結(jié)腸癌與直腸癌在癌變分子機(jī)制及信號(hào)通路方面的對(duì)比

鄧艷　柯晴

【摘要】 目的：探討結(jié)腸癌和直腸癌在癌變相關(guān)分子機(jī)制方面的異同。方法：選取本院2013年

1月-2014年12月30例結(jié)腸癌和30例直腸癌組織標(biāo)本用于基因突變檢測(cè)，分別設(shè)為結(jié)腸癌組與直腸癌組，各8例新鮮的結(jié)腸癌和直腸癌組織標(biāo)本用于信號(hào)通路檢測(cè)，比較不同標(biāo)本的蛋白表達(dá)陽(yáng)性率和信號(hào)通路。結(jié)果：兩組APC、Wnt-1和p53基因蛋白表達(dá)情況比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。直腸癌組PSM2和MLH1蛋白表達(dá)陽(yáng)性率均顯著高于結(jié)腸癌組，比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；結(jié)腸癌組MSH2和MSH6蛋白表達(dá)陽(yáng)性率均顯著高于直腸癌組，比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)腸癌組K-ras突變率顯著高于直腸癌組，比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.038）；結(jié)腸癌和直腸癌共有的信號(hào)通路為代謝通路、Wnt/β-catenin、血管平滑肌收縮通路、緊密連接通路和細(xì)胞周期通路，且這些通路相關(guān)的差異基因表達(dá)大部分；而軸突導(dǎo)向通路僅出現(xiàn)在直腸癌中，p53基因信號(hào)通路、藥物代謝-細(xì)胞色素P450通路大量出現(xiàn)于結(jié)腸癌中。結(jié)論：結(jié)腸癌和直腸癌在癌變相關(guān)分子機(jī)制方面既有共性，也有個(gè)性：共性表現(xiàn)為Wnt信號(hào)通路、變異型p53蛋白和APC蛋白在二者癌變過(guò)程中發(fā)揮重要作用；個(gè)性表現(xiàn)為結(jié)腸癌中存在大量錯(cuò)配修復(fù)基因突變蛋白表達(dá)缺失，以PSM2和MLH1為主，而直腸癌以MSH2與MSH6為主。

【關(guān)鍵詞】 結(jié)腸癌； 直腸癌； 分子機(jī)制

【Abstract】 Objective：To explore the similarities and differences between colon cancer and rectal cancer in oncogenesis molecular mechanism.Method：Each 30 cases of colon cancer and rectal cancer tissue specimens in our hospital from January 2013 to December 2014 were used for gene mutation detection，each eight fresh tissue specimens of colon cancer and rectal cancer were used for signaling pathways detection.The positive rate of protein expression and the signaling pathways of different specimens were compared.Result：The differences in protein expression of APC，Wnt-1 and p53 gene between the two groups were not statistically significant（P>0.05）.The positive rates of PSM2 and MLH1 protein expression in the rectal cancer group were higher than those in the colon cancer group，the differences were statistically significant（P<0.01）.The positive rates of MSH2 and MSH6 protein expression in the colon cancer group were higher than those in the rectal cancer group，the differences were statistically significant（P<0.05）.The mutation rate of K-ras in the colon cancer group was higher than that in the rectal cancer group，the difference was statistically significant（P=0.038）.The common signal pathways of colon cancer and rectal cancer were metabolic pathway，Wnt/β-catenin，pathway of vascular smooth muscle contraction，closely connected pathway and cell cycle pathway.Most differential genes related to these pathways expressed.Axon guidance pathway appeared only in rectal cancer.Signaling pathway of p53 gene and drug metabolizing-cytochrome P450 pathway most appeared in colon cancer.Conclusion：Colon and rectal cancer have common and personal molecular mechanism.Their common manifestations show that Wnt signaling pathway，mutant p53 protein and APC protein play an important role in carcinogenesis process.Their individualitys show that presence of large mismatch repair gene mutations that cause protein loss mainly consists of PSM2 and MLH1 in colon cancer，but it mainly consists of MSH2 and MSH6 in rectal cancer.

