原木靈芝破壁孢子粉對小鼠免疫功能的影響*

吳學(xué)謙，吳學(xué)良，樓利明，趙中山，陳如楚，徐 娟，李青青，許海順，黨亞麗

(1.浙江五養(yǎng)堂藥業(yè)有限公司，麗水市食用菌研究開發(fā)中心，浙江 麗水 323000；2.浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院，浙江 杭州 310013)

原木靈芝破壁孢子粉對小鼠免疫功能的影響*

吳學(xué)謙1,2，吳學(xué)良1，樓利明1，趙中山1，陳如楚1，徐 娟2，李青青2，許海順2，黨亞麗2

(1.浙江五養(yǎng)堂藥業(yè)有限公司，麗水市食用菌研究開發(fā)中心，浙江 麗水 323000；2.浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院，浙江 杭州 310013)

通過設(shè)3個濃度的原木靈芝破壁孢子粉藥物組和陰性對照組，分別進(jìn)行ConA誘導(dǎo)的小鼠脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗，綿羊紅細(xì)胞誘導(dǎo)小鼠DTH試驗，小鼠血清溶血素測定，抗體生成細(xì)胞檢測，小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞試驗，小鼠碳廓清試驗，NK細(xì)胞活性測定試驗和臟器指數(shù)測定。結(jié)果表明，與陰性對照組比較，低、中、高3個劑量原木靈芝破壁孢子粉均能提高小鼠脾淋巴細(xì)胞的增殖能力，差異均有顯著性；高劑量組能提高小鼠左后足跖部24 h與0 h厚度差，差異有顯著性；中劑量、高劑量組均能提高小鼠溶血空斑數(shù)，差異有顯著性。說明原木靈芝破壁孢子粉具有較強(qiáng)的免疫調(diào)節(jié)作用。

原木靈芝破壁孢子粉；免疫力；靈芝多糖；靈芝三萜

靈芝為多孔菌科真菌赤芝(Ganoclermalucidum)的干燥子實體(2010年版《中華人民共和國藥典》)，性溫味淡、養(yǎng)心安神、補(bǔ)氣益血，是我國傳統(tǒng)的扶正固本、滋補(bǔ)強(qiáng)壯的名貴中藥，具有極高的醫(yī)療保健和營養(yǎng)價值[1]。

原木靈芝是選用優(yōu)質(zhì)適生闊葉樹原木為栽培材料，接種優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)靈芝菌種，采用仿野生靈芝生長的原生態(tài)環(huán)境進(jìn)行仿生栽培，根據(jù)孢子粉的生長時間與彈射時間分3期～4期采集孢子粉。目前，麗水原木靈芝被確定為“麗九味”浙江麗水地道藥材，麗水下轄龍泉栽培的靈芝和靈芝孢子粉均獲得了國家地理標(biāo)志保護(hù)產(chǎn)品，正在被許多廠家選用為增強(qiáng)免疫力保健食品的主要原料。之前作者曾研究了“靈芝多糖提取物對小鼠免疫功能的影響”[2]，尚不清楚經(jīng)破壁的原木靈芝孢子粉對小鼠免疫調(diào)節(jié)功能的影響情況，不經(jīng)提取有效成分而直接選用原木靈芝破壁孢子粉作為增強(qiáng)免疫力的保健食品原料是否可行。

靈芝孢子粉富含靈芝多糖、靈芝三萜、蛋白質(zhì)、酶類、硒元素等特殊成分，據(jù)報道具有增強(qiáng)免疫力、保護(hù)肝損傷、抑制腫瘤細(xì)胞生長等藥效[3-5]。但由于靈芝孢子具有雙層細(xì)胞壁，其組成為既不溶于水也不溶于酸的幾丁質(zhì)，大大降低其生物利用度，因此靈芝孢子粉作為保健食品原料需進(jìn)行破壁處理。破壁后靈芝孢子粉吸收更迅速、完全，功效更明顯[6]。目前大部分靈芝孢子粉采用振動式破壁設(shè)備進(jìn)行破壁，破壁過程容易產(chǎn)生高溫環(huán)境使孢子粉的活性物質(zhì)氧化褐變，導(dǎo)致孢子粉顏色變深，同時造成了重金屬鉻鎳殘留。本研究選用可防氧化、焦化和重金屬污染的水冷降溫超微技術(shù)破壁加工的麗水原木破壁靈芝孢子粉為試驗材料，研究原木靈芝破壁孢子粉對小鼠免疫調(diào)節(jié)功能的影響，以期為開發(fā)增強(qiáng)免疫力功能保健食品提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 原木靈芝破壁孢子粉

