(xì)胞死亡[20-22]。此外，這些小動(dòng)物壽命較短(如小鼠最多生存2～3年)，細(xì)胞器官發(fā)育，衰老過程及壽命具有種屬差異性，如表1。尤其在對(duì)自閉癥、精神分裂癥及老年癡呆等神經(jīng)系統(tǒng)疾病的研究中，難于用小鼠模型來檢查靈長(zhǎng)類動(dòng)物所具備的復(fù)雜的認(rèn)知能力和社交能力。而且，很多治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病的藥物在小鼠模型上發(fā)揮作用卻在人類臨床試驗(yàn)中失敗[23]。目前，用小鼠及其它小動(dòng)物模型尚未找到有效治療神經(jīng)退行性疾病的方法及藥物。因此，種屬差異可能對(duì)神經(jīng)退行性疾病病理變化影響甚大。

而非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物(如獼猴、食蟹猴等)在生物學(xué)上與人類高度相似。2011年，我國(guó)科學(xué)家完成了食蟹猴和恒河猴基因組的比較分析[24]。獼猴與人類基因組同源性高達(dá)93%[25]，且獼猴大腦在解剖學(xué)上與人類有著極高的相似性，提示我們用靈長(zhǎng)類動(dòng)物建立疾病模型的重要性。早在2000年，研究人員將攜帶有綠色熒光蛋白GFP編碼基因的病毒載體送入猴卵細(xì)胞里，得到了世界上第一只人工遺傳改造的猴——ANDi[26]，證實(shí)了建立轉(zhuǎn)基因靈長(zhǎng)類動(dòng)物模型的可能性。隨后，Yang等利用類似病毒載體注射受精卵的方法在2008年建立了攜帶有人突變亨廷頓基因的轉(zhuǎn)基因猴模型，該人工修飾的轉(zhuǎn)基因猴模型能夠模擬出HD患者的多種主要臨床癥狀，如舞蹈病、抽搐及肌張力障礙，從而證明了首例人類疾病的靈長(zhǎng)類動(dòng)物模型的建立。此外，轉(zhuǎn)基因小猴中出生不久就表現(xiàn)出比小鼠模型更嚴(yán)重的癥狀和早期死亡[27]。這些轉(zhuǎn)基因猴疾病模型的成功建立都表明了非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物在研究人類遺傳性疾病的發(fā)病機(jī)理上具有重要的醫(yī)學(xué)價(jià)值。

但是依賴于病毒方法對(duì)靈長(zhǎng)類動(dòng)物進(jìn)行遺傳學(xué)修飾也有一定的局限性，即被轉(zhuǎn)入基因的隨機(jī)插入使得突變位點(diǎn)無法預(yù)知，突變數(shù)量無法控制，從而限制了動(dòng)物模型的建立。而CRISPR/Cas9系統(tǒng)作為最新的基因定向編輯技術(shù)在建立大動(dòng)物模型上具有巨大的潛力，且該技術(shù)無需胚胎干細(xì)胞，將不再局限于有限種類的模式生物。最近，Niu等研究人員利用顯微注射方法將CRISPR/Cas9系統(tǒng)中的RNA注射到猴單細(xì)胞胚胎中，證明該系統(tǒng)對(duì)食蟹猴基因組也能進(jìn)行基因修飾[12]。于此同時(shí)，世界上的其他科學(xué)家也正利用該技術(shù)開展靈長(zhǎng)類動(dòng)物疾病模型建立的工作[28]。雖然目前用靈長(zhǎng)類動(dòng)物研究CRISPR/Cas9的基因修飾功能還僅限于基因組DNA突變的檢測(cè),可以預(yù)測(cè)CRISPR/Cas9的基因修飾功能將使靈長(zhǎng)類動(dòng)物成為我們研究重大神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)病機(jī)制及疾病的早期干預(yù)和藥物篩選的重要?jiǎng)游锬Ｐ汀?/p>

世界上共有約400余種靈長(zhǎng)類動(dòng)物，應(yīng)用于生命醫(yī)學(xué)研究最常用的的靈長(zhǎng)類動(dòng)物是獼猴和食蟹猴。美國(guó)等發(fā)達(dá)國(guó)家由于宗教、倫理、經(jīng)濟(jì)等因素，使得靈長(zhǎng)類的研究遇到了困難。而中國(guó)是靈長(zhǎng)類動(dòng)物資源豐富的國(guó)家之一，對(duì)靈長(zhǎng)類動(dòng)物的研究方面則存在許多優(yōu)勢(shì)。