【Key words】 Colon cancer； Rectal cancer； Molecular mechanism

First-authors address：The Second Peoples Hospital of Nanning City，Nanning 530031，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2016.05.021

結(jié)腸癌和直腸癌均為消化系統(tǒng)常見(jiàn)的腫瘤類(lèi)型，其發(fā)病率隨著人類(lèi)生活的改善而逐漸升高，其死亡率位于惡性腫瘤的第4位[1]。我國(guó)流行病學(xué)調(diào)查表明二者的發(fā)病率和病因?qū)W方面存在顯著差異，即結(jié)腸癌與人類(lèi)生活習(xí)慣、飲食結(jié)構(gòu)相關(guān)，直腸癌與地域、人種相關(guān)，故其在發(fā)生和發(fā)展中必然存在差異[2]。腫瘤的癌變機(jī)制通常為多基因改變、表達(dá)調(diào)控失調(diào)或傳導(dǎo)路徑變化造成，不同疾病癌變機(jī)制正處于研究中[3]。其中結(jié)腸癌和直腸癌癌變機(jī)制研究較為透徹，認(rèn)為由其生長(zhǎng)調(diào)控基因p53、K-ras和APC突變導(dǎo)致蛋白表達(dá)異常，進(jìn)而引起正常上皮-管狀腺瘤-絨毛狀腺瘤-重度增生-腫瘤形成的癌變過(guò)程。盡管癌變機(jī)制研究較為清楚，但這類(lèi)研究大部分針對(duì)結(jié)腸癌或捆綁二者一起研究，未區(qū)分二者，導(dǎo)致人們無(wú)法了解二者癌變過(guò)程和癌變機(jī)制的差別。本文對(duì)本院收治的患者進(jìn)行基因突變檢測(cè)和基因芯片檢測(cè)，旨在探討結(jié)腸癌和直腸癌在癌變分子機(jī)制方面的異同，為不同類(lèi)型腫瘤的早期診斷和預(yù)防以及開(kāi)展腫瘤篩查提供相應(yīng)的理論參考，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取本院2013年1月-2014年

12月收治的30例結(jié)腸癌患者和30例直腸癌患者手術(shù)后的石蠟組織標(biāo)本為基因突變檢測(cè)對(duì)象，其中直腸癌組男15例，女15例，年齡50～70歲，平均（60.1±4.8）歲；結(jié)腸癌組男17例，女13例，年齡51～73歲，平均（61.1±5.1）歲。所有患者術(shù)后分期均為Duke B期，無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。兩組患者性別、年齡等一般資料比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），具有可比性?；蛐酒瑱z測(cè)對(duì)象為直腸癌和結(jié)腸癌手術(shù)后新鮮冷凍的各8例組織樣本，兩組各含男4例，女4例，年齡50～70歲，平均（65.3±4.1）歲；結(jié)腸癌患者病變部位為升結(jié)腸，病理類(lèi)型為中高分化腺癌，腫瘤分期為Duke B型，直腸癌患者病變部位為直腸，病理類(lèi)型為中高分化腺癌，腫瘤分期為Duke B型，兩組性別、年齡等一般資料比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），具有可比性。

1.2 方法

1.2.1 HE切片觀測(cè) 在光鏡下對(duì)各個(gè)標(biāo)本的HE切片進(jìn)行觀測(cè)，其中包含1個(gè)正常的黏膜組織以及另外2個(gè)腫瘤組織。使用組織陣列儀做出9個(gè)組織芯片的蠟塊，并將其放置在溫度為4 ℃的冰箱中儲(chǔ)存。把做好的組織芯片放置在切片機(jī)上制作出5 μm的連續(xù)切片，選出組織芯片較為完整的移到56 ℃的水中展開(kāi)，并且用玻片將其撈出。之后采用免疫組織化學(xué)法進(jìn)行染色處理，過(guò)程使用S-P法，按照試劑說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。對(duì)各個(gè)指標(biāo)的陽(yáng)性以及陰性表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)：CyclinD1以及Survivin在患者體內(nèi)細(xì)胞核中定位，c-myc以及β-catenin、TCF4、PPARγ在細(xì)胞漿以及細(xì)胞核中進(jìn)行定位，Wnt-1、MMP-7以及CD44v7在細(xì)胞漿中進(jìn)行定位。依據(jù)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目以及著色的深度進(jìn)行積分，每例進(jìn)行5個(gè)高倍鏡視野范圍（×400）的隨機(jī)觀測(cè)。