原木靈芝破壁孢子粉由浙江五養(yǎng)堂藥業(yè)有限公司提供，水冷降溫超微技術(shù)破壁加工，破壁率99%，淡棕色，無焦化顆粒，入口無顆粒感，粉末裝。試驗前將樣品以蒸餾水為溶媒配置成各劑量，混勻供試。

1.1.2 實驗動物

實驗用ICR小鼠，由上海西普爾-必凱實驗動物有限責(zé)任公司提供，實驗動物生產(chǎn)許可證號：SCXK(滬)2008-0016，清潔級，雌性，體重(20±2) g。飼料由浙江省實驗動物中心提供，執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)GBL4924 2001。檢測環(huán)境條件，溫度20℃～24℃，相對濕度40%～70%。試驗動物適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后按體重隨機(jī)分成4組，每組10只，各組平均體重基本相同。

1.1.3 試劑

Hank's液：美國Hy Clone公司；RPMI-1640培養(yǎng)基：Pharmacia公司；刀豆蛋白A(ConA)：美國Sigma公司；四甲基偶氮唑鹽(MTT)：美國Sigma公司；印度墨汁：Winsaw &Newton 公司。

1.1.4 儀器

超凈工作臺：蘇州凈化設(shè)備工程有限公司；恒溫CO2培養(yǎng)箱：美國Thermo公司；722分光光度計：上海精密科學(xué)儀器有限公司；酶標(biāo)儀：美國Thermo公司。

1.2 方法

1.2.1 灌胃劑量及方法

靈芝破壁孢子粉設(shè)低、中、高3個劑量組和1個陰性對照組。低、中、高3個劑量分別為250 mg·kg-1、500 mg·kg-1、 1 500 mg·kg-1，相當(dāng)于人推薦量的5倍、10倍和30倍(人推薦量為1.4 g·d-1～2.1 g·d-1，本試驗以1.4 g·d-1計)。灌胃給樣品，灌胃容量按0.01 mL·g-1體重計，陰性對照組給予同體積的蒸餾水。參照衛(wèi)生部《保健食品檢驗與評價技術(shù)規(guī)范》(2003年版)中的方法對小鼠進(jìn)行免疫功能的測定[7]。

1.2.2 ConA誘導(dǎo)小鼠脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(MTT法)

各組灌胃給樣品，每天1次，連續(xù)30 d。在試驗第30天，每鼠無菌取脾，置于盛有適量無菌Hank's液的小平皿中，用鑷子輕輕撕碎，制成單細(xì)胞懸液，200目篩網(wǎng)過濾，洗滌，計數(shù)，最后用RPMI-1640完全培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度為3×106個·mL-1。將細(xì)胞懸液分兩孔加入24孔培養(yǎng)板中，每孔1 mL，1孔加75 μL ConA液(相當(dāng)于7.5 μg·mL-1)，另1孔作為對照，置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h。培養(yǎng)結(jié)束前4 h，每孔輕輕吸去上清液0.7 mL，加入0.7 mL不含小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液，同時加入MTT(5 mg·mL-1)50 μL·孔-1，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。培養(yǎng)結(jié)束后，每孔加入1 mL酸性異丙醇，吹打混勻，使紫色結(jié)晶完全溶解。在570 nm波長處測定光密度值(OD)。最后用加ConA孔的光密度值減去不加ConA孔的光密度值代表淋巴細(xì)胞的增殖能力。

1.2.3 綿羊紅細(xì)胞(SRBC)誘導(dǎo)小鼠遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)(DTH)試驗(足跖增厚法)

各組灌胃給樣品，每天1次，連續(xù)30 d。在試驗第25天，每只鼠腹腔注射0.2 mL 2%(v·v-1)壓積綿羊紅細(xì)胞(SRBC)懸液，進(jìn)行免疫。免疫后4 d，測量左后足跖部厚度，然后在測量部位皮下注射20%(v·v-1)SRBC，每只鼠20 μL(約1×108個SRBC)，注射后于24 h測量左后足跖部厚度，同一部位測量3次，取平均值。

1.2.4 小鼠血清溶血素測定(血凝法)