目前，利用靈長(zhǎng)類動(dòng)物建立基因修飾動(dòng)物模型仍然面臨巨大挑戰(zhàn)。首先，陽性胚胎打靶率和移植的成功率有待于提高，尤其是考慮到靈長(zhǎng)類動(dòng)物生殖周期與繁殖期長(zhǎng)，動(dòng)物費(fèi)用高等因素。其次，目前所報(bào)道的基因修飾猴存在嵌合多態(tài)性和非單點(diǎn)基因突變的不足之處, 是否動(dòng)物身體所有細(xì)胞都具同樣的基因修飾仍待證實(shí)[12]。因此, 優(yōu)化陽性胚胎打靶率和移植的成功率是建立靈長(zhǎng)類動(dòng)物模型的關(guān)鍵。

表1 動(dòng)物種屬間的重要生物特性差別Tab.1 Biological characteristics of differences between animal species

3 展望

基因編輯新技術(shù)CRISPR/Cas9系統(tǒng)的飛速發(fā)展使得動(dòng)物疾病模型的建立不再局限于少數(shù)的模式生物，使得在所有物種中實(shí)現(xiàn)基因組編輯成為可能。該技術(shù)使用方便、簡(jiǎn)單且打靶效率較高，但同時(shí)也存在潛在脫靶效應(yīng)、在胚胎不同階段的多次打靶使得基因編輯具有嵌合多態(tài)性等缺陷性。在未來的研究中，如何改進(jìn)該技術(shù)的脫靶效應(yīng)和基因打靶的時(shí)空效應(yīng)以避免突變多態(tài)性將是關(guān)鍵問題。由于靈長(zhǎng)類動(dòng)物在神經(jīng)系統(tǒng)、代謝系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)上與人類具有高度的相似性，而且我國(guó)靈長(zhǎng)類動(dòng)物資源豐富, 利用先進(jìn)的基因編輯技術(shù)CRISPR/Cas9系統(tǒng)構(gòu)建人類重大神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病的靈長(zhǎng)類動(dòng)物模型將是未來生物醫(yī)學(xué)研究發(fā)展的趨勢(shì)，同時(shí)也是我國(guó)生命科學(xué)研究的優(yōu)勢(shì)和發(fā)展機(jī)遇。

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CRISPR/Cas9 system: a new gene modification tool for establishing disease models in non-human primates

YANG Wei-li, TU Zhu-chi, LI Xiao-jiang

(State Key Laboratory of Molecular Developmental Biology, Institute of Genetics and Developmental Biology,Chinese Academy of Sciences, Beijing 100101, China)

Animal models are highly valuable systems that have been extensively used to elucidate human disease pathogenesis and to find therapeutic ways to treat human diseases. Since non-human primates are close to humans,monkeys are important model species in exploring the mechanisms and treatment of human neurodegenerative diseases, neuropsychiatric disorders, cognitive function, and neural circuits. However, due to the lack of embryonic stem cell lines in large animals, the traditional gene targeting technology is difficult to establish primate animal models of human diseases. CRISPR/Cas9, as a recently developed tool for genome modifications, has been successfully used to target genomic loci in mouse, rat, monkey, and other species. Here, we discuss the utilization of CRISPR/Cas9 technology in establishing monkey models for studying human neurodegenerative diseases.

CRISPR/Cas9 system; Non-human primates; Neurodegenerative diseases.

科技部國(guó)家重大科學(xué)研究計(jì)劃項(xiàng)目(課題編號(hào)：2012CBA01304)和分子發(fā)育生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室經(jīng)費(fèi)資助。

楊偉莉(1987-)，研究生，主要研究方向：神經(jīng)退行性疾病，E-mail: weiliyang@genetics.ac.cn。

李曉江(1957-)，研究員，主要研究方向：神經(jīng)退行性疾病，E-mail: xjli@genetics.ac.cn

R33

A

1671-7856(2014) 08-0070-05

10.3969.j.issn.1671.7856. 2014.008.016

2014-06-23