1.2.2 基因突變檢測(cè) 采用免疫組化方法檢測(cè)APC、p53、Wnt-1、PSM2、MLH1、MSH2和MSH6蛋白水平[4]。具體操作方法：準(zhǔn)備組織切片-脫蠟入水-PBS浸洗-熱修復(fù)-PBS浸洗-滅活-加入牛血清-加入蛋白孵育-PBS浸洗-加入二抗工作液-PBS浸洗-DAB染色觀察陽(yáng)性結(jié)果-蘇木復(fù)染，鹽酸乙醇分化，熱水反藍(lán)，梯度乙醇脫水得中性數(shù)膠封片，觀察。顯微鏡觀察方法：隨機(jī)選取10個(gè)視野，每視野含100個(gè)細(xì)胞觀察。免疫組化陽(yáng)性信號(hào)為棕黃色顆粒，觀察染色強(qiáng)度和部位，并計(jì)數(shù)。具體染色結(jié)果判斷參照文獻(xiàn)進(jìn)行。采用RT-PCR擴(kuò)增，以獲取其基因突變情況。

1.2.3 基因芯片檢測(cè) 采用Human WG06v3.0 Expression BeadChip表達(dá)芯片進(jìn)行。試驗(yàn)流程：提取RNA-合成cDNA-純化并反轉(zhuǎn)錄-純化并檢測(cè)質(zhì)量-與雜交試劑混合-孵育-洗滌-Block-觀察信號(hào)-洗滌-干燥-獲取圖像數(shù)據(jù)。其中RNA的提取采用Trizol一步法進(jìn)行[5]。RNA的擴(kuò)增采用PCR進(jìn)行[6]。所得數(shù)據(jù)采用marray軟件可視化芯片數(shù)據(jù)，對(duì)其歸一化后進(jìn)行信號(hào)篩選[7]。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)分析軟件對(duì)研究數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以（x±s）表示，比較采用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料以率（%）表示，比較采用 字2檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組癌變基因蛋白表達(dá)情況比較 兩組APC、Wnt-1和p53基因蛋白表達(dá)情況比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。錯(cuò)配修復(fù)基因表達(dá)蛋白檢測(cè)后發(fā)現(xiàn)：直腸癌組PSM2和MLH1蛋白表達(dá)陽(yáng)性率顯著高于結(jié)腸癌組，比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；結(jié)腸癌組MSH2和MSH6蛋白表達(dá)陽(yáng)性率顯著高于直腸癌組，比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見(jiàn)表1。

2.2 兩組癌變基因比較 結(jié)腸癌組K-ras突變率高達(dá)60.0%（18/30），顯著高于直腸癌組的33.3%（10/30），比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（ 字2=4.286，P=0.038）。

2.3 結(jié)腸癌與直腸癌癌變信號(hào)通路比較 結(jié)腸癌和直腸癌共有的信號(hào)通路為代謝通路、Wnt/β-catenin、血管平滑肌收縮通路、緊密連接通路和細(xì)胞周期通路，且這些通路相關(guān)的差異基因表達(dá)大部分；而軸突導(dǎo)向通路僅出現(xiàn)在直腸癌中，p53基因信號(hào)通路、藥物代謝-細(xì)胞色素P450通路大量出現(xiàn)于結(jié)腸癌中。

3 討論

隨著人類(lèi)生活水平提高和生活質(zhì)量的改善，消化性腫瘤如結(jié)腸癌、直腸癌等惡性腫瘤發(fā)病率逐年升高。結(jié)腸癌和直腸癌已經(jīng)發(fā)展成為常見(jiàn)的惡性腫瘤，目前全球每年新增病例近60萬(wàn)例。因此，如何早期發(fā)現(xiàn)、早期診斷及采取有效治療方案降低結(jié)、直腸癌的發(fā)病率和死亡率，已成為目前研究的熱點(diǎn)之一。腫瘤分子生物學(xué)的變化在許多的臨床腫瘤中被證實(shí)是一種判斷轉(zhuǎn)移以及對(duì)預(yù)后進(jìn)行預(yù)測(cè)的指標(biāo)。研究結(jié)、直腸癌的早期的診斷方式，探索結(jié)、直腸癌轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)及預(yù)后相關(guān)的針對(duì)性指標(biāo)對(duì)結(jié)、直腸癌的輔助診斷與遠(yuǎn)期治療具有十分重要的意義。近年來(lái)大量關(guān)于結(jié)腸癌和直腸癌研究的文章得以發(fā)表，但尚無(wú)研究人員對(duì)兩者的癌變機(jī)制差異進(jìn)行研究。文獻(xiàn)[8]表明兩者在檢查和診斷之間存在差異，文獻(xiàn)[9]報(bào)道兩者的基因突變和蛋白表達(dá)方面存在差異。因此，本文采用基因突變檢測(cè)和芯片檢測(cè)，對(duì)癌變的分子機(jī)制進(jìn)行探討。