各組灌胃給樣品，每天1次，連續(xù)30 d。在試驗第25天，每只鼠腹腔注射0.2 mL 2%(v·v-1)壓積綿羊紅細(xì)胞(SRBC)懸液，進(jìn)行免疫。5 d后，取血離心，收集血清，用生理鹽水將血清倍比稀釋，37℃溫箱孵育3 h，觀察血球凝集程度，計算抗體積數(shù)。

1.2.5 抗體生成細(xì)胞檢測(Jerne改良玻片法)

各組灌胃給樣品，每天1次，連續(xù)30 d。在試驗第25天，每只鼠腹腔注射0.2 mL 2%(v·v-1)壓積綿羊紅細(xì)胞(SRBC)懸液，進(jìn)行免疫。5 d后，每鼠無菌取脾，置于盛有適量無菌Hank's液的小平皿中，用鑷子輕輕撕碎，制成單細(xì)胞懸液，200目篩網(wǎng)過濾，洗滌，計數(shù)，最后用RPMLL640完全培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度為5×106個·mL-1。將表層培養(yǎng)基(1 g瓊脂糖加雙蒸水至100 mL)加熱溶解后，放45℃水浴保溫，與等量pH7.2～pH7.4、2倍濃度的Hank's液混合，分裝小試管，每管0.5 mL，再向管內(nèi)加50 μL 10%SRBC(v·v-1，用SA液配制)，20 μL脾細(xì)胞懸液(5×106個·mL-1)，迅速混勻，傾倒于已刷瓊脂糖薄層的玻片上，做平行片，待瓊脂凝固后，將玻片水平扣放在片架上，放入二氧化碳培養(yǎng)箱中溫育1 h～1.5 h，然后用SA緩沖液稀釋的補(bǔ)體(1∶8)加入到玻片架凹槽內(nèi)，繼續(xù)溫育1 h～1.5 h后，計數(shù)溶血空斑數(shù)。

1.2.6 小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞試驗(半體內(nèi)法)

各組灌胃給樣品，每天1次，連續(xù)30 d。動物處死前30 min，每鼠腹腔內(nèi)注射20%(v·v-1)雞紅細(xì)胞懸液1 mL，處死后再注入2 mL生理鹽水，取腹腔液滴片，38℃溫箱孵育30 min，固定，染色，鏡檢，計數(shù)100個巨噬細(xì)胞，計算吞噬率及吞噬指數(shù)。

1.2.7 小鼠碳廓清試驗法

各組灌胃給樣品，每天1次，連續(xù)30 d。在試驗第30天，每鼠尾靜脈注入用生理鹽水稀釋3倍～4倍的印度墨汁，按每10 g體重0.1 mL計算，待墨汁注入，立即計時。注入墨汁后2 min、10 min分別從內(nèi)眥靜脈叢取血20 μL，并將其加到2 mL0.1%Na2CO3溶液中，用721分光光度計在600 nm波長處測光密度值(OD)，以Na2CO3溶液作空白對照。第2次采血結(jié)束后，立即處死小鼠，取肝臟和脾臟，用濾紙吸干臟器表面血污，稱重。計算吞噬指數(shù)。

1.2.8 NK細(xì)胞活性測定(LDH測定法)

各組灌胃給樣品，每天1次，連續(xù)30 d。在試驗第30天，每鼠無菌取脾，置于盛有適量無菌Hank’s液的小平皿中，用鑷子輕輕撕碎，制成單細(xì)胞懸液，200目篩網(wǎng)過濾，洗滌，計數(shù)，最后用RPMLL640完全培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度為2×107個·mL-1。試驗前24 h將YAC-1細(xì)胞(靶細(xì)胞)傳代培養(yǎng)，應(yīng)用前用Hank’s液洗3次，用RPMIL640完全培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度為4×105個·mL-1。取靶細(xì)胞和脾細(xì)胞懸液(效應(yīng)細(xì)胞)各100 μL(效靶比50∶1)，加入U型96孔培養(yǎng)板中，靶細(xì)胞自然釋放孔加靶細(xì)胞和培養(yǎng)液各100 μL，靶細(xì)胞最大釋放孔加靶細(xì)胞和1%NP40各100 μL；上述各項均設(shè)3個復(fù)孔，于37℃、5%CO2，培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h，離心，每孔吸取上清100 μL置平底96孔培養(yǎng)板中，同時加入LDH基質(zhì)液100 μL，反應(yīng)5 min，每孔加入1 mol·L-1的HCl 30 μL在490 nm波長處測光密度(OD)值，計算NK細(xì)胞活性。

