枸杞多糖對(duì)2型糖尿病大鼠視網(wǎng)膜炎癥因子表達(dá)的影響

魏燕華，成差群，徐建平

(廣東省廣州市荔灣區(qū)芳村中醫(yī)醫(yī)院，廣東 廣州 510361)

糖尿病視網(wǎng)膜病變(DR)是糖尿病微血管病變的并發(fā)癥之一，是目前世界范圍內(nèi)致盲的主要原因之一。傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)稱糖尿病視網(wǎng)膜病變?yōu)橄誓坎?，枸杞?duì)消渴目病的治療功用早有記載?！侗静萃ㄐ份d：“枸杞子補(bǔ)腎益精，水旺則骨強(qiáng)，而消渴目昏，腰疼、膝痛無不愈矣”。枸杞既能降糖，又能補(bǔ)肝明目、補(bǔ)腎益精可列為首選之品。枸杞多糖(LBP)是從枸杞子中提取而得到的一種天然大分子水溶性多糖，是由醛糖或酮糖通過糖苷鍵連接在一起的多聚物，具有多種生物活性，藥理作用廣泛。王繼紅等[1]通過臨床和動(dòng)物試驗(yàn)證實(shí)了枸杞對(duì)糖尿病視網(wǎng)膜病變有治療作用[1]。炎癥因子的聚集在視網(wǎng)膜病變的發(fā)生和發(fā)展中均起著重要作用，腫瘤壞死因子-α（TNF-α）等介導(dǎo)的炎性反應(yīng)在DR的發(fā)生、發(fā)展及血管并發(fā)癥的發(fā)病中起到了媒介作用[2]。本研究中觀察了枸杞多糖對(duì)血-視網(wǎng)膜屏障炎癥因子 TNF-α、白細(xì)胞介素-6（IL-6）及C反應(yīng)蛋白(CRP)水平的影響，探索枸杞多糖對(duì)糖尿病視網(wǎng)膜病變保護(hù)作用的機(jī)理。

1 材料與方法

1．1 儀器、試劑與動(dòng)物

酶標(biāo)儀（美國(guó)BIO-RAD公司，型號(hào)為 iMark）；血糖儀及試紙（德國(guó)羅氏公司，型號(hào)為 ACCU-CHEK Performa Nano）。鏈脲佐菌素(美國(guó) sigma公司，批號(hào)為 S0130)；LBP粉劑(寧夏啟元藥業(yè)公司，純度為58．56%，批號(hào)為 GF03002-l)，用生理鹽水配制成質(zhì)量濃度為60 g／L的溶液，4℃冰箱貯藏，使用前稀釋至所需濃度；鹽酸二甲雙胍（中美上海施貴寶制藥有限公司，批號(hào)為P20110923）；大鼠 TNF-α酶聯(lián)免疫分析試劑盒(R＆D進(jìn)口分裝，批號(hào)為201205)；大鼠IL-6酶聯(lián)免疫分析試劑盒(R＆D進(jìn)口分裝，批號(hào)為201205)；大鼠 CRP酶聯(lián)免疫分析試劑盒(R＆D進(jìn)口分裝，批號(hào)為 201205)。SD 大鼠，180 ～220 g，雌雄各半，SPF 級(jí)，廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，許可證號(hào)為SCXK(粵)2009-0004。

1．2 試驗(yàn)動(dòng)物模型制備及分組[3]

大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d，除空白對(duì)照組外，其余大鼠給予高糖高脂飼料(在標(biāo)準(zhǔn)全價(jià)混合飼料的基礎(chǔ)上添加蔗糖、煉豬油和蛋黃，比例分別為10%蔗糖、10%豬油、5%蛋黃)，喂養(yǎng)5周后，腹腔注射 STZ(新鮮配制，溶于0．1 mmol／L檸檬酸鈉緩沖液中，pH為4．5）25 mg ／kg，每日 1 次，連續(xù) 2 d?？瞻讓?duì)照組普通飼料喂養(yǎng)5周，再腹腔注射等量檸檬酸緩沖液，每日1次，連續(xù)2 d。注射藥物2 d后間隔 1 d，測(cè)大鼠空腹血糖(測(cè)試前禁食12 h)，以血糖含量16．7 mmol／L為大鼠2型糖尿病模型造模成功的判定標(biāo)準(zhǔn)。將2型糖尿病模型大鼠隨機(jī)分為5組，各10只，即2型糖尿病模型組，枸杞多糖高、中、低劑量組[劑量分別為 0．6，0．3，0．15 g ／（kg·d）]，鹽酸二甲雙胍組[0．25 g ／（kg·d）]。于模型復(fù)制成功的第2天起，各組大鼠按上述劑量灌胃給藥，空白對(duì)照組給予等量生理鹽水，連續(xù)給藥2周。