自1998年Vogelstein等提出結(jié)直腸癌癌變分子生物學(xué)機(jī)制以來(lái)，人們逐漸認(rèn)同了結(jié)腸癌癌變是由于p53/k-ras和APC等主要基因突變（染色體不穩(wěn)定）引起蛋白表達(dá)異常，導(dǎo)致腺瘤轉(zhuǎn)化為腫瘤，說(shuō)明Wnt信號(hào)途徑的異常激活是引起癌變的主要原因[10]。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，染色體不穩(wěn)定是由于錯(cuò)配修復(fù)基因突變?cè)斐尚迯?fù)功能喪失造成，即DNA復(fù)制過(guò)程中錯(cuò)配序列得不到正常修復(fù)，引起調(diào)節(jié)生長(zhǎng)繁殖的靶基因突變導(dǎo)致癌變產(chǎn)生（微衛(wèi)星不穩(wěn)定途徑）[11]。近年來(lái)發(fā)現(xiàn)這一途徑與腫瘤部位和基因改變有關(guān)，提示結(jié)腸癌和直腸癌的癌變途徑可能存在差異[12]。經(jīng)免疫組化檢測(cè)表明，兩組APC、Wnt-1和p53基因蛋白表達(dá)情況比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），說(shuō)明結(jié)直腸癌的APC、Wnt-1和p53三種基因缺失不存在差異，但信號(hào)通路激活方式是否存在差異有待于進(jìn)一步研究[13]。錯(cuò)配修復(fù)基因表達(dá)蛋白檢測(cè)后發(fā)現(xiàn)：直腸癌組PSM2和MLH1蛋白表達(dá)陽(yáng)性率顯著高于結(jié)腸癌組，比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；結(jié)腸癌組MSH2和MSH6蛋白陽(yáng)性率顯著高于直腸癌組，比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），說(shuō)明存在大量錯(cuò)配修復(fù)基因突變導(dǎo)致蛋白表達(dá)缺失，結(jié)腸癌以PSM2和MLH1為主，而直腸癌以MSH2和MSH6為主。另外，結(jié)腸癌組K-ras突變率顯著高于直腸癌組，比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（ 字2=4.286，P=0.038），進(jìn)一步驗(yàn)證了上述結(jié)果。

在上述研究的基礎(chǔ)上接著 基因芯片對(duì)癌變的信號(hào)通路進(jìn)行了研究，進(jìn)而篩選出差異基因相關(guān)的信號(hào)通路。研究發(fā)現(xiàn)，結(jié)腸癌和直腸癌共有的信號(hào)通路為代謝通路、Wnt/β-catenin、血管平滑肌收縮通路、緊密連接通路和細(xì)胞周期通路，且這些通路相關(guān)的差異基因表達(dá)大部分；而軸突導(dǎo)向通路僅出現(xiàn)在直腸癌中，p53基因信號(hào)通路、藥物代謝-細(xì)胞色素P450通路大量出現(xiàn)于結(jié)腸癌中，說(shuō)明兩者癌變具有共同的和各自的信號(hào)通路。另外上述部分差異基因的相關(guān)通路已經(jīng)得以證實(shí)，另一部分尚未證實(shí)的通路有待于進(jìn)一步研究明確其機(jī)制[14]。