1.2.9 臟器指數(shù)測定

各組灌胃給樣品，每天1次，連續(xù)30 d。處死動物，取其胸腺及脾臟，稱重，計算胸腺體重和脾臟體重比值。

1.3 統(tǒng)計方法

2 結(jié)果與分析

2.1 靈芝破壁孢子粉對小鼠免疫器官的影響

實驗前后小鼠胸腺和脾臟指數(shù)見表1。

表1 靈芝破壁孢子粉對小鼠臟器體重比值的影響

表1 靈芝破壁孢子粉對小鼠臟器體重比值的影響

組別劑量∕(mg·kg-1)胸腺(mg)∕體重(g)脾臟(mg)∕體重(g)陰性對照組02.5±0.33.9±0.6低劑量2502.5±0.34.1±1.8中劑量5002.8±0.54.0±0.6高劑量15002.8±0.54.2±1.0F值-1.2530.148p值-0.3050.930

結(jié)果表明，靈芝破壁孢子粉低、中、高3個劑量組小鼠胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)與陰性對照組(蒸餾水)進(jìn)行比較，差異無顯著性(方差分析，p>0.05)。2.2 靈芝破壁孢子粉對小鼠細(xì)胞免疫功能的影響

靈芝破壁孢子粉對小鼠細(xì)胞免疫功能的影響，見表2。

表2 靈芝破壁孢子粉對ConA誘導(dǎo)的小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖能力及綿羊紅細(xì)胞誘導(dǎo)小鼠遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)(DTH)的影響

注：q檢驗：與陰性對照組(蒸餾水)比較，*p<0.05。下同。

由表2可知，通過比較各實驗組脾淋巴細(xì)胞ConA 刺激后的凈增值(以O(shè)D570值表示)，與陰性對照組比較，靈芝破壁孢子粉低、中、高3個劑量組均能提高ConA誘導(dǎo)的小鼠脾淋巴細(xì)胞的增殖能力，差異均有顯著性(q檢驗，p<0.05)，表明靈芝破壁孢子粉具有刺激脾淋巴細(xì)胞增值作用。

綿羊紅細(xì)胞(SRBC)誘導(dǎo)小鼠DTH(足跖增厚法)試驗表明，高劑量組能提高小鼠左后足跖部厚度差24 h與0 h厚度差值，差異有顯著性(q檢驗，p<0.05)，表明靈芝破壁孢子粉能提高綿羊紅細(xì)胞(SRBC)誘導(dǎo)小鼠足跖部腫脹程度，具有促進(jìn)遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)的作用。由此可見，靈芝破壁孢子粉可增強(qiáng)小鼠細(xì)胞免疫功能。

2.3 靈芝破壁孢子粉對小鼠體液免疫功能的影響

靈芝破壁孢子粉對小鼠體液免疫功能的影響見表3。

表3 靈芝破壁孢子粉對小鼠抗體生成細(xì)胞及血清溶血素的影響

由表3可知，低劑量組、中劑量組和高劑量組小鼠的血清溶血素抗體積數(shù)值和陰性對照組相比較，差異均無顯著性(p>0.05)。

與陰性對照組比較，中劑量組和高劑量組均能提高小鼠溶血空斑數(shù)，差異均有顯著性(q檢驗，p<0.05)，表明靈芝破壁孢子粉具有促進(jìn)抗體生成細(xì)胞增值的作用，從而有助于增強(qiáng)小鼠體液免疫功能。

2.4 靈芝破壁孢子粉對小鼠單核巨噬細(xì)胞吞噬功能的影響

靈芝破壁孢子粉對小鼠單核巨噬細(xì)胞吞噬功能的影響，見表4。

表4 靈芝破壁孢子粉對小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞及碳廓清試驗吞噬指數(shù)的影響

2.5 靈芝破壁孢子粉對小鼠NK細(xì)胞活性的影響

靈芝破壁孢子粉對小鼠NK細(xì)胞活性的影響情況及結(jié)果見表5。

表5 靈芝破壁孢子粉對小鼠NK細(xì)胞活性的影響

2.6 靈芝破壁孢子粉對小鼠體重的影響

40只小鼠均通過了試驗，未出現(xiàn)不適、異常等現(xiàn)象。與陰性對照組相比較，低劑量、中劑量、高劑量3個劑量組小鼠的體重，在各試驗的初期、中期及終期的體重變化量無統(tǒng)計學(xué)差異。