1．3 樣本取材與檢測(cè)

藥物治療2周后，大鼠禁食12 h，腹腔注射10%水合氯醛麻醉，迅速摘取眼球，于手術(shù)顯微鏡下沿矢狀切面剖開眼球，棄去眼內(nèi)容物(房水、玻璃體及晶狀體)，用無齒顯微鑷細(xì)心地取出視網(wǎng)膜組織，生理鹽水漂洗2次，再用吸水紙吸干水分，用精密天平稱重后，以pH為7．2的預(yù)冷磷酸鹽緩沖液冰浴下制成10%組織勻漿。將組織勻漿液置4℃離心機(jī)中，以5 000 r／min的速率離心5 min，取上清。TNF-α，IL-6，CRP濃度均按試劑盒說明書測(cè)定。

1．4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 11．5統(tǒng)計(jì)軟件，所有數(shù)據(jù)以±s表示，多組比較采用單因素方差分析，P＜0．05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

結(jié)果見表1。

表1 枸杞多糖對(duì)2型糖尿病模型大鼠視網(wǎng)膜TNF- ，IL-6，CRP濃度的影響(±s，n＝10)

表1 枸杞多糖對(duì)2型糖尿病模型大鼠視網(wǎng)膜TNF- ，IL-6，CRP濃度的影響(±s，n＝10)

注：與 2 型糖尿病模型組比較， P ＜0．05， P ＜0．01；與正常對(duì)照組比較， P ＜0．01。

組別正常對(duì)照組2型糖尿病模型組鹽酸二甲雙胍組LBP高劑量組LBP中劑量組LBP低劑量組劑量（g ／kg）--0．25 0．6 0．3 0．15 TNF- (ng／L)1．27 ± 0．51 2．80 ± 0．84 1．81 ± 0．58 1．36 ± 0．80 2．18 ± 0．83 2．07 ± 0．95 IL-6(ng／L)3．76 ± 0．71 6．70 ± 1．55 4．09 ± 1．01 4．87 ± 1．47 4．82 ± 1．33 5．62 ± 1．45 CRP（mg ／L）0．89 ± 0．33 1．72 ± 0．40 0．98 ± 0．18 1．15 ± 0．36 1．12 ± 0．25 1．33 ± 0．41

3 討論

枸杞是藥食同源的植物，在秦漢時(shí)代的《神農(nóng)本草經(jīng)》中已有記載，其性甘平質(zhì)潤(rùn)，有補(bǔ)益肝腎、明目之功效。LBP為其主要成分，對(duì)多種細(xì)胞有保護(hù)作用，可抗氧化、抑制細(xì)胞凋亡[4-6]。何劍鋒等[7]的試驗(yàn)證明，枸杞對(duì)DR有治療作用[7]。但LBP對(duì)DR炎癥因子的作用機(jī)制的研究國(guó)內(nèi)外少見報(bào)道。

DR是糖尿病微血管病變的并發(fā)癥之一，是致盲的主要原因之一。長(zhǎng)期慢性高糖血癥是其發(fā)病基礎(chǔ)，并受全身新陳代謝、內(nèi)分泌及血液因素等影響。近代研究證實(shí)，自由基損傷、周細(xì)胞與視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡、炎癥因子的聚集與黏附、血液流變學(xué)異常、脂代謝障礙在視網(wǎng)膜病變的發(fā)生、發(fā)展中均起著重要作用。2型糖尿病在臨床治療的過程中，很多患者會(huì)出現(xiàn)一定情況的炎癥癥狀，其CRP，TNF-α，IL-6等往往存在異常升高的情況。常規(guī)治療對(duì)患者的炎癥因子改善并不理想，對(duì)血糖的控制情況較差[8]。亞臨床炎癥引起DR的可能機(jī)制為2型DM患者非酶糖基化終產(chǎn)物(AGES)增多，與視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞上的AGES受體或配體結(jié)合，使其炎癥因子（如TNF-α，IL-6等），刺激肝細(xì)胞產(chǎn)生CRP，并引起局部炎癥，引起血管內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙或直接損傷內(nèi)皮細(xì)胞而產(chǎn)生微血管病變。