綜上所述，結(jié)腸癌和直腸癌在癌變相關(guān)分子機(jī)制方面既有共性，也有個(gè)性[15]。共性表現(xiàn)為Wnt信號(hào)通路、變異型p53蛋白和APC蛋白在兩者癌變過(guò)程中發(fā)揮重要作用；個(gè)性變現(xiàn)為結(jié)腸癌中以PSM2和MLH1為主存在大量錯(cuò)配修復(fù)基因突變，而直腸癌以MSH2和MSH6為主。另外，軸突導(dǎo)向通路僅出現(xiàn)在直腸癌中，p53基因信號(hào)通路、藥物代謝-細(xì)胞色素P450通路大量出現(xiàn)于結(jié)腸癌中。

參考文獻(xiàn)

[1]饒貴安，黃超，倪眺.影響結(jié)直腸癌術(shù)后患者預(yù)后多因素分析[J].中國(guó)醫(yī)學(xué)創(chuàng)新，2013，10（31）：20-21.

[2]陸海，孫玨，許建華，等.人結(jié)腸癌奧沙利鉑耐藥細(xì)胞HCT116/L-OHP的建立及其耐藥機(jī)制初探[J].腫瘤，2011，31（8）：675-681.

[3]袁碧英，易斌，魯開(kāi)智.Caveolin-1在腫瘤中的作用機(jī)制的研究進(jìn)展[J].中國(guó)醫(yī)學(xué)創(chuàng)新，2014，11（6）：129-131.

[4]葛軍娜，于健春，康維明，等.結(jié)直腸癌腫瘤相關(guān)性貧血相關(guān)因素綜合分析[J].中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院學(xué)報(bào)，2011，33（5）：549-554.

[5] Saleh M，Trinchieri G.Innate immune mechanisms of colitis and colitis-associated colorectal cancer[J].Nature Reviews Immunology，2011，11（1）：9-20.

[6]孫培龍，李冰，劉保池.艾滋病合并遺傳性非息肉病性結(jié)直腸癌綜合征一例[J].中華臨床醫(yī)師雜志（電子版），2011，5（1）：214-215.

[7] Bastide N M，Pierre F H F，Corpet D E.Heme iron from meat and risk of colorectal cancer： a meta-analysis and a review of the mechanisms involved[J].Cancer Prevention Research，2011，4（2）：177-184.

[8]蔣偉國(guó)，黃尤光.結(jié)直腸癌發(fā)生的分子病理學(xué)基礎(chǔ)[J].國(guó)際腫瘤學(xué)雜志，2014，41（5）：353-357.

[9] Liu Z，Brooks R S，Ciappio E D，et al.Diet-induced obesity elevates colonic TNF-α in mice and is accompanied by an activation of Wnt signaling： a mechanism for obesity-associated colorectal cancer[J].The Journal of Nutritional Biochemistry，2012，23（10）：1207-1213.

[10]趙莉.結(jié)腸癌和直腸癌臨床特點(diǎn)及癌變相關(guān)分子機(jī)制的異同分析[D].北京：北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院，2010.

[11]聶文靜，劉超，李東風(fēng)，等.RASGRF1在結(jié)直腸癌組織中高表達(dá)對(duì)腫瘤轉(zhuǎn)移和不良預(yù)后的影響[J].中山大學(xué)學(xué)報(bào)（醫(yī)學(xué)科學(xué)版），2015，36（2）：195-201.

[12]楊常順，李偉華，蔡少鑫，等.K-ras、鼠類(lèi)肉瘤濾過(guò)性毒菌致癌同源體B1基因在結(jié)直腸癌組織中突變特征及其臨床意義[J].中華實(shí)驗(yàn)外科雜志，2015，32（4）：701-704.

[13]裴笑月，胡波，孫靜陽(yáng)，等.突變型p53和Pgp在結(jié)直腸癌中表達(dá)的意義[J].診斷病理學(xué)雜志，2015，22（4）：233-236.

[14]殷敏智，吳湘如，馬靖，等.小兒腸神經(jīng)元性發(fā)育異常癥并發(fā)結(jié)腸癌的臨床病理觀察及文獻(xiàn)復(fù)習(xí)[J].中華小兒外科雜志，2015，36（1）：40-43.

[15]衛(wèi)星，宋衛(wèi)東.mTOR通路中PTEN基因?qū)Y(jié)直腸癌發(fā)病的影響研究[J].中外醫(yī)學(xué)研究，2015，13（4）：1-3.

（收稿日期：2015-05-25） （本文編輯：王利）