3 討論

原木靈芝破壁孢子粉給予小鼠連續(xù)灌胃30 d，能提高ConA誘導(dǎo)的小鼠脾淋巴細(xì)胞的增殖能力，促進(jìn)小鼠的遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)，表明靈芝破壁孢子粉對小鼠細(xì)胞免疫功能有促進(jìn)作用。原木靈芝破壁孢子粉中劑量組和高劑量組能提高小鼠溶血空斑數(shù)，表明靈芝破壁孢子粉具有促進(jìn)抗體生成細(xì)胞增值的作用，從而有助于增強(qiáng)小鼠體液免疫功能。本研究結(jié)果表明，原木靈芝破壁孢子粉具有增強(qiáng)免疫力的效果，可用作研發(fā)和生產(chǎn)增強(qiáng)免疫力功能的保健食品主要原料。

靈芝孢子粉氨基酸、不飽和脂肪酸(以油酸、亞油酸為主)、有益礦物元素種類豐富，營養(yǎng)價值較高，尤其是靈芝多糖和三萜類化合物含量高于靈芝子實體超微粉，可強(qiáng)化免疫系統(tǒng)機(jī)能、預(yù)防腫瘤和心血管疾病[8-12]，并且孢子粉中含有特殊的靈芝孢子油，被證實具有改善過敏性體質(zhì)、抗抑郁、強(qiáng)化肝臟功能和抗氧化等功效[13-16]，可進(jìn)一步通過保健食品功能學(xué)評價動物模型，研究從原木靈芝破壁孢子粉中提煉的靈芝孢子油有效成分，對抗酒精性肝損傷、抗氧化和改善睡眠等的影響。

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Effects of Sporoderm-brokenGanodermaSpores Cultivated by Logs on the Immune Function in Mice

WU Xue-qian1,2, WU Xue-liang1, LOU Li-ming1, ZHAO Zhong-shan1,CHEN Ru-chu1, XU Juan2, LI Qing-qing2,XU Hai-shun2, DANG Ya-li2

(1.Zhejiang Wuyangtang Pharmaceutical CO., LTD. Edible fungus Research and Development Centre in Lishui City, Lishui Zhejiang 323000; 2.Zhejiang Academy of Medical Science, Hangzhou Zhejiang 310013)

To study the immune function of sporoderm-brokenGanodermaspores cultivated by logs, three concentrations of sporoderm-brokenGanodermaspores cultivated by logs and a control group were studied by a serial experiments including ConA-induced lymphocyte transformation test, sheep red blood cells induced delayed type hypersensitivity (DTH) test, serum hemolysin and antibody producing cells determination, phagocytosis test of chicken red blood cells by peritoneal macrophages, carbon clearance and NK cells activities assay, and organ weight measurement in mice. The results showed that all dose groups were able to significantly improve the proliferation of splenic lymphocytes, that the high dose group could significantly improve left-hind feet thickness of mice, and that the medium and high dose groups could significantly improve the numbers of plague forming cells in mice compared with the control group. In conclusion, the sporoderm-brokenGanodermaspores cultivated by logs could improve the immune function in mice.

Sporoderm-brokenGanodermaspores cultivated by logs; Immune function; Mice

*項目來源：科技部創(chuàng)新基金項目“高生物活性靈芝多糖與三萜提取物”(11C26213304715)；國家948項目“食藥用菌活性多糖生物酶法與檢測技術(shù)引進(jìn)”(2008-4-64)；浙江省科技專項“生物活性物質(zhì)與中藥保健食品創(chuàng)新人才培養(yǎng)”(2011F20014)；麗水市科技項目“高品質(zhì)有機(jī)靈芝孢子粉防氧化超微破壁新技術(shù)產(chǎn)業(yè)化”(20100401)、“對酒精性肝損化有保護(hù)作用的中藥保健食品研發(fā)”(2011NZH0218)。

吳學(xué)謙(1964-)，男，研究員，主要從事食藥用真菌活性物質(zhì)與保健食品研究。E-mail: wxq655@163.com

2013-11-20

S646.9

A

1003-8310(2014)01-0051-04