CRP是急性時(shí)相反應(yīng)蛋白之一，是炎性反應(yīng)或組織損傷時(shí)的非特異性標(biāo)志物。研究發(fā)現(xiàn)，糖尿病患者血清CRP明顯增高，而非糖尿病者則正常，現(xiàn)普遍認(rèn)為2型糖尿病可能是炎癥因子介導(dǎo)的炎性反應(yīng)性疾病，并可能導(dǎo)致了胰島B細(xì)胞分泌胰島素功能受損及產(chǎn)生胰島素抵抗。在美國(guó)進(jìn)行的大型前瞻性研究證實(shí)，CRP是2型糖尿病發(fā)病的預(yù)測(cè)因子，可能在胰島素抵抗和2型糖尿病發(fā)病中扮演了重要角色[9]。

TNF-α可直接損傷血-視網(wǎng)膜屏障，提高視網(wǎng)膜血管通透性[10]。TNF-α是介導(dǎo)炎性反應(yīng)的重要介質(zhì)，它參與體內(nèi)的多種病理過程，也是體內(nèi)炎癥和組織損傷的敏感指標(biāo)。大量證據(jù)表明，TNF-α可能通過增加糖基化酶活性，使中性粒細(xì)胞與視網(wǎng)膜內(nèi)皮細(xì)胞黏附性增強(qiáng)[11]。TNF-α可刺激巨噬細(xì)胞及其他細(xì)胞產(chǎn)生IL-8等，增強(qiáng)視網(wǎng)膜局部炎性反應(yīng)，促進(jìn)表皮生長(zhǎng)因子(EGF)、血小板源性生長(zhǎng)因子(PDGF)等的生成和釋放并協(xié)同其增殖作用。這些促生長(zhǎng)因子可刺激血管細(xì)胞增殖，最終導(dǎo)致眼內(nèi)新生血管形成。另外，CRP，TNF-α水平增高引起胰島素抵抗也可引起視網(wǎng)膜微血管內(nèi)皮細(xì)胞的病理性增生，與亞臨床炎癥共同作用，引起 DR[12]。

IL-6與內(nèi)分泌激素、神經(jīng)遞質(zhì)及某些效應(yīng)物質(zhì)等組成重要的網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)，廣泛而精細(xì)地調(diào)節(jié)胰島B細(xì)胞的分化、生長(zhǎng)和分泌[13]。Carey等[14]對(duì)小鼠的研究發(fā)現(xiàn)，高血糖可促進(jìn)胰島細(xì)胞分泌IL-6，同時(shí)低劑量IL-6又可促進(jìn)胰島素分泌，高劑量則抑制胰島素分泌。IL-6在糖尿病血管病變中也起重要作用，有報(bào)道顯示，糖尿病并動(dòng)脈粥樣硬化患者普遍存在循環(huán)中IL-6水平增高。

本研究結(jié)果顯示，2型糖尿病大鼠的視網(wǎng)膜 CRP，TNF-α，IL-6水平均升高，表明其可能是DR發(fā)生、發(fā)展的危險(xiǎn)因素。2型糖尿病大鼠視網(wǎng)膜的CRP升高與胰島素抵抗、胰島素敏感性降低及高血糖所致的高IL-6有關(guān)，CRP參與急性反應(yīng)，引起血管內(nèi)皮功能改變和形態(tài)變化影響細(xì)胞膜的完整性，使血管內(nèi)皮的通透性改變，導(dǎo)致DR發(fā)生。而高濃度的IL-6可促進(jìn)胰島B細(xì)胞分化產(chǎn)生細(xì)胞毒作用，促使胰島B細(xì)胞凋亡；IL-6以炎性介質(zhì)的方式參與糖尿病大鼠DR的發(fā)生。另一方面，免疫系統(tǒng)激活產(chǎn)生的炎癥因子TNF-α誘導(dǎo)胰島素抵抗的發(fā)生，導(dǎo)致大鼠出現(xiàn)高血糖等變化，從而促進(jìn)2型糖尿病的發(fā)生與發(fā)展。經(jīng)過LBP治療后，不同劑量組的LBP能不同程度地降低2型糖尿病大鼠視網(wǎng)膜CRP，TNF-α，IL-6的濃度水平，其藥理作用呈一定量效關(guān)系，并以高、中劑量組效果最好。LBP具有可長(zhǎng)期使用而無毒副作用的優(yōu)點(diǎn)，故探討其生物活性及作用機(jī)制具有深遠(yuǎn)意義。

綜上所述，LBP具有下調(diào) CRP，TNF-α，IL-6的表達(dá)，穩(wěn)定視網(wǎng)膜屏障上的緊密連接，減少血-視網(wǎng)膜屏障的炎癥因子釋放的作用，從而抑制DR發(fā)生與發(fā)展。

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